Name: Optimierung radiochemischer Reaktionen mit Droplet Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie radiochemische Reaktionen mit Droplet Arrays optimieren. Diese Hochdurchsatzplattform ermöglicht parallele Reaktionen mit minimalem Reagenzienverbrauch für die Radiopharmaka-Entwicklung.

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Wir danken der UCLA Biomedical Cyclotron Facility und Dr. Roger Slavik und Dr. Giuseppe Carlucci für die großzügige Bereitstellung von [18F]fluorid für diese Studien und dem UCLA NanoLab für die Unterstützung mit Geräten für die Chipherstellung.

ACHTUNG: Dieses Protokoll beinhaltet den Umgang mit radioaktiven Stoffen. Experimente sollten nicht ohne die notwendige Schulung und persönliche Schutzausrüstung und Genehmigung durch die Strahlenschutzbehörde Ihrer Organisation durchgeführt werden. Versuche sollten hinter Strahlenabschirmung durchgeführt werden, vorzugsweise in einer belüfteten heißen Zelle
1. Herstellung von Multireaktionschips
HINWEIS: Chargen von Multireaktions-Mikrotröpfchenchips werden aus 4-Zoll-Siliziumwafern unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt, wie zuvorbeschrieben 10 (Abbildung 1). Bei diesem Verfahren werden 7 Chips mit jeweils 4 x 4 Arrays von Reaktionsstellen erzeugt.
<ol><li>Legen Sie den Siliziumwafer auf das Spincoaterfutter und stellen Sie sicher, dass es zentriert ist. 3 mL Polytetrafluorethylenlösung in der Mitte des Wafers mit einer Transferpipette und einem Beschichtungswafer bei 1000 U/min für 30 s (500 U/min Rampe) abscheiden.</li>
	<li>Um die Beschichtung zu verfestigen, legen Sie den Wafer für 10 min auf eine 160 °C Warmplatte und werden dann für 10 min auf eine 245 °C Warmplatte übertragen.</li>
	<li>Die Beschichtung in einem Hochtemperaturofen bei 340 °C für 3,5 h unter Stickstoffatmosphäre glühen, gefolgt von einer Abkühlung auf 70 °C an einer 10 °C/min-Rampe.</li>
	<li>Legen Sie den Siliziumwafer auf das Spincoaterfutter und stellen Sie sicher, dass er zentriert ist. Gießen Sie 2 ml positives Fotolack in der Mitte des Wafers mit einer Transferpipette und führen Sie dann die Beschichtung bei 3000 U / min für 30 s (1000 U / min / s Rampe) durch.</li>
	<li>Verfestigen Sie den Fotolack, indem Sie die Waffel 3 min lang weich auf einer 115 °C warmen Kochplatte backen.</li>
	<li>Installieren Sie den Wafer und die Fotomaske in einem Mask aligner und führen Sie eine Belichtung von 14 s bei 12 mW/cm2 Lampenintensität und 356 nm Wellenlänge im Hartkontaktmodus durch. In diesem Schritt wird eine Transparenzmaske verwendet, die das negative endgültige Polytetrafluorethylenmuster enthält, d. H. Ein Muster mit einem Durchmesser von 4 Zoll und 4 Kopien des 16-Reaktionschips, wobei die Reaktionsstellen transparent und alle anderen Bereiche in undurchsichtiger Farbe sind.</li>
	<li>Tauchen Sie den Wafer mit 20 ml Fotolack-Entwicklerlösung für 3 min in einen Glasbehälter mit leichtem Rühren, um das belichtete Muster zu entwickeln.</li>
	<li>Spülen Sie die sich entwickelnde Lösung ab, indem Sie den Wafer in einen Glasbehälter mit 20 mL DI-Wasser für 3 min mit leichtem Rühren tauchen. Trocknen Sie den Wafer mit einer Stickstoffpistole.</li>
	<li>Entfernen Sie die exponierten Polytetrafluorethylen-Bereiche durch reaktives Ionenätzen (RIE) mit Sauerstoffplasma unter folgenden Bedingungen: 30 s Exposition, 100 mTorrdruck, 200 W Leistung und 50 sccm Sauerstofffluss.</li>
	<li>Würfeln Sie den Wafer mit einem Siliziumwafer-Cutter in einzelne Chips (insgesamt 7 pro Wafer).</li>
	<li>Tauchen Sie jeden Chip für 1 Minute in Aceton, um das Fotolack zu entfernen, dann Isopropanol für 1 Minute. Zum Schluss trocknen Sie jeden Chip mit einer Stickstoffpistole.</li>
	<li>Trockene Späne in einen Glasbehälter geben und zur Aufbewahrung bis zum Gebrauch mit Aluminiumfolie abdecken.</li>
</ol>2. Planung der Optimierungsstudie
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Synthese des Radiopharmazeutika [18F]fallyprid als Beispiel zur Veranschaulichung der Hochdurchsatzoptimierung verwendet (Abbildung 2). Mit einem einzigen Chip können 16 gleichzeitige Reaktionen durchgeführt werden, z.B. mit unterschiedlicher Vorläuferkonzentration (8 verschiedene Konzentrationen, n=2 repliziert jeweils). Die Bedingungen sind den Reaktionsstellen in Abbildung 3Azugeordnet. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um andere Reaktionsparameter (z. B. Reaktionslösungsmittel, Reaktionsvolumen, TbAHCO3usw.) oder andere Radiopharmazeutika zu optimieren.
