Name: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Lernen Sie die Elektroantennographie an Mücken wie Aedes aegypti und Anopheles stephensi. Diese Methode erfasst olfaktorische Reaktionen zuverlässig und unterstützt Forscher bei der Entwicklung neuer Schädlingsbekämpfungsstrategien.

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Ich danke Dr. Clément Vinauger und Dr. Jeffrey Riffell für hilfreiche Gespräche. Die folgenden Reagenzien wurden über BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Anopheles stephensi, Stamm STE2, MRA-128, beigesteuert von Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, beigetragen von David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Stamm JHB, Eier, NR-43025. Der Autor dankt Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger und Jeffrey Marano für die Bereitstellung von Mückeneiern von Culex quinquefasciatus und Anopheles stephensi (Stamm: Liston). Aedes albopictus und Toxorhynchites rutilus septentrionalis stammen von Feldmücken ab, die der Autor im New River Valley (VA, USA) gesammelt hat. Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Biochemie und dem Fralin Life Science Institute unterstützt.

1. Zubereitung der Kochsalzlösung
<ol><li>Bereiten Sie die Kochsalzlösung im Voraus vor und bewahren Sie sie im Kühlschrank auf.</li>
	<li>Folgen Sie Beyenbach und Masia26 , um die Lösung vorzubereiten. HINWEIS: Kochsalzlösung in mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 Glucose, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 und 1,0 MgCl2. Der pH-Wert wird mit 1 M NaOH auf 7,1 eingestellt. Fügen Sie der Zubereitung zu diesem Zeitpunkt keine Glukose oder Saccharose hinzu, um die Regallagerung zu erhöhen. Geben Sie die benötigte Menge direkt vor dem Ausführen der EAGs in die Kochsalzlösung (ca. 50 ml pro Experiment).</li>
</ol>2. Geruchsvorbereitung und -lagerung
<ol><li>Bereiten Sie die Geruchsstoffmischungen oder Einzelverbindungsverdünnungen im Voraus in 1,5-ml-Bernsteinfläschchen vor und lagern Sie sie bei -20 °C, um einen Abbau der Verbindung zu verhindern. HINWEIS: Die Konzentrationen hängen vom durchzuführenden Test ab. 0,1% oder 1% werden üblicherweise verwendet, um zu bestimmen, ob eine Verbindung nachgewiesen werden kann oder nicht. Bereiten Sie für eine Dosis-Wirkungs-Kurve serielle Verdünnungen einer bestimmten Chemikalie vor und testen Sie sie von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdünnungen in Wasser, Ethanol, Hexan, Paraffinöl oder Mineralöl vor, abhängig von der Löslichkeit der getesteten Chemikalie.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Sie eine Lösungsmittelkontrolle (eine Durchstechflasche, die nur das Lösungsmittel enthält) für das Experiment vorbereiten.</li>
	<li>Nehmen Sie die Geruchsstoffe 30 Minuten vor Beginn der Experimente aus dem Gefrierschrank, damit sie auftauen können. Vortexen Sie jedes Fläschchen vor dem Gebrauch, um die Chemikalie und das Lösungsmittel gut zu mischen.</li>
	<li>Pipettieren Sie 10 μl Lösung auf ein Stück Filterpapier (0,5 cm x 2 cm), das in eine beschriftete Glasspritze oder Pasteurpipette eingelegt ist.</li>
	<li>Füllen Sie jede Verbindung oder Mischung in eine spezielle Pasteur-Pipette oder -Spritze, um eine Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: Laden Sie 10 Minuten vor Beginn des Experiments, damit der Geruch in der Spritze diffundieren kann, jedoch nicht länger, um eine Verschlechterung zu verhindern. Lassen Sie die Pasteur-Pipette oder -Spritze zu diesem Zeitpunkt verschlossen bleiben, um eine gute Diffusion der Chemikalie zu ermöglichen, bevor das Experiment beginnt.</li>
	<li>Entsorgen Sie nach jedem EAG-Lauf das Stück Filterpapier und ersetzen Sie es durch ein neues, um zu verhindern, dass das Papier übernässt wird und eine Verstopfung der Nadel riskiert. Ersetzen Sie die Nadeln regelmäßig (alle 10 Durchläufe).</li>
</ol>3. Mückentrennung
<ol><li>Isolieren Sie die Mücken am Tag der Experimente.</li>
	<li>Verwenden Sie Mücken, die am Tag der Experimente mindestens 6 Tage alt sind, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass die Weibchen gepaart werden, um ihre Reaktion auf wirtsbezogene Geruchsstoffe zu verbessern. HINWEIS: Passen Sie das Alter der Mücken zum Zeitpunkt des Tests je nach Projekt an. Überprüfen und harmonisieren Sie den physiologischen Status (z. B. blutgefüttert, ausgehungert, noch nie zuvor gefüttert usw.).</li>
	<li>Verhungern Sie die Mücken bis zu 12 h (d.h. kein Zugang zu Zucker), um ihre Motivation und Empfindlichkeit zu erhöhen.</li>
