Aufzeichnung elektrischer Ströme durch die Plasmamembran von Säugetiersamenzellen
14. Februar 2021
Dieses Protokoll beschreibt, wie elektrische Aufzeichnungen von Säugetierspermien in einer Ganzzellkonfiguration durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Aktivität der Ionenkanäle direkt aufzuzeichnen. Die Methode hat maßgeblich dazu beigetragen, die elektrophysiologischen Profile mehrerer Ionenkanäle der Spermien zu beschreiben und ihre molekulare Identität und Regulation aufzudecken.
Die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität der Spermienzelle mittels der Patch-Clamp-Technik war maßgeblich an der Identifikation verschiedener Spermien-Ionenkanäle und dem Verständnis der Spermienelektrophysiologie auf molekularer Ebene beteiligt. Diese Methode ist hervorragend bei der Messung elektrophysiologischer und pharmakologischer Fingerabdrücke von Ionenkanälen und ist das zuverlässigste Werkzeug zur Identifikation von Ionenkanälen. Angesichts der physiologischen Bedeutung von Ionenkanälen und elektrogenen Transportern für männliche Fruchtbarkeit ist diese Technik ein mächtiges Werkzeug, um bestimmte Spermiendefekte zu verstehen, die zu Unfruchtbarkeit führen.
Für die Mikropipettenfertigung beginnen Sie mit Borosilikat-Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern, einem Innendurchmesser von 0,86 Millimetern und einem inneren Filament. Stellen Sie sicher, dass der Innendurchmesser der Pipettenspitze vor dem Feuerpolieren etwa zwei Mikrometer beträgt und nach ordnungsgemäßem Polieren auf 0,5 Mikrometer reduziert wird. Baue eine Agarbrücke, um die Umgebung um die Referenzelektrode stabil zu halten.
Stellen Sie eine L-förmige Glaskapillare her, indem Sie sie unter einem kleinen Bunsenbrenner biegen und abkühlen lassen. Stellen Sie eine Lösung aus 1 % Agarose in einem molaren Kaliumchlorid her und erhitzen Sie sie in der Mikrowelle, bis die Agarose schmilzt und die Lösung transparent wird. Füllen Sie vorsichtig die L-förmige Glaskapillare mit der Agarose, um Luftblasen zu vermeiden, und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen.
Alternativ kann man die L-förmige Glaskapillare in die geschmolzene Agarose eintauchen. Rühre den Behälter mehrmals und erhitze ihn erneut in der Mikrowelle, bis der Agarose kocht, was Luftblasen aus der Agarbrücke ausstößt. Öffnen Sie den unteren Bauchbereich der Maus mit einer Schere und entfernen Sie beide Nebenhoden.
Legen Sie sie in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale, die mit einer Salzlösung oder HS gefüllt ist, die auf Zimmertemperatur vorgewärmt wurde. Übertragen Sie die Epididymide in eine neue Zellkulturschüssel mit HS-Lösung und entfernen Sie das gesamte Restfett gründlich. Trennen Sie die Epididymide mit einer Skalpellklinge der Nummer 15 in Caput, Corpus und Cauda.
Der Korpus jeder Epididymis wird in eine neue Zellkulturschüssel mit HS-Lösung übertragen. Machen Sie mehrere Schnitte im isolierten Teil der Epididymis mit einer spitzen Skalpellklinge der Nummer 11. Übertragen Sie die Teile der Epididymide mit mehreren Schnitten in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit 1,5 Millilitern HS-Lösung.
Kurze Spermien aus der Nebenhoden mit einer Superfine Dumont Typ-5A-Zangelei in die Lösung schütteln. Entsorge dann die Epididymide und lass den Schlauch 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen. Warte, bis die feste Substanz bis zum Boden des Rohrs absinkt.
Dann übertrage ich den Überstand in ein weiteres 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Finde die geeignete Spermienzelle mit einem zytoplasmatischen Tropfen mit 600-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass der zytoplasmatische Tropfen oval ist und eine leicht verlängerte, spindelförmige Form hat.
Wählen Sie ein Spermatozoon, das beweglich ist, dessen Kopf an der Deckung befestigt ist, sodass die Spermienzelle teilweise fixiert ist, aber der zytoplasmatische Tropfen und der Rest des Flagellans sich weiterhin mit Flagellenschlag bewegen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Spermiums locker am Deckmantel befestigt ist. Nach der visuellen Auswahl einer Spermienzelle mit der richtigen Morphologie füllen Sie die Mikropipette mit der Pipettenlösung und sichern Sie sie im Pipettenhalter.
Um die Pipettenspitze frei von Schmutz zu halten, üben Sie mit der U-Rohr-förmigen Baugruppe Überdruck auf die Pipette aus. Senken Sie die Pipette ab und tauchen Sie die Spitze in die Badelösung. Um die Zelle klar sichtbar zu machen, positionieren Sie die Spitze der Pipette über dem zytoplasmatischen Tropfen so, dass die Öffnung der Spitze diagonal zum Tropfen hin ausgerichtet ist.
