Name: Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie den Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringende Peptide. Diese Methode nutzt Liposomen mit eingekapselten Farbstoffen, um Peptid-Membran-Wechselwirkungen zu analysieren und Aufschluss über zelluläre Internalisierungsmechanismen zu geben.

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Die Autoren danken Emilie Josse für die kritische Begutachtung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der Stiftung "La Ligue contre le Cancer", der "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" und dem "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) unterstützt.

1. Vorbereitung großer unilamellarer Vesikel (LUVs)
<ol><li>Bereiten Sie LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Nachahmungen für die Fluoreszenzleckage-Assay vor.</li>
	<li>Mischen Sie mit einer Hamilton Glasspritze Phosphatidylcholin (DOPC, 786,11 g/mol), Sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) und Cholesterin (Chol, 386,65 g/mol) im Molverhältnis 4:4:2. Die Lipidlösung wird aus einer Stammlösung jedes Lipids gewonnen, das in einem Methanol/Chloroform-Lösungsmittel (3/1; Volumen/Volumen) bei 25 mg/ml in einem 25-ml-Glas-Rundkolben gelöst ist. Basierend auf 4 μmol DOPC, 4 μmol SM und 2 μmol Chol wird die Lipidlösung aus Stammlösung durch Mischen von 126 μL, 117 μL bzw. 31 μL erhalten. VORSICHT: Methanol ist ein giftiges und brennbares Lösungsmittel und Chloroform ist giftig und krebserregend. Beide sollten mit dem entsprechenden Schutz unter einer Haube gehandhabt werden.</li>
	<li>Methanol/Chloroform mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum während 45-60 min bei 60 °C verdampfen, bis ein getrockneter Lipidfilm entsteht.</li>
	<li>Bereiten Sie zwei HEPES-Pufferlösungen vor. HEPES-Puffer 1 durch Mischen von 20 mM HEPES (238,3 g/mol) und 75 mM NaCl (58,44 g/mol) herstellen und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer 2 durch Mischen von 20 mM HEPES und 145 mM NaCl vorbereiten und pH-Wert auf 7,4 einstellen. HEPES-Puffer können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Osmolarität der Puffer mit einem Osmometer zu überprüfen.</li>
	<li>Herstellung einer Lipidhydratationslösung durch Lösen der Membran undurchlässiger fluoreszierender Farbstoff-Quencher-Paare, 8-Aminonaphthalin-1, 3, 6-Trisulfonsäure, Dinatriumsalz bei 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) und p-Xylol-Bispyridiniumbromid bei 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in HEPES-Pufferlösung. Das Mischen von AMEISEN mit DPX führt zu einer gelben Lösung. Um die Konzentrationen von 12,5 mM ANTS und 45 mM DPX zu erreichen, lösen Sie 21,4 mg bzw. 76 mg in 4 ml HEPES-Puffer 1 auf. HINWEIS: Lipidhydratationslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, indem das Röhrchen mit Aluminiumfolie umwickelt wird.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie mehrschalige Vesikel (MLV), indem Sie den getrockneten Lipidfilm mit 1 ml der Lipidhydratationslösung wiederverwenden und bis zur Auflösung des getrockneten Lipidfilms wirbeln. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig gelöst ist, da sich kleine Lipidaggregate negativ auf die vorhergehenden Schritte auswirken. Überprüfen Sie auch die Wand des Glas-Rundkolbens, um sicherzustellen, dass kein Lipidfilm mehr vorhanden ist. HINWEIS: Die Lösung erscheint nach der Lösung opalisierend und hellgelb.</li>
	<li>Unterziehen Sie die Vesikel fünf Gefrier- / Auftauzyklen, um einlamellare Vesikel zu erhalten. Führen Sie jeden Zyklus durch, indem Sie den Glas-Rundkolben für 30 s in flüssigen Stickstoff für den Gefrierschritt stellen und dann für 2 Minuten in einem Wasserbad für den Auftauschritt belassen. HINWEIS: Die Temperatur des Badewassers sollte 5-10 °C höher sein als die Schmelztemperatur der Lipide.</li>