	<li>Stellen Sie den Moskitobehälter in den Kühlschrank (4 °C), bis er aufhört zu fliegen, damit die Personen leicht mit einer Pinzette in einzelne Tassen umgefüllt werden können. HINWEIS: Arten mit einer höheren Kältetoleranz können mit einem CO2 - Fliegenpad eingeschläfert werden. Stellen Sie sicher, dass die Mücken nicht lange darauf bleiben, um eine Austrocknung zu verhindern, die die Reaktionsfähigkeit des Mücken-EAG-Präparats verringern würde.</li>
	<li>Lagern Sie die Tassen mit einzelnen Mücken bei Raumtemperatur, bevor die EAGs durchgeführt werden, und entsorgen Sie alle Mücken, die tagsüber nicht verwendet werden dürfen.</li>
</ol>4. Elektrodenhalter und Kapillarvorbereitung
<ol><li>Kapillarziehen, -aufbereitung und -lagerung<ol><li>Verwenden Sie Borosilikatkapillaren mit Filamenten (Innendurchmesser: 0,78 mm, Außendurchmesser: 1 mm). Ziehen Sie sie je nach Ausrüstung27. HINWEIS: Bewahren Sie die gezogenen Kapillaren in einer Petrischale auf. Stellen Sie die Petrischale auf Wachsstücke oder unparfümierte Modelliermasse, damit sie sich nicht bewegen und zerbrechen.</li>
		<li>Brechen Sie vor dem Ausführen des EAG-Experiments vorsichtig die Spitze von 2 Kapillaren mit einer Pinzette unter dem Mikroskop. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine etwas größer als die andere ist, um entweder in den Hals (größere Kapillare) oder in die Spitzen der Antennen (kleinere Kapillare) zu passen. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt sauber ist und keine Risse an der Kapillarwand vorhanden sind. Dies erfordert Geduld und Übung.</li>
		<li>Wenn sie noch intakt sind, verwenden Sie diese Kapillaren nach dem Spülen mit deionisiertem (DI) Wasser nach Beendigung des Experiments wieder. Entfernen Sie das überschüssige Wasser, indem Sie vorsichtig ein Reinigungstuch gegen die Spitze auftragen. Petrischale wieder einlagern. Wenn die Spitze schief ist, entsorgen Sie die Kapillare.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrodenhalter und Kapillarbefestigung<ol><li>Beschriften Sie die beiden Elektrodenhalter als "Aufzeichnung" und "Referenz", indem Sie Laborklebebänder in verschiedenen Farben verwenden. Dies hilft bei der Montage des Moskitokopfes und der Elektroden.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Elektrodenhalter innen frei sind und keine Borosilikatrückstände vorhanden sind.</li>
		<li>Chloridisierung: Die Silberdrähte der Elektrodenhalter ca. 5 min in reinem Bleichmittel einweichen. Die Drähte verfärben sich von glänzendem Hellgrau zu mattem Dunkelgrau.</li>
		<li>Lösen Sie den Gummistopfen und füllen Sie die Innenseite der Kapillare mit einer 20-G-Nadel mit 10% iger Kochsalzlösung.</li>
		<li>Füllen Sie die Borosilikatkapillare mit einer Spritze mit der Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass weder im Elektrodenhalter noch in der gezogenen Kapillare Blasen vorhanden sind. HINWEIS: Um die Wahrscheinlichkeit von Blasen in der Kapillare zu verringern, drücken Sie weiterhin Kochsalzlösung in die Kapillare, während Sie die Nadel vorsichtig herausziehen, und verwenden Sie Kapillaren mit einem Filament. Es ist möglich, die Kapillaren mit einer Lösung aus 1:3-Elektrodengel und Kochsalzlösung zu beladen. Dies kann dazu beitragen, die Verdunstung der Kochsalzlösung zu verhindern und kann besonders beim Erlernen und Üben von EAGs nützlich sein, da der Experimentator mehr Zeit benötigt, um die verschiedenen Schritte auszuführen.</li>
		<li>Spülen Sie die Silberdrähte nach dem Einweichen mit DI-Wasser ab und führen Sie sie in die beiden Kapillaren ein. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des Drahtes weniger als 1 mm von der Spitze der Kapillare entfernt ist. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare den Gummiring im Elektrodenhalter passiert, ohne zu brechen. Ziehen Sie den Gummistopfen vorsichtig fest. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.</li>
		<li>Verwenden Sie die Kapillare mit der breiteren Öffnung am Referenzelektrodenhalter (Hals) und der kleineren Öffnung am Aufzeichnungselektrodenhalter (Antennen).</li>
		<li>Lassen Sie die beiden montierten Elektrodenhalter auf einem feuchten Reinigungstuch, um ein Austrocknen der Spitze zu verhindern, bis Sie bereit sind, den Kopf zu montieren.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Vorbereitung des EAG-Bohrgeräts (Abbildung 1)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass der Lufttisch oben ist, dass es keine Verstopfung in der Fluggesellschaft gibt. Stellen Sie sicher, dass der Tank mit medizinischer Luft noch voll ist, um zu vermeiden, dass er mitten im Experiment gewechselt wird. Stellen Sie sicher, dass sich Blasen im Luftbefeuchter befinden.</li>
	<li>Luft- und Impulsabgabesystem<ol><li>Schalten Sie den medizinischen Luftgastank ein.</li>
