Name: Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Immunfluoreszenz DNA-Schäden durch PM2,5 in Zebrafisch-Embryoherzen nachweist. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinanalysen für Toxikologie und Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde von der National Nature Sciences Foundation of China (Förderkennzeichen: 81870239, 81741005, 81972999) und The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions unterstützt.

Wildtyp-Zebrafische (AB), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China, bezogen. Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der Animal Care Institution der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.
1. PM2.5 Probenahme und Extraktion organischer Verbindungen
HINWEIS: PM2.5 wurde in einem städtischen Gebiet in Suzhou, China, vom 1. bis 7. August 2015 gesammelt, wie zuvorbeschrieben 5.
<ol><li>Backen Sie 47 mm Quarzmembranfilter in einem 500 °C Schalldämpferofen für 2 h, um die organischen Bestandteile zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie einen Filter in einen PM2.5-Probenehmer für 24 Stunden ununterbrochene Probenahme.</li>
	<li>Den Filter abnehmen und 24 h bei Raumtemperatur trocknen lassen.</li>
	<li>Quantifizieren Sie den Filter mit einer Analysenwaage.</li>
	<li>Extrahieren Sie organische Komponenten aus dem Filter durch Soxhlet-Extraktion unter Verwendung von Dichlormethan als Lösungsmittel19.</li>
	<li>Trocknen Sie das EOM durch eine Rotationsverdampfung in einem 60 °C Wasserbad und Stickstoffstrom. EOM in DMSO auflösen und bei -20 °C lagern.</li>
</ol>2. Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen
<ol><li>Halten Sie den Zebrafisch bei 28,5 ± 0,5 °C in einem rezirkulierenden Aquakultursystem mit einem 14 h hellen und 10 h dunklen Photoperiodenzyklus.</li>
	<li>Legen Sie gesunde erwachsene Zebrafische in einem Verhältnis von 2: 1 männlich zu weiblich in ein Becken.</li>
	<li>Sammeln Sie am nächsten Tag die Embryonen und waschen Sie sie mit Systemwasser (z. B. Zebrafischbrutwasser).</li>
	<li>Auswahl und zufällige Aufteilung von Zebrafischembryonen, die eine normale Entwicklung zeigen (gleichmäßige Größe, volle Körner und keine Eigerinnung), in 4 Gruppen in einzelnen Glas-Petrischalen mit einem Durchmesser von 7 cm (ca. 50 Embryonen pro Gericht).</li>
	<li>Behandeln Sie die Embryonen mit PM2,5 (5 mg/L) in Gegenwart oder Abwesenheit von NAC bei 0,25 μM von 2 hpf bis 72 hpf. Verwenden Sie DMSO als Fahrzeugsteuerung bis zu einer Endkonzentration von 0,1% (v/v).</li>
</ol>3. Morphologische Beobachtung von Zebrafischembryonen und Herzdissektion
<ol><li>Bei 72 PSf embryonieren Sie sie auf Glasobjektträger und beobachten unter einem Stereomikroskop. Zeichnen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe auf.</li>
	<li>Berechnen Sie die Fehlbildungsraten (den Prozentsatz der Embryonen mit Herzfehlern an den gesamten lebenden Embryonen) und analysieren Sie die Unterschiede zwischen den Gruppen mitHilfe der Einweg-ANOVA, gefolgt vom türkischen Multiple Comparison Test (p < 0,05 = statistisch signifikant).</li>
	<li>Betäuben Sie die Embryonen mit 0,6 mg/ml MS-222, um sie auf Glasobjektträgern zu immobilisieren.</li>
	<li>Zeichnen Sie Herzschläge für 30 s auf und quantifizieren Sie die Herzfrequenz mit der ImageJ-Software5,20.</li>
	<li>Sezieren Sie Herzen aus Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Achtung: Vermeiden Sie es, die Herzform zu zerstören.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenz-Assay
<ol><li>Um einen Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM2,5-induzierten DNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zu verwenden, verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einer sauberen Glasseite zu zeichnen.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL 4% Paraformaldehyd zu 1,25 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um eine fixierende Lösung herzustellen.</li>
	<li>3 sezierte Herzen in einen hydrophoben Barrierestiftkreis geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 5 min, so dass die Herzen vollständig an den Glasobjektträgern haften.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias dreimal in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBST) für 5 min pro Waschgang.</li>
	<li>Fügen Sie 50 μL Rinderserumalbumin (BSA) zu 1000 μL PBST hinzu, um eine 5% ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger in einer feuchten Kammer für 1 h, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.</li>
	<li>Verdünnen Sie 2 μL monoklonalen Antikörper der Maus gegen 8-OHdG und 2 μL polyklonaler Antikörper gegen γH2AX in 296 μL PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 μL der primären Antikörper-Cocktaillösung gegen 8-OHdG und γH2AX in einer befeuchteten Kammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C (Inkubation über Nacht kann die Signalintensität erhöhen).</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für 5 Minuten pro Waschgang.</li>
	<li>Verdünnen Sie 1 μL FITC-markierten sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und 1 μL cy3 Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 498 μL PBST, um eine funktionierende sekundäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern (1:500 in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für 5 minuten pro Lichtschutz.</li>
	<li>20 μL DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) werden den Proben zur Kernfärbung für 30 min bei Raumtemperatur zugeführt.</li>
	<li>Tragen Sie einen Abdecklip auf, um ihn zu gleiten und mit Nagellack zu versiegeln, um Trocknung und Bewegung zu verhindern. Dann bilden Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen mit dem Durchschnitt der DMSO-Kontrollproben. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten wie in Schritt 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
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<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Obwohl Zebrafische ein ausgezeichnetes Wirbeltiermodell für die Untersuchung der kardialen Entwicklungstoxizität von Umweltchemikalien sind, ist es aufgrund der geringen Größe des Embryoherzes schwierig, genügend Protein für die Western-Blot-Analyse zu erhalten. Daher präsentieren wir eine empfindliche Immunfluoreszenzmethode zur Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus von DNA-Schadensbiomarkern in den Herzen von Zebrafischembryonen, die PM2,5ausgesetzt sind.
Während der Disse...