	<li>Bereiten Sie den Lipidextruder vor, indem Sie zwei Filterträger mit HEPES-Puffer in jedes Polytetrafluorethylen (PTFE) -Extruderstück einsetzen, das in den Metallextruderkanister gelegt wird.</li>
	<li>Legen Sie eine HEPES-befeuchtete Polycarbonatmembran (0,1 μm Porengröße, 25 mm Durchmesser) auf die Oberseite einer Filterhalterung.</li>
	<li>Montieren Sie die beiden Metallextruderkanister und schrauben Sie sie.</li>
	<li>Legen Sie den zusammengebauten Extruder in den Halter und führen Sie eine 1-ml-Spritze in das entsprechende Loch am Ende jedes Polytetrafluorethylen-Extruderstücks ein. Die Extrusion entspricht dem Durchgang der getesteten Flüssigkeit von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran.</li>
	<li>Testen Sie den Extruder mit 1 ml HEPES-Puffer, der in eine der 1 ml Spritzen geladen ist, um sicherzustellen, dass keine Leckagen oder Probleme auftreten.</li>
	<li>Ersetzen Sie den 1-ml-HEPES-Puffer durch die MLV-Probe.</li>
	<li>Führen Sie die Extrusion durch, indem Sie die MLV-Probe mindestens 21 Mal von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran leiten, um einheitliche LUVs gleicher Größe zu erhalten. HINWEIS: Die Extrusion sollte bei einer Temperatur erfolgen, die höher ist als die Schmelztemperatur des Lipidgemisches.</li>
</ol>2. Reinigung von LUVs
<ol><li>Bereiten Sie eine Säulenreinigung vor, um nicht gekapselte ANTS- und DPX-Überschuss zu entfernen.</li>
	<li>Vernetztes Dextrangel (G-50), das in wässrigem Medium mit 0,01%NaN3 (65 g/mol) resuspendiert ist, in eine Flüssigkeitschromatographiesäule (Luer Lock, nicht ummantelt, 1,0 cm x 20 cm, Bettvolumen 16 ml) bis zu 1 cm unter der Oberseite des farblosen Teils der Säule einführen.</li>
	<li>Öffnen Sie den Wasserhahn und lassen Sie die Flüssigkeit fließen, um das vernetzte Dextran-Gel abzusetzen.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule durch Eluieren mit 20 ml HEPES-Puffer 2 und verwerfen Sie den Ausgangsstrom der Säule.</li>
	<li>Schließen Sie den Wasserhahn, sobald das tote Lösungsmittelvolumen über der Säule minimiert ist (<100 μL), aber ausreichend, um eine Trocknung des vernetzten Dextrangels zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die frisch extrudierten LUVs (gelb) auf die Säule und lassen Sie sie in das vernetzte Dextran-Gel einwirken.</li>
	<li>Fügen Sie der Säule kontinuierlich den HEPES-Puffer 2 hinzu, um die LUV-Reinigung durchzuführen.</li>
	<li>Elute etwa 2 ml HEPES-Puffer 2 (vergessen Sie nicht, die Oberseite der Säule regelmäßig zu füllen, um ein Trocknen des vernetzten Dextran-Gels zu vermeiden): Die freie gelbe AMEISEN- und DPX-Lösung wandert langsamer als die Liposomen.</li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Sammeln von gereinigten LUVs in Röhrchen (1,5 ml).</li>
	<li>Beobachten Sie die Eluententropfen aus der Säule und wenn sie opalisierend werden, enthalten sie Liposomen. Wechseln Sie das Röhrchen, um die LUV-haltige Fraktion zurückzugewinnen.</li>
	<li>Elute, bis die Tropfen nicht mehr opalisierend sind (~1 ml). Eluieren Sie anschließend weitere 0,5 ml in einer separaten Fraktion und hören Sie dann auf zu eluieren. HINWEIS: Standards sind jetzt in einer Vielzahl von Molekulargewichten, als Kits oder einzelne Molekulargewichte erhältlich, um das Elutionsvolumen der LUVs zu kalibrieren.</li>
	<li>Wickeln Sie die Röhrchen mit den LUVs in Aluminiumfolie, um ein Bleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 20 mL HEPES Puffer 2.</li>