		<li>Überprüfen Sie den Füllstand der beiden Durchflussmesser. HINWEIS: Der Durchflussmesser, der den Hauptluftstrom steuert, der das Präparat während des gesamten Experiments badet, sollte 140 ml/min betragen, und der andere, der sich auf den Geruchsimpuls bezieht, sollte 15 ml/min anzeigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn Sie GC-EAD durchführen, schalten Sie die Maschine und die Gastanks ein und erstellen/laden Sie die Datei/Methode.</li>
	<li>Schalten Sie die Computer, die Softwareanwendungen und die Stromversorgung des Ventils ein, und überprüfen Sie die Internetverbindung, damit die Softwareanwendung funktioniert.<ol><li>Softwareanwendung: Ein kurzes Skript kann geschrieben werden, um den Puls zu liefern.</li>
		<li>EAG-Software: Verwenden Sie eine beliebige Elektrophysiologie-Software.</li>
		<li>Implementieren Sie die Parameter in der Software (z. B. Verstärker, Dauer der Aufnahme, Dauer der Impulse usw.).</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie einen Steuerimpuls ab, um zu überprüfen, ob das Ventil, das die Impulse liefert, funktionsfähig ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Stromversorgung auf 5,2 V ein. Überprüfen Sie die Verstärkerparameter. HINWEIS: Die Parameter, die für die hier dargestellten Daten verwendet werden, sind: niedriger Cut-off-Filter von 0,1 Hz; hoher Trennfilter von 500 Hz; Verstärkung von x100.</li>
</ol>6. Vorbereitung und Montage des Moskitokopfes (Abbildung 2)
<ol><li>Legen Sie eine Aluminiumplatte auf Eis und legen Sie ein Stück Nassreinigungstuch darüber.</li>
	<li>Legen Sie einen kleinen Klecks Elektrodengel in eine Ecke.</li>
	<li>Stellen Sie einen Mückenbecher auf Eis und lassen Sie die Mücke einige Minuten abkühlen oder bis sie aufhört zu fliegen. HINWEIS: Einige Arten sind kälteresistent und erfordern möglicherweise eine schnelle Anästhesie über einem CO2 - Fliegenpad, um nach unten zu gehen. Je wenigstens die Mücke an einem der beiden bleibt, desto besser.</li>
	<li>Legen Sie die Mücke auf den Rücken und befestigen Sie die Spitze jeder Antenne (nur einen kleinen Teil des letzten Segments) mit einer Mikroschere.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mücke neben den Elektrodengelklecks zu ziehen, und tauchen Sie die Spitze jeder Antenne vorsichtig in das Gel. Vermeiden Sie es, mehr als nur das allerletzte Segment in das Elektrodengel zu tauchen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Mückenantennen mit einer Pinzette heraus, während Sie sie nebeneinander halten. Lassen Sie sie zusammen aus dem Gel herauskommen. Achten Sie darauf, dass die Antennen die Oberfläche des Reinigungstuchs nicht berühren, da sie sich sonst trennen könnten.</li>
	<li>Legen Sie die Mücke auf die Seite und hacken Sie den Kopf mit einer Mikroschere oder einer Rasierklinge. HINWEIS: Sobald der Kopf gehackt ist, fahren Sie schnell mit den nächsten Schritten und dem EAG-Rig fort, um die Aufnahmen zu starten. Das Präparat sollte etwa 30 Minuten ansprechbar bleiben.</li>
	<li>Nehmen Sie die Referenzelektrode und vertiefen Sie die Spitze vorsichtig in das Gel. Bleiben Sie in Kontakt mit Nackentüchern und lassen Sie den Kopf daran kleben.</li>
	<li>Bewegen Sie die Elektrodenhalter unter das EAG-Mikroskop und schauen Sie durch das Mikroskop, um die Kopfelektrode (d. h. Referenzelektrode) auf einem Mikromanipulator zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Antennen in der Mitte befinden.</li>
	<li>Schnappen Sie sich die Aufnahmeelektrode und platzieren Sie sie vor den Antennenspitzen. Bewegen und richten Sie es mit dem Mikromanipulator so nah wie möglich an den Spitzen aus. Bewegen Sie mit dem Mikroskop die Spitze der Aufzeichnungselektrode in Richtung der Antennen.</li>
	<li>Schließen Sie beide Elektrodenhalter vor dem Einsetzen der Spitzen an den Verstärker an, um zu verhindern, dass sie sich nach dem Einsetzen bewegen.</li>
	<li>Stecken Sie die Antennenspitzen in die Aufnahmeelektrode. Stellen Sie sicher, dass sie nur mit der Kochsalzlösung und dem Elektrodengel in Kontakt kommen und durch Transparenz durch die Kapillare sichtbar sind. Die Antenne geht durch den "Saugeffekt" hinein.</li>
	<li>Passen Sie die Position des Kopfes und der Spitzen bei Bedarf mit einer Pinzette unter dem Mikroskop an.</li>
	<li>Platzieren Sie den Airline-Schlauch in der Nähe des Moskitokopfpräparats (Abstand: 1 cm). HINWEIS: Wenn der Kopf abfällt, kehren Sie zur Sezierstation zurück und montieren Sie den Kopf wieder oder bereiten Sie einen neuen vor, wenn er verloren gegangen ist oder wenn seit dem Abschneiden des Kopfes mehr als 5 Minuten vergangen sind. Eine gute Verbindung zwischen der Kapillare und dem Hals/den Antennen ist für eine rauscharme und zuverlässige Aufnahme unerlässlich. Idealerweise befinden sich die Antennenspitzen nach dem Einführen weniger als 1 mm vom Draht der Aufzeichnungselektrode entfernt.</li>