Senken Sie die Spitze der Pipette schnell in Richtung des Tröpfchens, sodass sie sich in derselben Brennebene befinden. Sobald die Spitze der Pipette den Tropfen berührt, üben Sie Unterdruck auf die Pipette aus, um einen Teil des Tropfens in die Spitze zu bewegen und eine Gigaohm-Abdichtung zu bilden. Dann heben Sie das Spermien vom Deckel.
Kompensiere die Streukapazitätstransienz mit dem Kompensatoriemodus des Verstärkers, bevor du in den Vollzellmodus übergehst. Führen Sie einen Einlauf und Übergang in den Ganzzellmodus durch, indem Sie eine Millisekunde, allmählich zunehmende Spannungsimpulse in Kombination mit einem sehr leichten Saugeffekt anwenden. Nach der Anwendung jeder Einlaufspannungsimpulse starten Sie das Membrantestwerkzeug, um zu prüfen, ob eine größere Kapazitätstransienz auftritt.
Passen Sie die größere Kapazitätstransienz an, um die Kapazität der gesamten Zelle sowie ihren Zugangswiderstand zu bestimmen. Nach einem erfolgreichen Einbruch werden die geplanten Ganzzell-Patchclamp-Experimente durchgeführt, wie das Anbringen verschiedener Badelösungen mit unterschiedlichen Verbindungen oder das Messen der Kanalaktivitäten mit Spannungsstufen- oder Spannungsrampenprotokollen. CatSper-Aufnahmen wurden durchgeführt, indem eine hochresistente Abdichtung zwischen der Patch-Pipette und dem säugetierischen Spermatozoon an ihrem zytoplasmatischen Tröpfchen hergestellt wurde.
Cäsium-Ganzzell-CatSper-Strömungsdichten wurden von Spermien von kaudalen Wildneuronen und CatSper-defizienten Kaudalneuron-Spermien nachgewiesen. Spermienzellen verschiedener Arten sind in ihrer Morphologie und internen Regulationswege vielfältig. Primaten- und menschliche Spermatozoen zeigten ähnliche Eigenschaften und Regulation des CatSper-Kanals.
Interessanterweise scheint die Progesteronaktivierung von CatSper einzigartig für Primatenspermatozoen zu sein. Wildschwein-, Bullen- und Nagetierspermien zeigten keine progesteronstimulierte Veränderung ihrer CatSper-Ströme. Bei Bullen- und Wildschweinspermatozoen lag selbst die basale CatSper-Kanalaktivität unter den nachweisbaren Grenzen, was darauf hindeutet, dass Kalziumzufluss und die daraus resultierende Hyperaktivierung durch andere Kanäle oder Transporter angetrieben werden oder dass ein anderer natürlicher Stimulator für die Aktivierung ihrer CatSper-Kanäle benötigt wird.
Die kleinen, glatten, gleichmäßigen und nicht übermäßig geschwollenen zytoplasmatischen Tröpfchen eignen sich am besten für eine Patch-Clamp. Sie sollten diese winzigen, einseitigen, aufgeblähten und vollständig transparenten zytoplasmatischen Tröpfchen vermeiden, da diese zu einer schwachen oder keinen Abdichtung führen. Diese Technik ermöglicht das detaillierte Studium spezifischer Luftkanäle in ihrem natürlichen Expressionssystem, und der Erfolg hängt von hochwertigen, variablen Spermien, reinen Regionen, grundlegenden intellektuellen physiologischen Fähigkeiten, Geduld und vor allem von Ausdauer ab.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt die Spermien-Patch-Clamp-Technik, eine spezialisierte elektrophysiologische Methode zur Aufzeichnung der Ionenkanalaktivität in einzelnen Spermien von Säugetieren. Das Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen zum Isolieren von Spermien, zur Vorbereitung der Patch-Clamp-Ausrüstung, zur Immobilisierung beweglicher Spermatozoen und zum Erzielen von hochwiderständigen Abschlüssen für Ganzzell-Aufzeichnungen. Die Methode hat wesentliche Fortschritte beim Verständnis der Ionenkanalphysiologie von Spermien ermöglicht, insbesondere hinsichtlich des CatSper-Calciumkanals, in mehreren Säugetierarten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Elektrophysiologie
- Reproduktionsbiologie
- Zellphysiologie
Hintergrund
- Die direkte elektrische Ableitung von Spermienzellen war aufgrund ihrer geringen Größe und Beweglichkeit historisch herausfordernd.
- Mit der Patch-Clamp-Technik lassen sich die Aktivitäten von Ionenkanälen in Einzelzellen präzise messen.
- Spermien-Ionenkanäle wie CatSper sind entscheidend für die Beweglichkeit und die männliche Fertilität.
- Das Verständnis der Elektrophysiologie von Spermien hilft dabei, Defekte zu identifizieren, die mit Unfruchtbarkeit assoziiert sind.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte, reproduzierbare Anleitung für die Patch-Clamp-Aufzeichnung aus Spermien von Säugetieren bereitstellen.
- Wichtige technische Aspekte und Tipps zur Fehlerbehebung für erfolgreiche Aufzeichnungen hervorheben.