	<li>Die LUVs können dann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Da die LUV-Stabilität von der LUV-Konzentration und -Zusammensetzung sowie von der Ionenstärke abhängen kann, sollte die Größe der LUVs mit einem DLS-Instrument (Dynamic Light Scattering) gesteuert werden (siehe Abschnitt 4. B. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität) vor jedem Test.</li>
</ol>3. Quantifizierung der Konzentration von LUVs
<ol><li>Schätzung der LUV-Konzentration durch ein Phospholipid-Quantifizierungskit, das die Bewertung der Cholinkonzentration19ermöglicht. Dieser Assay kann angewendet werden, wenn Phospholipide mit Cholin, das polaren Kopf enthält, erheblich sind (>50% der LUVs).</li>
	<li>Bereiten Sie das Farbreagenz vor, indem Sie 18 mg Chromogensubstrat in 3 ml Puffer auflösen.</li>
	<li>Laden Sie eine Polystyrolküvette, 10 x 10 x 45 mm, mit 3 ml Farbreagenz ein.</li>
	<li>Verwenden Sie das reine Farbreagenz als Leerbedingung (Blank). 20 μL LUV-Probe (Test) oder 20 μL Standardlösung bekannter Cholinkonzentration (Standard) zugeben.</li>
	<li>Gut mischen und 5 min bei 37 °C unter allen Bedingungen (Blank, Test und Standard) inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption (optische Dichte, OD) der Probe und der Standardlösung mit der Blindlösung als Kontrolle bei 600 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Überprüfen Sie die OD-Werte, die es ermöglichen, die Lipidkonzentration der LUVs, C [LUV], in Cholinäquivalent im Vergleich zum Standard der bekannten Konzentration abzuschätzen.</li>
	<li>Führen Sie die Berechnung mit der folgenden Gleichung durch: C[LUV] (mol / l) = (OD-Probe / OD-Standard) x C[Standard] (mol / l) ANMERKUNG: Das Phospholipid-Quantifizierungskit enthielt eine Cholinchlorid(139,6 mg/l)-Standardlösung bei 54 mg/dl, die der molaren Konzentration von C[Standard] = 3,87 mmol/L entspricht.</li>
</ol>4. Charakterisierung von LUV-Größe und Homogenität
<ol><li>Führen Sie eine Messung mit einem DLS-Gerät durch, um die LUV-Größe (in nm) und den Polydispersitätsindex (PdI) zu bestimmen.</li>
	<li>Programmieren Sie das entsprechende "Standard Operation Procedure" (SOP), indem Sie die Viskosität des Lösungsmittels/Puffers und der verwendeten Küvette angeben.</li>
	<li>500 μL der LUV-Lösung in eine Polystyrol-Halbmikroküvette geben.</li>
	<li>Setzen Sie die Polystyrol-Semimikroküvette in ein DLS-Gerät ein.</li>
	<li>Messen Sie bei Raumtemperatur die Größenverteilung in Bezug auf die mittlere Größe (Z-Mittelwert) der Partikelverteilung und der Homogenität (Polydispersitätsindex, PdI).</li>
	<li>Alle Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Messungen, die jeweils in drei sich wiederholenden Zyklen durchgeführt werden. HINWEIS: Die Standardwerte für LUVs betragen eine mittlere Größe von 137 ± 7 nm mit einem PdI von 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Herstellung von Peptidlösungen
<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung des Peptids vor, die für den Leckage-Assay analysiert werden sollte.</li>
	<li>Lösen Sie Peptidpulver (>95% Reinheit) in reinem Wasser auf (z. B. 1 mg Peptid in 500 μL reinem Wasser). HINWEIS: Es wird empfohlen, Peptide in reinem Wasser zu verdünnen und eine Dimethylsulfoxid (DMSO) -Solubilisierung zu vermeiden, die Artefakte induzieren könnte (z. B. Membranpermeabilisierung20).</li>
	<li>Wirbeln Sie die Peptidlösung für 5 s.</li>