	<li>Schalten Sie die Lichtquelle aus, falls verwendet.</li>
	<li>Positionieren Sie die Vakuumleitung in der Nähe des Moskitokopfpräparats (Abstand: 20 cm) und richten Sie sie an der Hauptfluggesellschaft aus. HINWEIS: Das Vakuum hilft dabei, Chemikalien zu entfernen, die die Kopfvorbereitung nach dem Stimulus umgeben, was zu EAG-Reaktionen führen kann, nachdem die Impulse angewendet wurden.</li>
</ol>7. Aufnahmen
<ol><li>Schalten Sie nach dem Einsetzen der Antennenspitzen den Verstärker und den Rauschreduzierer ein. Beachten Sie das Basissignal und stellen Sie sicher, dass es nicht verrauscht ist. HINWEIS: Beobachten Sie, ob große Schwingungen im elektrischen Signal vorhanden sind. Passen Sie die Position der Kopf- und Antennenspitzen nach Bedarf an, bis das Signal sauber ist. Verwenden Sie Krokodilklemmen, um alles zu erden, was Geräusche in den Faradayschen Käfig oder Lufttisch bringt. Ein Basisliniensignal mit einer Amplitude von weniger als 0,01 mV ist ideal für die Erkennung und Unterscheidung winziger EAG-Antworten.</li>
	<li>Sobald der Geräuschpegel zufriedenstellend ist, führen Sie die erste Geruchsspritze zum Testen in das Airline-Loch ein.</li>
	<li>Schließen Sie den Faradayschen Käfig. Bleiben Sie nicht vor dem Präparat, um den Lärm zu reduzieren.</li>
	<li>Klicken Sie auf In der EAG-Software aufzeichnen.</li>
	<li>Liefern Sie den/die Impuls(e) mit der Softwareanwendung. HINWEIS: Die Anzahl und Dauer der Impulse variiert je nach Experiment. Hier wurden einzelne 1 s. Hülsenfrüchte pro Odorant verwendet. Die Geruchsstoffe wurden durch 45 s getrennt.</li>
	<li>Beachten Sie die Reaktion der Moskitoantennen im Labornotizbuch. HINWEIS: Wenn der Geruchsstoff von den Moskitoantennen erkannt wird, wird eine deutliche Ablenkung des Signals beobachtet (siehe Abbildung 3A).</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Geruch oder der nächsten Konzentration fort. Vergessen Sie nicht, die Präsentation von Geruchsstoffen zu randomisieren, es sei denn, es wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve durchgeführt. HINWEIS: In den Experimenten sollten eine Negativkontrolle und eine Positivkontrolle verwendet werden. Dadurch wird sichergestellt, dass es sich bei den beobachteten Reaktionen tatsächlich um Geruchsreaktionen handelt und nicht um mechanisches oder elektrisches Rauschen.</li>
	<li>Wenden Sie am Ende der Aufnahme eine positive Kontrolle an, um zu überprüfen, ob die Antennen noch ansprechbar sind. HINWEIS: Verwenden Sie 0,1% oder 1% Benzaldehyd, da alle bisher getesteten Mückenarten auf diese Verbindung ansprechen.</li>
	<li>Fahren Sie mit der nächsten Mückenvorbereitung fort.</li>
</ol>8. Reinigung
<ol><li>Schalten Sie den Verstärker, den Rauschreduzierer, die Fluggesellschaft und den Computer aus.</li>
	<li>Legen Sie die Geruchsstoffe wieder in den Gefrierschrank.</li>
	<li>Entfernen Sie die Filterpapiere von den Glasspritzen und reinigen Sie sie mit 100% Ethanol, wenn Rückstände an den Wänden sichtbar sind. Über Nacht auf einem Reinigungstuch trocknen lassen.</li>
	<li>Reinigen Sie die Elektrodenhalter mit DI-Wasser, um mögliche Spuren von Salz zu entfernen. Trocknen Sie, indem Sie es vorsichtig auf ein Stück Reinigungstuch auftragen.</li>
	<li>Mückenreste in den Gefrierschrank stellen und 24 Stunden später entsorgen. HINWEIS: Wenn Sie mit infizierten Mücken arbeiten, befolgen Sie die Sicherheitsanforderungen in Ihrer Einrichtung.</li>
</ol>9. Datenanalysen
<ol><li>Messen Sie die EAG-Antworten entweder manuell oder automatisch. HINWEIS: Hier wird die EAG-Amplitude (-mV) gemessen. Mittelwert, wenn für jede Verbindung mehrere Impulse angelegt wurden. Je nach verwendeter Software können EAGs automatisch erkannt und gemessen werden. Es ist jedoch wichtig, jede Antwort einzeln zu überprüfen, um die Form der Antwort zu überprüfen und die mögliche Verschleppung, verzögerte Reaktion usw. zu bewerten. Die ideale EAG-Reaktion ist auf den Puls ausgerichtet, zeigt eine deutliche Auslenkung und ist zwischen den Mückenpräparaten wiederholbar (Abbildung 3).</li>
	<li>Präsentieren Sie die Rohdaten, um minimale Variabilität, ein rauscharmes Signal und klare Antworten zu zeigen (Abbildung 3B). HINWEIS: Die Daten können auch normalisiert werden (z. B. Z-Score). Der negative Kontrollwert (z. B. Mineralöl) (d. h. der Ausgangswert) kann von der Antwortvariablen subtrahiert werden und sollte, falls nicht, in den Abbildungen angegeben werden. Eine Positivkontrolle sollte ebenfalls vorgelegt werden.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analysen mit einer beliebigen Statistiksoftware durch28.</li>
</ol>