- Die Anwendung dieser Methode zur Untersuchung der CatSper-Kanalaktivität über verschiedene Arten hinweg demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Borosilikatglasmikropipetten und Agarbrücken für stabile Ableitungen.
- Isolierung von Spermienzellen aus den Maus-Epididymiden und Vorbereitung für die Patch-Clamp-Technik.
- Visuelle Auswahl und teilweise Immobilisierung von Spermatozoen zur Ableitung.
- Bildung von Gigaohm-Dichtungen am cytoplasmatischen Tröpfchen und Übergang in den Ganzzellmodus.
- Anwendung von Spannungsprotokollen und pharmakologischen Substanzen zur Charakterisierung der Ionenkanalaktivität.
Hauptergebnisse
- Es wurden erfolgreiche Ganzzell- und Zell-angeheftete-Aufzeichnungen von menschlichen und murinen Spermienzellen durchgeführt.
- Die Aktivität des CatSper-Kanals wurde in Spermien von sechs säugetierartigen Spezies charakterisiert.
- Die Progesteron-Aktivierung des CatSper wurde in primaten- und menschlichen Spermien beobachtet, jedoch nicht in Schweine-, Rinder- oder Nagetierspermien.
- Artenspezifische Unterschiede in der CatSper-Regulation und der basalen Aktivität wurden identifiziert.
Schlussfolgerungen
- Die Spermien-Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Ionenkanäle in ihrem natürlichen Kontext zu untersuchen.
- Sorgfältige Zellselektion, Vorbereitung der Ausrüstung und technisches Geschick sind entscheidend für den Erfolg.
- Diese Methode vertieft das Verständnis der Spermienphysiologie und kann Forschungsarbeiten zur männlichen Unfruchtbarkeit unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der direkten Patch-Clamp-Ableitung aus Spermien von Säugetieren lässt sich die Funktion von Ionenkanälen in einem der anspruchsvollsten Zelltypen für die Elektrophysiologie präzise untersuchen. Diese Methode fördert die frühe Entdeckung und Zielvalidierung von Ionenkanälen, die an der männlichen Fertilität und der Fortpflanzungsbiologie beteiligt sind. Sie ermöglicht eine zuverlässige Vorhersage bei mechanistischen Studien und unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen in Programmen zur Fortpflanzungsgesundheit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Messung der Ionenkanalaktivität in nativen Spermienzellen zur funktionellen Zielstrukturnachweis.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem kanalspezifische Defekte, die Unfruchtbarkeitsphänotypen zugrunde liegen, unterschieden werden.
- Erleichtert vergleichende Studien über verschiedene Arten hinweg, um die Erhaltung und Divergenz von Signalwegen zu klären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet eine validierte elektrophysiologische Plattform zur quantitativen Beurteilung von Ionenkanalmodulatoren.
- Legt reproduzierbare Protokolle für Ganzzell- und Zell-angeheftete-Aufzeichnungen in stark beweglichen Zellen fest.
- Ermöglicht die Standardisierung von Testbedingungen für vergleichende Untersuchungen zwischen Studien und Arten.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt funktionelle Messgrößen mit krankheitsrelevanten Endpunkten in der Forschung zur männlichen Unfruchtbarkeit.
- Unterstützt die identifizierung translationaler Biomarker durch die Verknüpfung von Kanalaktivität mit physiologischen Ergebnissen.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der molekularen Entdeckung zur präklinischen Validierung in reproduktiven Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungs- bis präklinischen Kontinuum für Ionenkanal-Wirkstoffziele in der Fortpflanzungsbiologie.
- Entdeckungsbiochemie: Bietet funktionale Daten mit hoher Auflösung zur Hypothesenprüfung und Aufklärung von Wegen in der Spermienphysiologie.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare elektrophysiologische Ergebnisse zur Bewertung von Substanzen.
- Analysen: Ermöglicht statistische Vergleiche der Kanalaktivität zwischen Genotypen, Behandlungen und Arten.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Erkenntnisse mit präklinischen Modellen der männlichen Fertilität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein übertragbares Protokoll, das an verschiedene Säugetierarten und Ionenkanalziele angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und mechanistischen Untersuchungen von Spermien-Ionenkanälen.
- Operationaler Wert: Standardisiert anspruchsvolle elektrophysiologische Arbeitsabläufe für kleine, bewegliche Zellen.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Unschärfen und unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen in der Forschung und Entwicklung im Bereich Fortpflanzungsgesundheit.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Ionenkanal-Zielen und kandidaten Modulatoren.
Umsetzungsüberlegungen
- Erfordert fortgeschrittene Fachkenntnisse und Schulung in der Elektrophysiologie für eine zuverlässige Durchführung.
- Benötigt spezialisierte Geräteausstattung für die Patch-Clamp-Aufzeichnung und die Immobilisierung von Zellen.
- Erfordert eine strikte, standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Zellauswahl und den Testbedingungen.
- Kann an verschiedene Säugetierarten angepasst werden, sofern die Protokollparameter an die Zellmorphologie optimiert werden.
- Eingeschränkt durch technische Schwierigkeiten bei der Erzielung stabiler Dichtungen und reproduzierbarer Aufzeichnungen von stark beweglichen Zellen.