	<li>Die Peptidlösung in einem Wasserbeschallungsbad für 5 min beschallen und dann für 5 min bei 12.225 x gzentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand zur Konzentrationsbestimmung.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption von drei unabhängigen Peptidverdünnungen bei 280 nm und berechnen Sie dann die Peptidkonzentration anhand des molaren Extinktionskoeffizienten ε (abhängig vom Tryptophan- und Tyrosingehalt in der Peptidsequenz) und der Beer-Lambert-Regel. HINWEIS: Wenn das Peptid Tryptophan und Tyrosin enthält, wird der molare Extinktionskoeffizient ε auf der Grundlage von Tryptophan ε = 5.690 M-1cm-1 und Tyrosin ε = 1.280 M-1cm-1berechnet. Wenn die Peptidsequenz kein Tryptophan oder Tyrosin enthält, könnte ein anderer kolorimetrischer Assay zur Messung der Konzentration durchgeführt werden (z. B. BCA oder Bradford).</li>
	<li>Die Peptidlösung in reinem Wasser auf eine von 100 μM verdünnen und bei 4 °C lagern. HINWEIS: In reinem Wasser kommt es während der 4 °C Lagerung zu keinem Peptidabbau. Die Peptidkonzentration sollte jedoch alle 2 Wochen gemessen werden, um sicherzustellen, dass keine Wasserverdunstung auftritt.</li>
</ol>6. Fluoreszenz-Leckage-Assay
<ol><li>Der Fluoreszenzlecktest wird auf einem Spektrofluorometer bei Raumtemperatur gemessen. Anregungs- und Emissionswellenlänge sind auf Ex = 360 nm ± 3 nm bzw. Em = 530 nm ± 5 nm festgelegt.</li>
	<li>Verdünnen Sie LUVs in 1 mL HEPES-Puffer 2 auf eine Endkonzentration von 100 μM in einer Quarzfluoreszenzküvette. Fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Lösung während des Experiments zu homogenisieren.</li>
	<li>Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 s, zwischen t = 0 s und t = 99 s, um auf die Hintergrundfluoreszenz zuzugreifen. HINWEIS: LUVs allein konnten auch während des gesamten Experiments (15 min) gemessen werden, um auf Hintergrundfluoreszenz und potenzielle Lecks zuzugreifen.</li>
	<li>Danach messen Sie die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität unter Zugabe von Aliquots der Peptidlösung für die nächsten 900 s (15 min). Dieses Protokoll wird für jede getestete Peptidkonzentration von 0,1 μM bis 2,5 μM durchgeführt.</li>
	<li>Schließlich wurde eine 100%ige Fluoreszenz durch Solubilisierung der LUVs durch Zugabe von 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v) erreicht, was zu einer völlig ungequenten Sonde zwischen t = 1.000 s und t = 1.100 s führte.</li>
</ol>7. Quantifizierung der Leckage
<ol><li>Unterdrücken Sie Werte, die nach t = 1.090 s erhalten wurden, um die gleiche Anzahl von Punkten für jede getestete Bedingung beizubehalten.</li>
	<li>Berechnen Sie die minimale Fluoreszenz, Fmin, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 0 s und t = 49 s (LUVs allein) bilden.</li>
	<li>Berechnen Sie die maximale Fluoreszenz, Fmax, indem Sie den Durchschnitt von 50 Punkten zwischen t = 1.041 s und t = 1.090 s (LUVs mit Triton X-100) bilden.</li>
	<li>Berechnen Sie den Leckageprozentsatz (%Leck) zu jedem Zeitpunkt (t = x) gemäß der folgenden Gleichung: %Leck(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für Werte, die mit unterschiedlicher LUV-Vorbereitung (n ≥ 2) für dieselbe Bedingung erhalten wurden.</li>
	<li>Zeichnen Sie den Prozentsatz der Leckage, %Leck(t=x),in Abhängigkeit von der Zeit (n).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Der vorgestellte Fluoreszenzlecktest ist eine einfache und schnelle Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid. Einfach zu machen, ermöglicht es auch einen indirekten Vergleich zwischen verschiedenen membranwechselwirkenden Peptiden oder anderen membraninteragierenden Molekülen. In Bezug auf kritische Schritte des Protokolls, da dieser Assay relative Werte zwischen der Baseline (LUVs allein) und der maximalen Fluoreszenzfreisetzung (Triton-Bedingung) liefert, bewerten wir normaler...