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</ol>

Der Autor hat nichts zu offenbaren.

Geruchsvermitteltes Verhalten wird von vielen Faktoren beeinflusst, einschließlich physiologischer (z. B. Alter, Tageszeit) und umweltbedingter Faktoren (z. B. Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit)30. Daher ist es bei der Durchführung von EAGs wichtig, Insekten zu verwenden, die sich im gleichen physiologischen Zustand befinden (d. h. Überwachung auf Alter, Hunger, Paarung)31 und auch eine warme und feuchte Umgebung um das Präparat herum aufrechtzuerhalten, um Austrocknung...

Moskitos sind die tödlichsten Organismen der Erde, fordern das Leben von mehr als einer Million Menschen pro Jahr und setzen mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung dem Risiko aus, den von ihnen übertragenen Krankheitserregern ausgesetzt zu sein, während sie beißen1. Diese Insekten verlassen sich auf eine Vielzahl von Hinweisen (d.h. thermisch, visuell, mechanisch, olfaktorisch, auditiv), um einen Wirt zu finden, von dem sie sich ernähren können (sowohl Pflanzen als auch Tiere), für die Paarung und Eiablage sowie um Fressfeinde sowohl im Larven- als auch im Erwachsenenstadium zu vermeiden 2,3. Unter diesen Sinnen spielt der Geruchssinn eine entscheidende Rolle bei den oben genannten Verhaltensweisen, insbesondere bei der mittel- bis langstreckenweiten Detektion von Geruchsmolekülen 2,3. Gerüche, die von einem Wirt oder einer Eiablagestelle emittiert werden, werden von verschiedenen spezifischen Geruchsrezeptoren (z. B. GRs, ORs, IRs) detektiert, die sich auf den Klischees, den Tarsen und den Antennen 2,3 befinden.
Da der Geruchssinn eine Schlüsselkomponente ihres Verhaltens bei der Suche nach Wirten (Pflanzen und Tieren), der Paarung und der Eiablage ist, stellt er daher ein ideales Ziel dar, um neue Werkzeuge zur Mückenbekämpfung zu entwickeln4. Die Forschung an Repellentien (z. B. DEET, IR3535, Picaridin) und Ködern (z. B. BG Sentinel Human Lure) ist äußerst produktiv5, aber aufgrund der aktuellen Herausforderungen bei der Mückenbekämpfung (z. B. Insektizidresistenz, invasive Arten) ist es wichtig, neue effiziente Bekämpfungsmethoden zu entwickeln, die auf der Mückenbiologie basieren.
Viele Techniken (z. B. Olfaktometer, Landeassays, Elektrophysiologie) wurden verwendet, um die Bioaktivität von Verbindungen oder Mischungen von Verbindungen in Moskitos zu bewerten. Unter ihnen kann die Elektroantennographie (oder Elektroantennogramme (EAGs)) verwendet werden, um festzustellen, ob die Geruchsstoffe von den Mückenantennen erkannt werden. Diese Technik wurde ursprünglich von Schneider6 entwickelt und wurde seitdem in vielen verschiedenen Insektengattungen eingesetzt, darunter Motten 7,8,9, Hummeln 10,11, Honigbienen 12,13 und Fruchtfliegen 14,15, um nur einige zu nennen. Die Elektroantennographie wurde auch unter Verwendung verschiedener Protokolle eingesetzt, einschließlich einzelner oder mehrerer Antennen in Moskitos 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Mücken sind relativ kleine und zarte Insekten mit eher dünnen Antennen. Während die Durchführung von EAGs bei größeren Insekten wie Motten oder Hummeln aufgrund ihrer größeren Größe und dickeren Antennen relativ einfach ist, kann die Durchführung von EAGs bei Mücken eine Herausforderung darstellen. Insbesondere die Aufrechterhaltung eines guten Signal-Rausch-Verhältnisses und eine dauerhaft reaktionsschnelle Aufbereitung sind zwei wesentliche Anforderungen an die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Daten.
Die hier vorgeschlagene Schritt-für-Schritt-Anleitung für rauscharme EAGs bietet direkt Lösungen für diese Einschränkungen und macht dieses Protokoll auf mehrere Mückenarten aus verschiedenen Gattungen anwendbar, darunter Aedes, Anopheles, Culex und Toxorhynchites, und beschreibt die Technik sowohl für Frauen als auch für Männer. Die Elektroantennographie bietet eine schnelle und dennoch zuverlässige Möglichkeit, bioaktive Verbindungen zu screenen und zu bestimmen, die dann bei der Köderentwicklung genutzt werden können, nachdem die Valenz mit Verhaltensassays bestimmt wurde.