Luftverschmutzung ist heute ein ernstes Umweltproblem, mit dem die Welt konfrontiert ist. Feinstaub (PM2.5),einer der wichtigsten Indikatoren für die Luftqualität, kann eine große Anzahl von Schadstoffen enthalten und in den Blutkreislauf gelangen, was die menschliche Gesundheit ernsthaft schädigt1. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine PM2.5-Exposition zu einem erhöhten Risiko für angeborene Herzfehler (KHK) führen kann2,3. Beweise aus Tierversuchen zeigten auch, dass PM2,5 eine abnormale Herzentwicklung bei Zebrafischembryonen und den Nachkommen von Mäusen verursachenkann,aber die molekularen Mechanismen der kardialen Entwicklungstoxizität von PM2,5 sind noch weitgehend unbekannt4,5,6.
DNA-Schäden können zu einem Stillstand des Zellzyklus führen und apoptose induzieren, was das Potenzial von Vorläuferzellen weitgehend zerstören und folglich die Herzentwicklung beeinträchtigen kann7). Es ist gut dokumentiert, dass Umweltschadstoffe, einschließlich PM2,5,das Potenzial haben, DNA durch oxidative Stressmechanismen anzugreifen8,9. Sowohl die herzische Entwicklung des Menschen als auch des Zebrafisches reagiert empfindlich auf oxidativen Stress10,11,12. 8-OHdG ist ein oxidativer DNA-Schadensmarker, und das γH2AX-Signal ist ein Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. N-Acetyl-L-Cystein (NAC), ein synthetischer Vorläufer von intrazellulärem Cystein und Glutathion, wird häufig als antioxidative Verbindung verwendet. In dieser Studie verwenden wir NAC, um die Rolle von oxidativem Stress bei PM2,5- induzierten DNA-Schäden13zu untersuchen.
Zebrafisch als Modellwirbeltier wurde häufig verwendet, um die Herzentwicklung und menschliche Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu untersuchen, da Mechanismen der Herzentwicklung bei Wirbeltieren hoch konserviert sind14,15. Zu den Vorteilen der Verwendung von Zebrafischen als Modell gehören ihre geringe Größe, ihre starke Fortpflanzungsfähigkeit und ihre niedrigen Fütterungskosten. Von besonderem Interesse für diese Studien sind Zebrafischembryonen, die während der frühen Entwicklung nicht vom Kreislaufsystem abhängig sind und schwere Herzfehlbildungen überleben können14. Darüber hinaus ermöglicht ihre Transparenz die direkte Beobachtung des gesamten Körpers unter dem Mikroskop. Somit bieten Zebrafischembryonen eine hervorragende Gelegenheit, die molekularen Mechanismen zu bewerten, die an der Induktion der kardialen Entwicklungstoxizität infolge der Exposition gegenüber verschiedenen Umweltchemikalien beteiligt sind5,16,17. Wir haben bereits berichtet, dass PM2,5-induzierteroxidativer Stress zu DNA-Schäden und Apoptose führt, was zu Herzfehlbildungen bei Zebrafischen führt18. In dieser Studie stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung von PM2,5-induziertenDNA-Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen zur Verfügung.

