Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Mücken-Elektroantennographie

Für die Elektroantennographie ist die Verwendung von Mücken in einem bestimmten und konsistenten physiologischen Status entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Das Schritt-für-Schritt-Protokoll ermöglicht dauerhafte elektroantennographische Aufzeichnungen bei Stechmücken. Die Methode kann bei verschiedenen Mückenarten und sowohl bei Männern als auch bei Frauen angewendet werden.

Die elektroantennographische Technik kann auch auf andere Insektenmodelle übertragen werden, darunter Käfer, Fliegen, küssende Käfer und Ameisen. Entfernen Sie zunächst die 1,5-Milliliter-Bernsteinfläschchen mit den Geruchsmischungen und einer Lösungsmittelkontrolle aus dem 20-Grad-Celsius-Gefrierschrank, in dem sie aufbewahrt werden, um eine Verschlechterung zu verhindern. Als nächstes pipettieren Sie 10 Mikroliter der Geruchslösung auf ein Stück Filterpapier, das in eine beschriftete Glasspritze eingelegt ist.

Isolieren Sie die Mücken am Tag des Experiments. Brechen Sie unter dem Mikroskop vorsichtig die Spitze von zwei Borosilikatkapillaren mit Filamenten mit einer Pinzette. Stellen Sie vor dem Ausführen der Elektroantennographie oder des EAG-Experiments sicher, dass die Elektrodenhalter innen frei sind und keine Borosilikatrückstände vorhanden sind.

Führen Sie dann eine Chloridisierung durch, indem Sie die Silberdrähte der Elektrodenhalter fünf Minuten lang in reinem Bleichmittel einweichen, bis die Drähte dunkel und mattgrau werden. Spülen Sie dann die Drähte aus. Lösen Sie den Gummistopfen und füllen Sie mit einer 20-Gauge-Nadel das Innere der Kapillare mit Kochsalzlösung.

Spülen Sie die Kapillaren aus und führen Sie die Drähte in die beiden Kapillaren ein. Halten Sie die Spitze des Drahtes weniger als einen Millimeter von der Spitze der Kapillare entfernt. Führen Sie die Kapillare durch den Gummiring im Elektrodenhalter, ohne ihn zu brechen, und ziehen Sie den Gummistopfen vorsichtig fest, nachdem Sie sich vergewissert haben, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Verwenden Sie die Kapillare mit der breiteren Öffnung am Referenzelektrodenhalter und der kleineren Öffnung am Aufnahmeelektrodenhalter. Lassen Sie die beiden montierten Elektrodenhalter auf einem feuchten Reinigungstuch, um ein Austrocknen der Spitze zu verhindern, bis Sie bereit sind, den Kopf zu montieren. Stellen Sie sicher, dass der Lufttisch oben ist.

Es gibt keine Blockade in der Fluggesellschaft und die Luft ist eingeschaltet. Stellen Sie sicher, dass der Tank mit medizinischer Luft voll ist, um zu vermeiden, dass er mitten im Experiment gewechselt wird, und bestätigen Sie Blasen im Luftbefeuchter. Schalten Sie die Computer, die Softwareanwendungen und die Stromversorgung des Ventils ein.

Nachdem Sie die Internetverbindung überprüft haben, geben Sie einen Steuerimpuls ab, um zu überprüfen, ob das Ventil, das die Impulse liefert, funktionsfähig ist. Legen Sie eine Aluminiumplatte mit einem Stück Nassreinigungstuch auf Eis und legen Sie einen kleinen Klecks Elektrodengel in eine Ecke. Stellen Sie einen Mückenbecher auf Eis, damit die Mücke abkühlen kann.

Befestigen Sie die Spitze jeder Antenne der Mücke mit einer Mikroschere. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mücke neben den Elektrodengelklecks zu ziehen, und tauchen Sie die Spitze jeder Antenne vorsichtig in das Gel. Ziehen Sie die Mückenantennen mit einer Pinzette heraus und halten Sie sie nebeneinander.

Hacken Sie den Kopf der Mücke mit einer Mikroschere. Tauchen Sie die Spitze der Referenzelektrode vorsichtig in das Gel und bringen Sie es in Kontakt mit dem Hals, wobei Sie den Kopf daran kleben lassen. Platzieren Sie die Referenzkopfelektrode auf einem Mikromanipulator.

Schließen Sie beide Elektrodenhalter an den Verstärker an. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Aufzeichnungselektrode so nah wie möglich an den Antennenspitzen zu platzieren. Stecken Sie dann die Antennenspitzen in die Aufnahmeelektrode.

Platzieren Sie den Airline-Schlauch in der Nähe der Moskitokopfvorbereitung in einem Zentimetermeter. Schalten Sie den Verstärker und den Rauschreduzierer ein und stellen Sie sicher, dass das Basissignal nicht verrauscht ist. Sobald der Geräuschpegel zufriedenstellend ist, führen Sie die erste Geruchsspritze in das Airline-Loch ein, um den Test durchzuführen und den Faradayschen Käfig zu schließen.

Klicken Sie dann in der EAG-Software auf Aufzeichnen, um den Impuls zu liefern. Messen Sie die EAG-Antworten als Amplitude in Millivolt und fahren Sie dann mit dem nächsten Geruch oder der nächsten Konzentration fort. Das Experiment zeigt erfolgreich, dass Mückenarten unterschiedliche Geruchsreaktionen auf verschiedene Chemikalien zeigen können.

Es gab keine Reaktion auf das Mineralöl, das als Negativkontrolle verwendet wurde. Fehler in den Ergebnissen aufgrund von elektrischem Rauschen können reduziert werden, indem die Elemente mit Krokodilklemmen am Faradayschen Käfig geerdet werden. Die Reaktionsschwelle auf denselben Geruchsstoff kann für verschiedene Mückenarten unterschiedlich groß sein.

Zum Beispiel produzieren Toxorhynchites rutilus septentrionalis-Mücken im Vergleich zu Aedes aegypti, Anopheles stephensi und Culex quinquefasciatus sehr große EAGs. Es wurde eine große Auslenkung als Reaktion auf die Positivkontrolle, Benzaldehyd, festgestellt. Während es an Reaktion auf die Negativkontrolle mangelte, Mineralöl.

Diese durchschnittlichen Antennenreaktionen sind in einem Balkendiagramm dargestellt. Zusätzlich wurde die Schwelle für den Nachweis einer bestimmten Chemikalie für jede Mückenart bestimmt, indem die Antenne, die steigenden Konzentrationen der Chemikalie und eine Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt wurden. Es ist wichtig, die Aufnahme so schnell wie möglich zu starten, nachdem der Kopf gehackt und montiert wurde, um eine gute Reaktionsfähigkeit des Präparats zu gewährleisten.

Mit EAG kann festgestellt werden, ob die Mückenantennen bei einer bestimmten Konzentration auf eine bestimmte Chemikalie reagieren. Es erlaubt jedoch nicht, das Gleichgewicht dieser Chemikalie zu bestimmen. Zum Beispiel, ob es sich um einen Lockstoff oder eine Reue handelt.