<table><tbody><tr><td>Lufttisch Clean Bench</td><td>TMC</td><td>https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess</td><td>Geräuschreduzierung</td></tr><tr><td>Analog-Digital-Platine</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Flowbuddy Complete</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>Zur Betäubung von Mücken</td></tr><tr><td>Borosilcatglas Kapillare</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-78-10</td><td>Zur Erstellung der Aufzeichnung und Referenzen Kapillaren</td></tr><tr><td>Chemikalien</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Benzaldehyd: 418099-100 mL; Buttersäure: B103500-100 ml; 1-Hexanol: 471402-100 ml; Mineralöl: M8410-1L</td><td>Chemikalien, die für die hier vorgestellten Experimente verwendet wurden</td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas oder Praxair</td><td>N/A</td><td>Zur Betäubung von Mücken</td></tr><tr><td>Kaltlichtquelle</td><td>Volpi</td><td>NCL-150</td><td></td></tr><tr><td>Einwegspritzen</td><td>BD</td><td>1 mL (309628)&nbsp; / 3 mL (309657)</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenkabel</td><td>World Precision Instruments</td><td>5371</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodengel salzfrei</td><td>Parkerlabs</td><td>12-08-Spectra-360</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>TMC</td><td>https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages</td><td>Geräuschreduzierer</td></tr><tr><td>Durchflussmesser</td><td>Bel-art</td><td>65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)</td><td>Je ein</td></tr><tr><td>GCMS-Fläschchen und eine Kappe</td><td>Thermo-fisher scientific</td><td>2-SVWKA8-CPK</td><td>Zur Herstellung von Odormittelverdünnungen</td></tr><tr><td>Glasspritzen (Fortuna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314307</td><td>Für die Geruchsabgabe an die EAG-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Humbug</td><td>Quest Scientific</td><td>http://www.quest-sci.com/</td> <td>Geräuschreduzierer</td></tr><tr><td>2 mm Klinkenhalter, schmal, 90 Grad, mit Draht</td><td>A-M Systeme</td><td>675748</td><td>Elektrodenhalter</td></tr><tr><td>Magnetfüße</td><td>Kanetec</td><td>MB-FX</td><td>x 2</td></tr><tr><td>MATLAB + Werkzeugkästen</td><td>Mathworks</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Für die Abgabe von Impulsen</td></tr><tr><td>Medizinische Luft</td><td>Airgas oder Praxair</td><td>N/A</td><td>Für das Mikroskop der Hauptfluggesellschaft</td></tr><tr><td></td><td>Nikkon</td><td>SMZ-800N</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren Dreiachsiger Grob-/Fein-Kompakt-Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Mikroelektrodenverstärker mit Kopftisch</td><td>A-M Systeme</td><td>Modell 1800</td><td></td></tr><tr><td>Mückenzuchtzubehör</td><td>Bioquip</td><td>https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln</td><td>BD</td><td>25G (305127) / 21G (305165)</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Für die Geruchsabgabe an die EAG-Vorbereitung</td></tr><tr><td>PTFE-Schläuche mit verschiedenen Durchmessern</td><td>Mc Master Carr</td><td>N/A</td><td>Zum Anschluss des Magnetventils, Durchflussmesser, Fluggesellschaft ect.</td></tr><tr><td>30V/5A DC Netzteil</td><td>Dr. Meter</td><td>PS-305DM</td><td></td></tr><tr><td>R Version 3.5.1</td><td>R Projekt</td><td>https://www.r-project.org/</td> <td>Für Datenanalysen</td></tr><tr><td>Relais für Magnetventil</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Silberdraht 0,01"</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Magnetventil (3-Wege)</td><td>The Lee Company</td><td>LHDA0533115H WinEDR-Software</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strathclyde Elektrophysiologie-Software</td><td>WinEDR V3.9.1</td><td>Für EAG-Aufzeichnung</td></tr><tr><td>Whatman-Papier</td><td>Cole Parmer</td><td>UX-06648-03</td><td>Zum Laden von Chemikalien in Glasspritzen / Pasteurpipette</td></tr></tbody></table>

eine schritt-für-schritt-anleitung zur mücken-elektroantennographie

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Weibliche Mücken sind die tödlichsten Tiere der Erde und fordern jedes Jahr das Leben von mehr als 1 Million Menschen aufgrund von Krankheitserregern, die sie beim Erwerb einer Blutmahlzeit übertragen. Um einen Wirt zu finden, von dem sie sich ernähren können, verlassen sich Mücken auf eine Vielzahl von sensorischen Reizen, darunter visuelle, mechanische, thermische und olfaktorische. Die Studie beschreibt eine Technik, die Elektroantennographie (EAG), mit der Forscher beurteilen können, ob die Mücken einzelne Chemikalien und Chemikalienmischungen konzentrationsabhängig erkennen können. In Verbindung mit der Gaschromatographie (GC-EAG) ermöglicht diese Technik, die Antennen einem vollständigen Headspace/Komplex-Gemisch auszusetzen und zu bestimmen, welche Chemikalien in der interessierenden Probe vorhanden sind, die die Mücke nachweisen kann. Dies gilt sowohl für Wirtskörpergerüche als auch für pflanzliche Blumensträuße oder andere ökologisch relevante Gerüche (z.B. Eiablagestellen, Geruchsstoffe). Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das eine lange Dauer der Reaktionszeit der Vorbereitung ermöglicht und sowohl auf weibliche als auch auf männliche Mücken aus mehreren Gattungen anwendbar ist, darunter Aedes-, Culex-, Anopheles- und Toxorhynchites-Mücken . Da der Geruchssinn eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen Mücken und Wirt und der Stechmückenbiologie im Allgemeinen spielt, können EAGs und GC-EAG Verbindungen aufdecken, die für die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Krankheitsvektoren (z. B. Köder) von Interesse sind. Ergänzt durch Verhaltensassays kann die Wertigkeit (z. B. Lockstoff, Abwehrmittel) jeder Chemikalie bestimmt werden.

Die Elektroantennographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um festzustellen, ob eine Chemikalie oder ein Chemikaliengemisch von einer Insektenantenne erkannt wird. Es kann auch verwendet werden, um die Nachweisschwelle für eine bestimmte Chemikalie unter Verwendung einer allmählichen Erhöhung der Konzentration zu bestimmen (d. h. Dosiskurven-Wirkungs-Wirkung, Abbildung 4B). Darüber hinaus ist es sinnvoll, die Auswirkungen von Repellentien auf die Reaktion auf wirtsbezogene Gerüche<sup clas...