<table><tbody><tr><td>8-OHdG Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Sartorius, China</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>SW3015</td><td>Zur Blockierung</td></tr><tr><td>von DAPI</td><td>Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>Zur nuklearen Gegenfärbung.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus, Japan</td><td>IX73</td><td>Zur Abbildung von Fluoreszenzsignalen/</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Cy3</td><td>Carlsbad, USA</td><td>CW0159</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG FITC</td><td>Carlsbad, USA</td><td>RS0003</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein (NAC)</td><td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>QILINBEIER, China</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma, China</td><td>P6148</td><td>Stellen Sie 4% Paraformaldehyd zur Fixierung her.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>HyClone, USA</td><td>SH30256.01</td><td>0,1 % Tween in PBS zum Waschen vorbereiten.</td></tr><tr><td>PM2.5-Probenehmer</td><td>TianHong, Wuhan, China</td><td>TH-150C</td><td>Für 24 Stunden ununterbrochene PM2,5-Probenahme.</td></tr><tr><td>Zirkulierendes Aquakultursystem</td><td>HaiSheng,Shanghai,China</td><td></td><td>Darin wurde der Zebrafisch gehalten.</td></tr><tr><td>Soxhlet-Extraktor</td><td>ZhengQiao, Shanghai, China</td><td>BSXT-02</td><td>Für die Extraktion organischer Komponenten.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon, Kanada</td><td>SMZ645</td><td>Für die Herzdissektion von Zebrafischembryonen.</td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat (MS222)</td><td>Sigma,China</td><td>E10521</td><td>Zur Betäubung von Zebrafischembryonen</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma,China</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&gamma; H2AX Antikörper</td><td>Abcam, USA</td><td>ab26350</td><td>Primärer Antikörper</td></tr></tbody></table>

verwendung von immunfluoreszenz zum nachweis von pm2,5-induziertendna-schäden in zebrafisch-embryoherzen

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM2,5)in der Umgebung kann zu einer kardialen Entwicklungstoxizität führen, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch unklar. 8-Hydroxy-2'-Desoxygenase (8-OHdG) ist ein Marker für oxidative DNA-Schäden und γH2AX ist ein empfindlicher Marker für DNA-Doppelstrangbrüche. In dieser Studie wollten wir PM2,5-induzierte8-OHdG- und γH2AX-Veränderungen im Herzen von Zebrafischembryonen mit einem Immunfluoreszenz-Assay nachweisen. Zebrafischembryonen wurden mit extrahierbaren organischen Fasern (EOM) aus PM2,5 bei 5 μg/ml in Gegenwart oder Abwesenheit von antioxidativem N-Acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) nach 2 h nach der Befruchtung (hpf) behandelt. DMSO wurde als Fahrzeugsteuerung eingesetzt. Bei 72 HPF wurden Herzen mit einer Spritzennadel aus Embryonen seziert und fixiert und permeabilisiert. Nach der Blockierung wurden die Proben mit primären Antikörpern gegen 8-OHdG und γH2AX untersucht. Die Proben wurden dann gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die resultierenden Bilder wurden unter Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und mit ImageJ quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass EOM aus PM2,5 die 8-OHdG- und γH2AX-Signale im Herzen von Zebrafischembryonen signifikant verbesserte. NAC, das als reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) -Fänger fungierte, wirkte jedoch dem EOM-induzierten DNA-Schaden teilweise entgegen. Hier stellen wir ein Immunfluoreszenzprotokoll zur Untersuchung der Rolle von DNA-Schäden bei PM2,5-induziertenHerzfehlern vor, das zum Nachweis von umweltchemisch induzierten Proteinexpressionsveränderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen angewendet werden kann.

Dieser Immunfluoreszenz-Assay ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Proteinexpressionsänderungen in den Herzen von Zebrafischembryonen, die Umweltchemikalien ausgesetzt sind.
In dieser repräsentativen Analyse wurden Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans NAC pm2,5 ausgesetzt waren, auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht (Abbildung 1</...

Dieses Protokoll verwendet einen Immunfluoreszenz-Assay, um PM2,5-induzierteDNA-Schäden in den sezierten Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen.

Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Mit dieser Methode kann die Expression von Zielproteinen im Zebrafischherz genau und einfach nachgewiesen werden. Die Veränderung des Zielproteins wird direkt durch Messung der Immunfluoreszenz nachgewiesen. Führen Sie die Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen durch, wie im Textmanuskript beschrieben.72 Stunden nach der Befruchtung werden die Embryonen auf Glasobjektträger übertragen und unter einem Stereomikroskop beobachtet. Zeichnen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe auf. Berechnen Sie Die Fehlbildungsraten und analysieren Sie Die Unterschiede zwischen den Gruppen mit einer Einweg-ANOVA, gefolgt vom Mehrfachvergleichstest der Türkei.Nach der Betäubung der Embryonen mit 0,6 Milligramm pro Milliliter MS222 zeichnen Sie die Herzschläge für 30 Sekunden auf und quantifizieren die Herzfrequenz mit der Image J-Software. Sezieren Sie sorgfältig Herzen aus den Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einem sauberen Glasträger zu zeichnen.Fügen Sie 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd zu 1,25 Mikrolitern PBS hinzu, um eine fixierende Lösung herzustellen, legen Sie dann drei sezierte Herzen in einen hydrophoben Barrierekreis und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens fünf Minuten. Waschen Sie die Dias dreimal in PBST für fünf Minuten pro Waschgang.Fügen Sie 50 Mikroliter BSA zu 1.000 Mikroliter PBST hinzu, um eine 5% ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang in einer feuchten Kammer, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Verdünnen Sie zwei Mikroliter monoklonaler Mausantikörper gegen 8-Hydroxydeoxyguanosin und zwei Mikroliter polyklonaler Kaninchenantikörper gegen Gamma-H2AX in 296 Mikroliter PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 Mikrolitern der primären Antikörper-Cocktaillösung in einer befeuchteten Kammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Waschgang. Verdünnen Sie einen Mikroliter FITC-markierten sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und einen Mikroliter Psy-3-Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 500 Mikroliter PBST, um eine funktionierende sekundäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.Inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Fügen Sie 20 Mikroliter DAPI zu den Proben hinzu, um sie kernlich zu färben, und inkubieren Sie sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Tragen Sie einen Deckzettel auf den Schlitten auf und versiegeln Sie ihn mit Nagellack, um Trocknung und Bewegung zu verhindern. Stellen Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop ab und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen anhand des Durchschnitts der DMSO-Kontrollstichproben und bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten.Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans N-Acetyl-L-Cystein oder NAC pm 2,5 ausgesetzt waren, wurden auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht. EOM von PM 2,5 kostete eine signifikante Zunahme der kardialen Teratogenese, wie Perikardödem, veränderte Schleifen und verringerte Größe, im Vergleich zu DMSO-Kontroll-behandelten Herzen. Die Herzfrequenz war auch bei Embryonen, die EOM ausgesetzt waren, signifikant verringert.Zugabe von NAC-abgeschwächten EOM-induzierten Herzfehlern. Ein Immunfluoreszenz-Assay wurde verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schädigung in EOM-behandelten Geweben zu bewerten. Die Spiegel der 8-Hydroxydesoxyguanosin- und Gamma-H2AX-Expression waren in den Herzen von Zebrafischembryonen, die mit EOM behandelt wurden, signifikant erhöht, was auf eine Zunahme oxidativer DNA-Schäden bzw. DNA-Doppelstrangbrüche hindeutet.Dem EOM-induzierten DNA-Schaden wurde teilweise durch nac-Supplementierung entgegengewirkt. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, achten Sie beim Waschen der Proben mit PBS, da sich das Zebrafischherz vom Objektträger ablösen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Dieses Video zeigt einen hochsensitiven Immunfluoreszenz-basierten Assay zum Nachweis von PM2,5-induzierten oxidativen Schäden im Herzen von Zebrafischembryonen durch Messung der Spiegel von 8-OHdG und γH2AX, die auf DNA-Schäden bzw. Doppelstrang-DNA-Brüche hinweisen.

Immunfluoreszenz-Assay zum Nachweis von PM2,5-vermittelten DNA-Schäden in Fischembryonen

Bestimmte genetische Störungen oder die Exposition gegenüber Toxinen können normale Entwicklungsprozesse stören, die zum Tod bestimmter Zelltypen führen. Die Analyse von aktivierter Caspase 3 durch Whole-Mount-Immunfluoreszenz in Zebrafischembryonen zeigt eine stadien- und gewebespezifische Lokalisation von Zellen, die spezifisch Apoptose durchlaufen.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Ziel dieses Protokolls ist es, eine neuartige Methode zur Beurteilung der segmentalen Herzfunktion bei embryonalen Zebrafischen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beschreiben.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Die optogenetische Manipulation von Signalwegen kann eine leistungsfähige Strategie sein, um zu untersuchen, wie Signale in der Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit entschlüsselt werden. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung von Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensordomänen-basierten Knoten- und knochenmorphogenen Protein-Signalaktivatoren (BMP) im frühen Zebrafischembryo.

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

Diese Studie etabliert eine empfindliche, immunfluoreszenzbasierte Bildgebungsmethode zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierung in einzelnen embryonalen Herzen von Zebrafischen. Dieser Ansatz überwunde die Herausforderung begrenzten Gewebematerials und umging die Notwendigkeit der Bisulfit-Umwandlung.

Nachweis der globalen DNA-Methylierung in den Herzen von Zebrafischlarven

Erfahren Sie, wie Immunfluoreszenz DNA-Schäden durch PM2,5 in Zebrafisch-Embryoherzen nachweist. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinanalysen für Toxikologie und Entwicklungsbiologie.

Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM_{2,5-induzierten}DNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen

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