Nach ihrer Entdeckung in den neunziger Jahren wurden zelldurchdringende Peptide (CPPs) entwickelt, um eine effiziente zelluläre Lieferung von Ladungen durch die Plasmamembran zu fördern1,2. CPPs sind in der Regel kurze Peptide, im Allgemeinen 8 bis 30 Aminosäuren, die eine Vielzahl von Ursprüngen haben. Sie wurden zunächst als "direkt translozierende" Träger definiert, was bedeutet, dass sie in der Lage waren, die Plasmamembran zu überqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen, unabhängig von einem endozytotischen Weg, weder Energiebedarf noch Rezeptorbeteiligung. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese ersten Beobachtungen hauptsächlich auf eine Fluoreszenzüberschätzung aufgrund des experimentellen Artefakts und/oder auf Fixierungsprotokolle mit Methanol3 zurückzuführen waren. Heutzutage ist es allgemein anerkannt, dass die CPP-Aufnahme sowohl durch Endozytose als auch durch energieunabhängige Translokation4,5,6,7 in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie der Art der Ladung, der verwendeten Verbindung zwischen CPP und Ladung, der untersuchten Zelllinie usw. erfolgt.
CPPs können als Transfektionsmittel nach zwei Strategien verwendet werden, entweder mit einer chemischen Verbindung (kovalente Strategie) oder elektrostatisch/hydrophobe Wechselwirkungen (nicht-kovalente Strategie) zwischen dem CPP und seiner Ladung8,9,10,11. Obwohl beide Strategien ihre Effizienz beim Zelltransfer mehrerer Ladungen gezeigt haben, ist das Verständnis des Mechanismus der Internalisierung durch CPPs immer noch umstritten und das Gleichgewicht zwischen Endozytosewegen oder direkter Penetration ist immer noch schwer zu messen12,13. Obwohl eine Reihe von experimentellen Werkzeugen und Strategien zur Verfügung stehen, um die Beteiligung endozytärer Prozesse klar zu adressieren, scheint die direkte Translokation jedoch schwieriger zu charakterisieren, da sie diskretere Wechselwirkungen mit Plasmamembrankomponenten impliziert. Biologische Membranen bestehen in der Regel aus zahlreichen Komponenten, von Phospholipiden bis hin zu Membranproteinen, die je nach Zelltyp und/oder Umgebung (Stressbedingungen, Zellteilung usw.) variieren können. Diese Vielfalt der Zusammensetzung und folglich das Fehlen eines universellen zellulären Membranmodells ermöglicht keine Studien in einer einzigen Weise. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden jedoch schrittweise Ansätze mit künstlichen Membranen oder Membranextrakten entwickelt. Von kleinen unilamellaren Vesikeln bis hin zu Monolayer-Ansätzen war jedes Modell eindeutig relevant, um spezifische Fragen zu beantworten14,15. Unter ihnen bilden große unilamellare Vesikel (LUVs) ein geeignetes Membranimitationsmodell, um Peptid/ Membran-Wechselwirkungen als Schlüsselpunkt im Internalisierungsprozess zu untersuchen.
In diesem Zusammenhang beschreibt das folgende Protokoll die Untersuchung der Auswirkungen von Peptiden und Peptid/Membran-Wechselwirkungen auf die Integrität von LUVs durch die Überwachung sowohl eines anionischen Fluoreszenzfarbstoffs als auch seines entsprechenden polykationischen Quenchers, der in Liposomen verkapselt ist. Dieses Tool wird verwendet, um CPP / Membran-Interaktionen zu untersuchen, um zu verstehen, ob sie in der Lage sind, eine direkte Membrantranslokation durchzuführen. Obwohl dieser LUV-Fluoreszenzleckage-Assay normalerweise zum Vergleich verschiedener membranwechselwirkender Peptide angewendet wird, könnte er auch zur Untersuchung von CPPs-Frachtkonjugaten (kovalente Strategie) und CPP:cargo-Komplexen (nicht-kovalente Strategie) verwendet werden.