Der vorliegende Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für erfolgreiche und rauscharme Elektroantennogramme bei verschiedenen Gattungen von Mücken, einschließlich Weibchen und Männchen.

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Für die Elektroantennographie ist die Verwendung von Mücken in einem bestimmten und konsistenten physiologischen Status entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll ermöglicht dauerhafte elektroantennographische Aufzeichnungen bei Stechmücken. Die Methode kann bei verschiedenen Mückenarten und sowohl bei Männern als auch bei Frauen angewendet werden.Die elektroantennographische Technik kann auch auf andere Insektenmodelle übertragen werden, darunter Käfer, Fliegen, küssende Käfer und Ameisen. Entfernen Sie zunächst die 1,5-Milliliter-Bernsteinfläschchen mit den Geruchsmischungen und einer Lösungsmittelkontrolle aus dem 20-Grad-Celsius-Gefrierschrank, in dem sie aufbewahrt werden, um eine Verschlechterung zu verhindern. Als nächstes pipettieren Sie 10 Mikroliter der Geruchslösung auf ein Stück Filterpapier, das in eine beschriftete Glasspritze eingelegt ist.Isolieren Sie die Mücken am Tag des Experiments. Brechen Sie unter dem Mikroskop vorsichtig die Spitze von zwei Borosilikatkapillaren mit Filamenten mit einer Pinzette. Stellen Sie vor dem Ausführen der Elektroantennographie oder des EAG-Experiments sicher, dass die Elektrodenhalter innen frei sind und keine Borosilikatrückstände vorhanden sind.Führen Sie dann eine Chloridisierung durch, indem Sie die Silberdrähte der Elektrodenhalter fünf Minuten lang in reinem Bleichmittel einweichen, bis die Drähte dunkel und mattgrau werden. Spülen Sie dann die Drähte aus. Lösen Sie den Gummistopfen und füllen Sie mit einer 20-Gauge-Nadel das Innere der Kapillare mit Kochsalzlösung.Spülen Sie die Kapillaren aus und führen Sie die Drähte in die beiden Kapillaren ein. Halten Sie die Spitze des Drahtes weniger als einen Millimeter von der Spitze der Kapillare entfernt. Führen Sie die Kapillare durch den Gummiring im Elektrodenhalter, ohne ihn zu brechen, und ziehen Sie den Gummistopfen vorsichtig fest, nachdem Sie sich vergewissert haben, dass keine Luftblasen vorhanden sind.Verwenden Sie die Kapillare mit der breiteren Öffnung am Referenzelektrodenhalter und der kleineren Öffnung am Aufnahmeelektrodenhalter. Lassen Sie die beiden montierten Elektrodenhalter auf einem feuchten Reinigungstuch, um ein Austrocknen der Spitze zu verhindern, bis Sie bereit sind, den Kopf zu montieren. Stellen Sie sicher, dass der Lufttisch oben ist.Es gibt keine Blockade in der Fluggesellschaft und die Luft ist eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass der Tank mit medizinischer Luft voll ist, um zu vermeiden, dass er mitten im Experiment gewechselt wird, und bestätigen Sie Blasen im Luftbefeuchter. Schalten Sie die Computer, die Softwareanwendungen und die Stromversorgung des Ventils ein.Nachdem Sie die Internetverbindung überprüft haben, geben Sie einen Steuerimpuls ab, um zu überprüfen, ob das Ventil, das die Impulse liefert, funktionsfähig ist. Legen Sie eine Aluminiumplatte mit einem Stück Nassreinigungstuch auf Eis und legen Sie einen kleinen Klecks Elektrodengel in eine Ecke. Stellen Sie einen Mückenbecher auf Eis, damit die Mücke abkühlen kann.Befestigen Sie die Spitze jeder Antenne der Mücke mit einer Mikroschere. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mücke neben den Elektrodengelklecks zu ziehen, und tauchen Sie die Spitze jeder Antenne vorsichtig in das Gel. Ziehen Sie die Mückenantennen mit einer Pinzette heraus und halten Sie sie nebeneinander.Hacken Sie den Kopf der Mücke mit einer Mikroschere. Tauchen Sie die Spitze der Referenzelektrode vorsichtig in das Gel und bringen Sie es in Kontakt mit dem Hals, wobei Sie den Kopf daran kleben lassen. Platzieren Sie die Referenzkopfelektrode auf einem Mikromanipulator.Schließen Sie beide Elektrodenhalter an den Verstärker an. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Aufzeichnungselektrode so nah wie möglich an den Antennenspitzen zu platzieren. Stecken Sie dann die Antennenspitzen in die Aufnahmeelektrode.Platzieren Sie den Airline-Schlauch in der Nähe der Moskitokopfvorbereitung in einem Zentimetermeter. Schalten Sie den Verstärker und den Rauschreduzierer ein und stellen Sie sicher, dass das Basissignal nicht verrauscht ist. Sobald der Geräuschpegel zufriedenstellend ist, führen Sie die erste Geruchsspritze in das Airline-Loch ein, um den Test durchzuführen und den Faradayschen Käfig zu schließen.Klicken Sie dann in der EAG-Software auf Aufzeichnen, um den Impuls zu liefern. Messen Sie die EAG-Antworten als Amplitude in Millivolt und fahren Sie dann mit dem nächsten Geruch oder der nächsten Konzentration fort. Das Experiment zeigt erfolgreich, dass Mückenarten unterschiedliche Geruchsreaktionen auf verschiedene Chemikalien zeigen können.Es gab keine Reaktion auf das Mineralöl, das als Negativkontrolle verwendet wurde. Fehler in den Ergebnissen aufgrund von elektrischem Rauschen können reduziert werden, indem die Elemente mit Krokodilklemmen am Faradayschen Käfig geerdet werden. Die Reaktionsschwelle auf denselben Geruchsstoff kann für verschiedene Mückenarten unterschiedlich groß sein.Zum Beispiel produzieren Toxorhynchites rutilus septentrionalis-Mücken im Vergleich zu Aedes aegypti, Anopheles stephensi und Culex quinquefasciatus sehr große EAGs. Es wurde eine große Auslenkung als Reaktion auf die Positivkontrolle, Benzaldehyd, festgestellt. Während es an Reaktion auf die Negativkontrolle mangelte, Mineralöl.Diese durchschnittlichen Antennenreaktionen sind in einem Balkendiagramm dargestellt. Zusätzlich wurde die Schwelle für den Nachweis einer bestimmten Chemikalie für jede Mückenart bestimmt, indem die Antenne, die steigenden Konzentrationen der Chemikalie und eine Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt wurden. Es ist wichtig, die Aufnahme so schnell wie möglich zu starten, nachdem der Kopf gehackt und montiert wurde, um eine gute Reaktionsfähigkeit des Präparats zu gewährleisten.Mit EAG kann festgestellt werden, ob die Mückenantennen bei einer bestimmten Konzentration auf eine bestimmte Chemikalie reagieren. Es erlaubt jedoch nicht, das Gleichgewicht dieser Chemikalie zu bestimmen. Zum Beispiel, ob es sich um einen Lockstoff oder eine Reue handelt.

