Optimierung radiochemischer Reaktionen mit Droplet Arrays

Aktuelle automatisierte Radiosynthesizer sind für die Herstellung großer Chargen weit verbreiteter Radiopharmazeutika wie FDG ausgelegt. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Synthesen, die pro Tag möglich sind, und des relativ hohen Reagenzienverbrauchs sind diese Systeme jedoch nicht gut geeignet, um Syntheseoptimierungsstudien durchzuführen. Mit dieser Technik wird der Durchsatz durch bis zu 16 gleichzeitige Reaktionen parallel deutlich erhöht und der Reagenzienverbrauch um das Hundertfache reduziert.

Darüber hinaus werden durch parallele Reaktionen faire Chargen von Radioisotopen benötigt, um eine Studie abzuschließen. Ein erhöhter Durchsatz ermöglicht eine breitere Untersuchung der Reaktionsbedingungen mit einer größeren Anzahl von Replikaten im Vergleich zur Verwendung herkömmlicher Instrumente. Während dieses Protokoll die Optimierung der Vorläuferkonzentration bei der Synthese von Fallyprid zeigt, kann die Technik zur Optimierung anderer Bedingungen und anderer Radiopharmazeutika verwendet werden.

Beginnen Sie mit der Herstellung von Chargen von Multireaktions-Mikrotröpfchenchips aus Vier-Zoll-Siliziumwafern unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken. In diesem Protokoll wird die Hochdurchsatzoptimierung der Vorläuferkonzentration mit der Synthese des radiopharmazeutischen Fallyprids demonstriert. 16 gleichzeitige Reaktionen können auf einem einzigen Chip durchgeführt werden.

Die zu vergleichenden Bedingungen werden den Reaktionsstellen zugeordnet. Bereiten Sie eine Stammlösung des Reaktionslösungsmittels bestehend aus Thexylalkohol und Acetonitril in einem Eins-zu-Eins-Volumen-Gemisch vor. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um die geplante Verdünnungsreihe zu erstellen.

Bereiten Sie eine 30-Mikroliter-Stammlösung des Vorläufers im Reaktionslösungsmittel mit der maximal zu untersuchenden Konzentration vor. Aus der Vorläuferlösung und dem Reaktionslösungsmittel werden zwei serielle Verdünnungen in einem Satz von Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt, um die unterschiedlichen Konzentrationen der Vorläuferlösung herzustellen. Bereiten Sie einen weiteren Satz Mikrozentrifugenröhrchen vor, um jedes Rohreaktionsprodukt mit einem Permanentmarker zu sammeln, um jedes Röhrchen mit einer eindeutigen Nummer zu beschriften.

Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Anzahl der Bedingungen multipliziert mit der Anzahl der Replikate übereinstimmt. Bereiten Sie einen 10-Milliliter-Bestand an Sammellösung vor, der aus neun bis einem Methanol zu entionisiertem Wasser besteht. Aliquot 50 Mikroliter von jedem in einen zusätzlichen Satz von 16 Mikrozentrifugenröhrchen, die als Sammellösung gekennzeichnet sind.

Bereiten Sie eine Fluorid-Stammlösung vor, indem Sie etwa sieben Millicuries der Fluoridquelle mit 56 Mikrolitern 75 Millimolar tetrabutylammoniumbicarbonat mischen und mit DI-Wasser auf bis zu 140 Mikroliter verdünnen. Laden Sie mit einer Mikropipette einen acht Mikroliter tröpfchen Fluorid-Stammlösung auf den ersten Reaktionspunkt eines Multireaktionschips. Messen Sie die Aktivität des Chips, indem Sie ihn in einen Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.

Entfernen Sie den Chip aus dem Dosiskalibrator und laden Sie einen acht Mikroliter tröpfchen Fluorid-Stammlösung auf die zweite Reaktionsstelle. Messen Sie die Aktivität auf dem Chip und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Messung durchgeführt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen.

Berechnen Sie die pro Reaktionsstelle belastete Aktivität, indem Sie die Aktivitätsmessung nach dem Laden des Radioisotops durchführen und die vorherige Messung subtrahieren, bevor diese Stelle geladen wurde. Um den Multireaktionschip auf der Heizung auszurichten, fügen Sie eine dünne Schicht Wärmeleitpaste auf die Keramikheizung hinzu. Legen Sie den Chip vorsichtig mit einer Pinzette auf die Heizung, um die Referenzecke des Chips mit der Referenzecke der Heizung auszurichten.

Der Chip sollte die Heizung um einen kleinen Betrag überhängen. Erhitzen Sie den Chip für eine Minute, indem Sie die Heizung im Regelprogramm auf 105 Grad Celsius einstellen, um die Tröpfchen zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand von Fluorid und Tetrabutylammoniumbicarbonat zu hinterlassen. Dann kühlte der Chip, indem sie die Heizung auf 30 Grad Celsius stellte und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschaltete.

Fügen Sie mit einer Mikropipette eine Lösung von Fallypridenvorläufer mit sechs Mikrolitern auf den getrockneten Rückstand an der ersten Reaktionsstelle hinzu. Wiederholen Sie dies für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Verwenden Sie den Optimierungsplan, um zu bestimmen, welche Konzentration der Verdünnungsreihe für jede Reaktionsstelle verwendet wird.

