Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Diese Technik bewahrt alle Netzhautschichten und Zelltypen in situ und ist damit klinisch relevanter als Tier- und In-vitro-Modelle. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es die Störung der Netzhautintegrität während der Gewebehandhabung minimiert, was beim Vergleich von gesunder und kranker Netzhaut unerlässlich ist. Netzhauterkrankungen können durch Kultivierung des Gewebes unter bestimmten Bedingungen nachgeahmt werden.

Dies ermöglicht die Erprobung neuer medikamentöser Therapien. Die Dissektions- und Probenentnahmeverfahren sind komplex. Daher ist eine visuelle Demonstration entscheidend, um den Lesern zu helfen, das geschriebene Protokoll zu verstehen und das Verfahren erfolgreich durchzuführen.

Das Verfahren wird von Charisse Kuo, einer Doktorandin im zweiten Jahr aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, das Dulbeccos modifiziertes Adlermedium/ Nährstoffgemisch F-12 und eine einmalige Mischung aus Antibiotika und Antimykotika enthält. Zuerst 500 Mikroliter Medium in eine 24-Well-Platte geben und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ausgleichen.

Wenn Sie das Medium vor der Explantionsextraktion bereit haben, wird eine Verdrennung der Netzhaut bei späterer Zugabe vermieden. Um Netzhautexplantierungen zu extrahieren, legen Sie zunächst die Augenmuschel auf eine Petrischale mit der Iris und der Linse nach oben und das ONH kontaktiert die Petrischale. Halten Sie die Augenmuschel mit einer Zette am Limbus ruhig und lösen Sie die Iris und die Linse, indem Sie kleine Schnitte umlaufend entlang des äußeren Randes des Limbus machen.

Entfernen Sie die Iris und die Linse vorsichtig und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu stören. Identifizieren Sie das ONH mit einer hellen weißen Lichtquelle und schneiden Sie an den vier Quadranten in Richtung ONH, wodurch die Petrischale für eine einfachere Handhabung gedreht wird. Verteilen und flachen Sie die Augenmuschel vorsichtig ab.

Tragen Sie die Zette auf die Sklera anstelle der Netzhaut auf, um eine Störung der Netzhautintegrität zu vermeiden. Entfernen Sie die Platte mit den vorbereiteten Medien aus dem Inkubator. Legen Sie ein chirurgisches Trephin auf die Netzhaut in einer Region ohne Netzhautfalten und drücken Sie hart, um die Sklera zu durchdringen, was ein knackendes Geräusch erzeugen sollte, wenn Sie durch die Petrischale brechen.

Drehen Sie das Trephin, um sicherzustellen, dass die Sklera vollständig durchdrungen ist, so dass die Netzhautexplant ausscheidet ist. Tragen Sie die Zette an der Sklera auf und übertragen Sie die Sandwich-Netzhaut-Explant aus dem Kulturmedium. Die gesammelten Sandwich-Netzhaut-Explanten bei 37 Grad Celsius bis zu 72 Stunden lang in einem befeuchteten 5%igen Kohlendioxid-Inkubator anpflanzen.

Hämatoxylin- und Eosinfärbungen zeigten, dass die Sandwich-Netzhautexplantierungen die Integrität und eine ausgeprägte Lamellenstruktur von der GCL bis zur ONL mit kompakten Kernen in den inneren und äußeren Kernschichten bewahrten. Eine gestörte Netzhautintegrität wurde an den Rändern derselben Probe gefunden, wo sich die Netzhaut von der darunter liegenden RPE-Aderhaut und -Sklera gelöst hatte und eine reduzierte Netzhautdicke und einen Verlust von Kernen im INL und ONL zeigte. In Retinaxplanten, die unter basalen Bedingungen kultiviert wurden, wurden keine TUNEL-positiven Zellkerne gefunden, die eine anhaltende zelluläre Apoptose markieren, was auch nach 72 Stunden eine anhaltende zelluläre Vitalität zeigt.

Die GFAP-Markierung war auf die GCL und die IPL ohne Gliafibrose beschränkt, ein Zeichen der Pathologie, das als erweiterte Expression von GFAP in die ONL identifiziert werden würde. Vimentin wurde von der Ganglienzellschicht bis zur äußeren Kernschicht stark exprimiert und zeigte eine erhaltene Mueller-Zellintegrität, wie sie in normalem Netzhautgewebe beobachtet wird. Der magnetische Luminex-Assay zeigte, dass die IL-18-, VEGF-, IL-6- und IL-8-Spiegel in den Sandwich-Netzhaut-Explantionskulturen in hochglukosen und entzündungsfördernden Zytokinen nach 24 Stunden signifikant über dem Ausgangswert anstiegen.

Nach 72 Stunden blieben die IL-18- und VEGF-Spiegel signifikant erhöht, aber es wurde kein signifikanter Unterschied bei IL-6- und IL-8-Spiegeln gefunden. Lassen Sie bei diesem Verfahren genügend Restgewebskörper, der die Netzhaut belastet, damit sie sich nicht von der RP-Aderhaut löst und im Nährmedium schwimmt. Die kultivierte Netzhaut kann mittels Immunhistochemie und Histologie weiter charakterisiert werden, während die in das kultivierte Medium freigesetzten entzündlichen Zytokine mit einem Luminex-Magnetassay gemessen werden können.

Dieses Modell ist klinisch besser übersetzbar als Tier- und In-vitro-Modelle, was es besser geeignet macht, die Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Medikamente für Netzhauterkrankungen zu testen.