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Research

Forschung

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Biologie

Elektrophysiologische Reaktionen der Riechzellen auf Duftstoffe können bei Insekten mit einzelnen Sensillum Aufnahmen gemessen werden. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie man einzelne Sensillum Aufnahmen in den Antennen der Fruchtfliege führen...

Einzel Sensillum Recordings in der Insekten Drosophila melanogaster Und Anopheles gambiae</em

Insect olfaktorischen Systeme bieten einzigartige Möglichkeiten für die Aufnahme Riechstoff-induzierten Reaktionen in den Formen der Elektroantennogramme (EAG) und Single Sensillum Aufnahmen (SSR), die Antworten zusammengefasst sind von allen Geruchsrezeptor Neuronen (ORNs) an der Antenne befindet und von denen in einzelnen untergebracht Sensillen, jeweils.

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Geruchssinn vermitteln viele verschiedene Verhaltensweisen bei Insekten, und sind oft komplexe Mischungen von Dutzenden bis Hunderten von flüchtigen Verbindungen bestehen. Mittels Gaschromatographie mit Multi-Kanal-Aufnahme in das Insekt Antennallobus beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von biologisch aktiven Verbindungen.

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Wir präsentieren ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Implantation von Elektroden in Manduca sexta während ihrer frühen metamorphen Stadien. Diese Technik ermöglicht eine mechanisch stabile und elektrisch zuverlässige Kopplung mit dem neuromuskulären Gewebe, um die Dynamik der Flugneurophysiologie zu untersuchen. Wir stellen auch eine neuartige Magnetschwebeplattform für angebundene Studien des Insektengierens vor.

Frühe Metamorphic Insertion Technologie für Fluginsektenverhaltensüberwachung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Verwendung von Insektenantennen in Form von Elektroantennogrammen (EAGs) auf autonomen Robotern. Unser experimentelles Design ermöglicht stabile Aufzeichnungen innerhalb eines Tages und löst einzelne Geruchspatches bis zu 10 Hz auf. Die Effizienz von EAG-Sensoren für die olfaktorische Suche wird demonstriert, indem ein Roboter zu einer Geruchsquelle gefahren wird.

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Mit beiden Methoden, die Genexpression in den großen Geschmacks Anhängsel Aedes aegypti schätzen, haben wir den Satz von Genen, die mutmaßlich zugrunde liegenden neuronalen Antworten zu bitter und abstoßend Verbindungen identifiziert, wie durch elektrophysiologische Untersuchung bestimmt.

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Dieses Protokoll beschreibt Methoden hinter dem Ramsay-Assay, ionenselektiven Mikroelektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) und In-vitro-Kontraktionsassays, die zur Untersuchung des adulten Moskito-Ausscheidungssystems, bestehend aus den Malpigh-Tubuli und dem Hinterdarm, angewendet werden, um gemeinsam Ionen- und Flüssigkeitssekretionsraten, kontraktile Aktivität und transepithelialen Ionentransport zu messen.

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Diese Studie stellt experimentelle Protokolle für eine biohybride Geruchserkennungsdrohne vor, die auf Seidenmottenantennen basiert. Der Betrieb eines experimentellen Elektroantennennogramms mit Seidenmottenantennen wird vorgestellt, zusätzlich zur Struktur einer Bio-Hybrid-Drohne, die für die Lokalisierung von Geruchsquellen mit dem Spiral-Surge-Algorithmus entwickelt wurde.

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Es werden Verfahren zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mittels AC-DC-Elektropenetrographie beschrieben.

AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

Lernen Sie die Elektroantennographie an Mücken wie Aedes aegypti und Anopheles stephensi. Diese Methode erfasst olfaktorische Reaktionen zuverlässig und unterstützt Forscher bei der Entwicklung neuer Schädlingsbekämpfungsstrategien.

Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie

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