Erhitzen Sie den Chip sieben Minuten lang mit dem Steuerungsprogramm auf 110 Grad Celsius, um die Radiofluorierungsreaktion durchzuführen, kühlen Sie dann den Chip, indem Sie die Heizung auf 30 Grad Celsius einstellen und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten. Sammeln Sie das Rohprodukt an der ersten Reaktionsstelle, indem Sie 10 Mikroliter Sammellösung aus dem dafür vorgesehenen Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Nachdem Sie fünf Sekunden gewartet haben, saugen Sie das verdünnte Rohprodukt an und geben Sie es in das entsprechende Auffang-Mikrozentrifugenröhrchen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt viermal mit derselben Pipettenspitze und schließen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diese Schritte, um das Rohprodukt von allen anderen Reaktionsstellen auf dem Chip zu sammeln. Um die Sammeleffizienz für die erste Reaktion auf dem Chip zu bestimmen, legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem gesammelten Rohprodukt der ersten Reaktionsstelle in den Dosiskalibrator, um die Aktivität zu messen.

Zeichnen Sie die Messung und den Zeitpunkt der Messung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der gesammelten Rohölprodukte. Berechnen Sie die Sammeleffizienz, indem Sie die Aktivität des gesammelten Rohprodukts durch die für dieselbe Reaktionsstelle gemessene Startaktivität dividieren.

Wiederholen Sie dies für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Als nächstes analysieren Sie die Zusammensetzung jedes gesammelten Rohölprodukts. Zeichnen Sie mit einem Bleistift eine Linie, die 15 Millimeter von der Unterkante der TLC-Platte und eine weitere Linie 50 Millimeter von der gleichen Kante entfernt ist.

Die erste Linie ist die Ursprungslinie und die zweite ist die Lösungsmittelfrontlinie. Zeichnen Sie acht kleine X entlang der Ursprungslinie im Abstand von fünf Millimetern, um die Probenposition für jede der acht Bahnen zu definieren. Übertragen Sie mit einer Mikropipette 0,5 Mikroliter des ersten Rohprodukts auf die TLC-Platte am X für die erste Spur.

Wiederholen Sie dies für zusätzliche Rohölprodukte und warten Sie dann, bis die Stellen getrocknet sind. Entwickeln Sie jede TLC-Platte mit einer mobilen Phase von 60% Acetonitril in 25 Millimolar-Ammoniumformiat mit 1% TEA, bis die Lösungsmittelfront die Lösungsmittelfront erreicht. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt die TLC-Platte aus der Kammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel auf der TLC-Platte getrocknet ist, legen Sie die TLC-Platte dann in das Cerenkov-Bildgebungssystem und bedecken Sie sie mit einem Glasmikroskopobjektträger.

Erhalten Sie ein Radioaktivitätsbild jeder TLC-Platte, indem Sie das Cerenkov-Bildgebungssystem auf eine fünfminütige Belichtung einstellen, dann die erzeugte Datei des Bildes auf der TLC-Platte auswählen und Standardbildkorrekturen durchführen. Verwenden Sie die Regionsanalyse für die erste Spur der ersten TLC-Platte. Zeichnen Sie Bereiche um jedes Band, das in der Spur sichtbar ist, und berechnen Sie dann den Anteil der integrierten Intensität jeder Region im Vergleich zur gesamten integrierten Intensität aller Regionen.

Bestimmen Sie die Fluorierungseffizienz als Anteil der Aktivität im Fallypridenband. Wiederholen Sie diese Analyse für alle anderen Fahrspuren auf allen TLC-Platten. Berechnen Sie dann die rohe radiochemische Ausbeute für jede Reaktion und wählen Sie die optimale Vorläuferkonzentration, indem Sie die rohe radiochemische Ausbeute als Funktion der Vorläuferkonzentration untersuchen.

Optimierungsstudien des radiopharmazeutischen Fallyprids wurden durch unterschiedliche Vorläuferkonzentrationen in Thexylalkoholacetonitril durchgeführt. Reaktionen wurden bei 110 Grad Celsius pro sieben Minuten durchgeführt. Die Sammlungseffizienz und die Probenzusammensetzung werden hier gezeigt.

Die Fluorierungseffizienz nahm mit zunehmender Vorläuferkonzentration zu und die Konzentration von nicht umgesetztem Fluorid nahm ab. Bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen gab es eine geringe Menge radioaktives Nebenprodukt, das bei den höheren Vorläuferkonzentrationen nicht gebildet wurde. Die Sammeleffizienz war für die meisten Bedingungen nahezu quantitativ, obwohl sie bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen leicht zurückging.

Die höchste rohe radiochemische Ausbeute wurde mit einer 39-millimolaren Vorläuferkonzentration erreicht. Unter dieser Bedingung betrug die Fluorierungseffizienz 96%Der rohe RCY betrug 87% und es gab keine beobachtete radioaktive Nebenproduktbildung. Es ist wichtig, einen Kartenplan zu haben, welcher Reaktionszustand welchem Reaktionströpfchen auf dem Chip entspricht, und entsprechend markierte Reagenzröhrchen und Produktsammelröhrchen zu haben, die während des Experiments überprüft werden können.

Das Verfahren kann zur Optimierung anderer Reaktionsbedingungen wie Basenmenge, Lösungsmittelart oder Reaktionsvolumen eingesetzt werden. Es kann auch verwendet werden, um die Synthese anderer Radiopharmazeutika zu optimieren.