Das vorliegende Protokoll wird daher erstmals exemplarisch mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen Amphipathischen Peptiden (WRAP)16 veranschaulicht. WRAP ist in der Lage, peptidbasierte Nanopartikel zu bilden, um schnell und effizient kleine interferierende RNA (siRNA) in mehreren Zelllinien zu liefern16. Die Fluoreszenzleckeigenschaften von WRAP-Peptid allein oder siRNA-beladenen WRAP-basierten Nanopartikeln wurden überwacht, um ihren Mechanismus der zellulären Internalisierung zu charakterisieren. Wir zeigten, dass ihr Internalisierungsmechanismus hauptsächlich direkte Translokationbeinhaltete 7. In einem zweiten Beispiel wurde das WRAP-Peptid kovalent mit dem Protein/Protein-interferierenden Peptid iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 konjugiert und seine Fähigkeit, Membranen zu destabilisieren, in einem Fluoreszenzleckage-Assay mit iCAL36 verglichen, das mit Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), einem weiteren CPP, gekoppelt ist.
Abschließend werden die Vorteile und Grenzen der Methode sowohl aus technologischer Sicht als auch im Hinblick auf die biologische Relevanz diskutiert.

<table><tbody><tr><td>25-ml-Glaskolben mit rundem Boden</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure, Dinatriumsalz (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Vor Licht schützen&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (Dioleoylphosphatidylcholin)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Vor Luft schützen</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L Glasspritze</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Phospholipid&nbsp;</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>Säule für Flüssigkeitschromatographie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore Polycarbonat-Membran (0,1 &micro; m Porengröße, 25 mm Durchmesser)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Küvette aus Polystyrol, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Semi-Mikroküvette, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-Xylol-Bispyridiniumbromid (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Vor Licht schützen&nbsp;</td></tr><tr><td>Quarz-Fluoreszenzküvette</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor-System&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Harz</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Vor Luft schützen</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-leckage-assay zur untersuchung der membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes peptid

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Zelldurchdringende Peptide (CPPs) sind definiert als Träger, die in der Lage sind, die Plasmamembran zu durchqueren und eine Ladung in Zellen zu übertragen. Eines der wichtigsten gemeinsamen Merkmale, die für diese Aktivität erforderlich sind, ergab sich aus den Wechselwirkungen von CPPs mit der Plasmamembran (Lipide) und insbesondere mit Komponenten der extrazellulären Matrix der Membran selbst (Heparansulfat). Unabhängig von der direkten Translokation oder der endozytoseabhängigen Internalisierung sind Lipiddoppelschichten sowohl auf Der Ebene der Plasmamembran als auch auf der Ebene des intrazellulären Verkehrs (endosomale Vesikel) am Internalisierungsprozess beteiligt. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die verschiedenen Schritte der Formulierung, Reinigung, Charakterisierung und Anwendung eines großen unilamellaren Vesikels (LUVs) beschreibt, um eine mögliche CPP-Membrandestabilisierung / -interaktion zu erkennen und ihre Rolle im Internalisierungsmechanismus zu adressieren. LUVs mit einer Lipidzusammensetzung, die den Plasmamembrangehalt widerspiegelt, werden erzeugt, um sowohl einen Fluoreszenzfarbstoff als auch einen Quencher zu verkapseln. Die Zugabe von Peptiden im extravesikulären Medium und die Induktion von Peptid-Membran-Wechselwirkungen auf den LUVs könnten somit dosisabhängig eine signifikante Erhöhung der Fluoreszenz induzieren, die eine Leckage aufdeckt. Hier werden Beispiele mit den kürzlich entwickelten Tryptophan (W)- und Arginin (R)-reichen amphipathischen Peptiden (WRAPs) geliefert, die eine schnelle und effiziente siRNA-Abgabe in verschiedenen Zelllinien zeigten. Schließlich werden die Art dieser Wechselwirkungen und die Affinität zu Lipiden diskutiert, um die Membrantranslokation und/oder den endosomalen Entweicher zu verstehen und zu verbessern.

Das Prinzip des Fluoreszenzleckage-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Im Detail werden große einlamellare Vesikel (LUVs), die einen fluoreszierenden Farbstoff und einen Quencher (kein Fluoreszenzsignal) verkapseln, mit dem biomolekularen Wirkstoff behandelt. Durch die Wechselwirkung des Peptids mit Lipidmembranen, die Membranpermeabilität, Reorganisation oder sogar Ruptur implizieren könnte, werden der Fluoreszenzfarbstoff und der Quencher aus den LUVs fr...

Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Dieser Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode zur Behandlung der Membrandestabilisierung über Biomoleküle. Unter Verwendung von Liposomen-verkapselten Fluoreszenzfarbstoffen kann es verwendet werden, um verschiedene Membranen zu vergleichen, die mit Peptiden interagieren. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Destabilisierung der Membran durch zellpenetrierende Peptide zu untersuchen, um den Mechanismus der zellulären Internalisierung zu verstehen und ihre Beteiligung an der direkten Membrantranslokation zu beurteilen.Im Vergleich zu biologischen Membranen ermöglichen Liposomen die Kontrolle der Phospholipidzusammensetzung, um verschiedene Lipidwerte, wie z.B. Plasma-, endosomale oder mitochondriale Membranen, nachzuahmen. Um LUVs für ihre Verwendung als Zellmembran-Imitatoren für einen Fluoreszenz-Leckage-Assay vorzubereiten, verwenden Sie eine Hamilton-Glasspritze, um Phosphatidylcholin, Sphingomyelin und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 4:4:2 zu mischen. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer, um das Methanolchloroform unter Vakuum für 46 bis 50 Minuten bei 60 Grad Celsius zu verdampfen, bis sich ein getrockneter Lipidfilm gebildet hat.Um die mehrlamellären Vesikel zu rekonstituieren, resuspendieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit einem Milliliter Lipidhydratationslösung und wirbeln Sie gründlich vortexen, bis sich der getrocknete Lipidfilm aufgelöst hat. Nachdem Sie bestätigt haben, dass das gesamte Lipid eingearbeitet wurde und dass kein Film an den Seiten des Kolbens zurückbleibt, frieren Sie die Vesikel fünfmal für 30 Sekunden in flüssigem Stickstoff und zwei Minuten in einem 30-Grad-Wasserbad pro Zyklus ein und tauen Sie sie auf. Um den Lipid-Extruder vorzubereiten, setzen Sie zwei mit HEPES-Puffer behandelte Filterstützen in jedes PTFE-Extruderstück innerhalb des Metallextruderbehälters ein und platzieren Sie eine 0,1 Mikrometer porenstarke HEPES-befeuchtete Polycarbonatmembran auf der Oberseite eines Filterträgers.Schrauben Sie die beiden Metall-Extruder-Kanister zusammen und setzen Sie den zusammengebauten Extruder in die Halterung ein. Um den Extruder auf Undichtigkeiten oder andere Probleme zu überprüfen, führen Sie eine leere Ein-Milliliter-Spritze in das entsprechende Loch an einem Ende des PTFE-Extruderstücks und eine weitere Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter HEPES-Puffer am anderen Ende ein, geben Sie dann die mehrlamellare Vesikelprobe auf die gleiche Weise an den Extruder ab und schieben Sie die Probe mindestens 21 Mal von einer Spritze zur anderen durch die Polycarbonatmembran, um erhalten Sie einheitliche LUVs. Um die LUVs zu reinigen, geben Sie frisch extrudierte LUVs auf eine Flüssigchromatographiesäule und lassen Sie die Vesikel in das vernetzte Dextrangel eindringen.Geben Sie kontinuierlich HEPES-Puffer zwei in die Säule und beginnen Sie mit der Eluierung von etwa zwei Millilitern HEPES-Puffer zwei. Die freie gelbe ANTS- und DPX-Lösung wandert langsamer als die Liposomen. Nachdem ein Milliliter eluiert wurde, beginnen Sie mit der Sammlung der gereinigten LUVs in 1,5-Milliliter-Röhrchen.Wenn die Tropfen des Eluenten opaleszierend werden, wechseln Sie das Röhrchen, um die LUV-haltige Fraktion zurückzugewinnen. Wenn die Tropfen nicht mehr opaleszierend sind, eluieren Sie weitere 500 Mikroliter in einer separaten Fraktion, bevor Sie die Elution stoppen. Zur Bestimmung der LUV-Größe und des Polydispersitätsindex ist die Viskosität des Lösungsmittels in der Polystyrol-Halbmikroküvette, die im Experiment verwendet werden soll, und das dynamische Lichtstreusystem anzugeben und 500 Mikroliter der LUV-Lösung in die Küvette zu geben, dann die Küvette auf das Gerät zu laden und die Größenverteilung in Bezug auf die mittlere Größe der Partikelverteilung und die Homogenität zu messen.Um die Fluoreszenzleckage zu messen, verdünnen Sie die LUVs in einem Milliliter HEPES-Puffer, zwei in einer Quarzfluoreszenzküvette auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar und fügen Sie einen Magnetrührer hinzu, um die Homogenisierung der Lösung während des Experiments zu erleichtern. Messen Sie die LUVs allein während der ersten 100 Sekunden, um die Hintergrundfluoreszenz zu beurteilen, bevor Sie die Leckage als Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei Zugabe von Aliquoten der Peptidlösung in den nächsten 900 Sekunden messen. Um eine Fluoreszenzleckage von 100 % als Positivkontrolle zu messen, fügen Sie den LUVs einen Mikroliter Triton X-100 hinzu, um die Vesikel zu lösen, was zu einer vollständigen Abschreckung der Sonde in den letzten 100 Sekunden der Analyse führt.Verwenden Sie dann die Formel, um den Prozentsatz der Leckage zu jedem Zeitpunkt zu berechnen. In Abwesenheit von Peptiden wird keine Fluoreszenzleckage aus den LUVs beobachtet. Die Zugabe von WRAP zu den LUVs führt zu einem signifikanten Anstieg der Fluoreszenz, was zu einer wichtigen LUV-Leckage und ANTS-Freisetzung führt.Nach 15 Minuten wird in Gegenwart von 2,5 mikromolaren WRAP im Vergleich zur Triton-Positivkontrolle eine Leckage von ca. 67 % erreicht. Im Gegensatz dazu ist die Leckage im Vergleich zum freien Peptid 1,5-mal schwächer, wenn WRAP in der gleichen Konzentration mit kleiner interferierender RNA zu peptidbasierten Nanopartikeln zusammengesetzt wird. Bei Verwendung des konjugierten Penetratin-iCAL-Peptids wird kein signifikanter Fluoreszenzanstieg festgestellt, während die Zugabe von WRAP-iCAL-Peptid eine Nettoleckage induziert, die durch ein sehr starkes Fluoreszenzsignal bei gleicher Konzentration von 2,5 Mikromolaren gekennzeichnet ist.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Fluoreszenz-Leckage-Assay verwendet werden kann, um die Fähigkeit einiger zellpenetrierender Peptide aufzudecken, Peptidmembran-Wechselwirkungen durchzuführen, die zu einer mehr oder weniger ausgeprägten Membranpermeabilität führen. Diese Methode begünstigt eine schnelle Identifizierung von Membranpeptid-Wechselwirkungen, die zu einer Membrandestabilisierung führen, um den Internalisierungsmechanismus von zellpenetrierenden Peptiden oder anderen membranaktiven Peptiden wie photogenen oder antimikrobiellen Peptiden zu entschlüsseln. Im Falle einer Peptid-Lipid-Wechselwirkung ohne Leckageinduktion sind andere Ansätze wie Tryptophan-Fluoreszenzexperimente erforderlich.Dieser Fluoreszenz-Leakage-Assay ist im CPP-Bereich weit verbreitet und kann wichtige Informationen über die Zelltranslokation oder den endosomalen Austritt liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

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