<ol><li>Wählen Sie die zu variierenden Reaktionsparameter, die zu verwendenden spezifischen Werte und die Anzahl der Replikate aus.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der Chips, die für die Durchführung des Experiments erforderlich sind.</li>
	<li>Bereiten Sie für jeden Chip eine Karte vor, welche Reaktionsbedingungen an jeder Reaktionsstelle verwendet werden, um die Reagenzienvorbereitung und die Durchführung der Tröpfchenreaktionen zu unterstützen.</li>
</ol>3. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Optimierung der Radiosynthese von [18F]fallyprid
HINWEIS: Die tröpfchenbasierte Radiosynthese von [18F]fallyprid (Abbildung 2) beginnt mit der Zugabe von [18F]fluorid und Phasentransferkatalysator (TBAHCO3)an der Reaktionsstelle, gefolgt von einer Erwärmung, um Wasser zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand zu hinterlassen. Als nächstes wird ein Tröpfchen Vorläufer (Tosyl-Fallyprid) im Reaktionslösungsmittel (Thexylalkohol und Acetonitril) zugegeben und erhitzt, um die Radiofluorierungsreaktion durchzuführen. Schließlich wird das Rohprodukt zur Analyse vom Chip gesammelt. Die Reagenzienvorbereitungs- und Syntheseverfahren sollten angepasst werden, wenn die Optimierung eines anderen Tracers erfolgt.
<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung des Reaktionslösungsmittels vor, bestehend aus Thexylalkohol und Acetonitril in einer 1:1 Volumenmischung. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um die geplante Verdünnungsreihe zu erstellen. In diesem Beispiel ist die Optimierung von ~30 μL ausreichend.</li>
	<li>Eine 30 μL Stammlösung des Vorläufers (Tosyl-Fallyprid) im Reaktionslösungsmittel mit der maximal zu untersuchenden Konzentration (77 mM) wird hergestellt. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um das geplante Experiment durchzuführen. In diesem Beispiel ist die Optimierung von ~30 μL ausreichend.</li>
	<li>Führen Sie aus der Vorläuferlösung und dem Reaktionslösungsmittel 2x serielle Verdünnungen durch, um die verschiedenen Konzentrationen der Vorläuferlösung herzustellen. Stellen Sie sicher, dass das Volumen jeder Verdünnung ausreicht, um die gewünschte Anzahl von Replikaten für jede Bedingung durchzuführen. In diesem Beispiel der Optimierung sind ~15 μL jeder Konzentration ausreichend.</li>
	<li>Bereiten Sie Mikrozentrifugenröhrchen vor, um jedes rohe Reaktionsprodukt mit einem permanenten Marker zu sammeln, um jedes Röhrchen mit einer eindeutigen Nummer zu beschriften. Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Anzahl der Bedingungen multipliziert mit der Anzahl der Replikate (8 x 2 = 16) übereinstimmt.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Bestand an Sammellösung (10 ml) vor, der 9:1 Methanol:DI-Wasser (v/v) ent. Aliquot 50 μL in jede von 16 zusätzlichen markierten Mikrozentrifugenröhrchen (eine pro Reaktionsstelle auf dem Chip).</li>
	<li>Eine [18F]fluorid-Stammlösung in einem 500 μL Mikrozentrifugenröhrchen wird durch Mischen [18F]fluorid/[18O]H2 O (~260 MBq [7 mCi]) mit 75 mM TBAHCO3-Lösung (56 μL) und Verdünnen mit DI-Wasser bis zu 140 μL vorbereitet. 8 μL dieser Lösung werden an jede Reaktionsstelle geladen (mit ~15 MBq [0,40 mCi] Aktivität und 240 nmol TBAHCO3).</li>
</ol>4. Parallelsynthese von [18F]fallyprid mit unterschiedlichen Vorläuferkonzentrationen
HINWEIS: Der Chip wird auf einer Heizplattform (aufgebaut wie zuvor beschrieben13)betrieben, die aus einer 25 mm x 25 mm Keramikheizung besteht, die mit einem Ein-Aus-Temperaturregler mit dem internen Thermoelementsignal für die Rückmeldung gesteuert wird. Die Oberflächentemperaturen der Heizung wurden mittels Wärmebildtechnik kalibriert. Wenn eine solche Plattform nicht verfügbar ist, kann ein Paar Heizplatten verwendet werden (eine bei 105 °C und eine bei 110 °C).
<ol><li>Load [18F]fluorid-Stammlösung (mit Phasentransferkatalysator).<ol>
<li>Laden Sie mit einer Mikropipette einen 8 μL-Tropfen [18F]fluorid-Stammlösung auf den ersten Reaktionspunkt eines Multireaktionschips. Messen Sie die Aktivität des Chips, indem Sie ihn in einen Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.</li>
		<li>Entfernen Sie den Chip aus dem Dosiskalibrator und laden Sie dann einen 8 μL-Tröpfchen [18F] Fluorid-Stammlösung auf die zweite Reaktionsstelle. Messen Sie die Aktivität auf dem Chip, indem Sie ihn erneut in den Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.</li>
		<li>Berechnen Sie die pro Reaktionsstelle belastete Aktivität, indem Sie die Aktivitätsmessung nach dem Laden des Radioisotops durchführen und die vorherige Messung (zerfallskorrigiert) subtrahieren, bevor diese Stelle geladen wurde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie den Multireaktionschip an der Heizung aus.<ol>
<li>Fügen Sie eine dünne Schicht Wärmeleitpaste auf die Keramikheizung hinzu.</li>
		<li>Legen Sie den Chip vorsichtig mit einer Pinzette auf die Heizung, um das Verschütten der Tröpfchen zu vermeiden, und richten Sie die Referenzecke des Chips mit der Referenzecke der Heizung aus (siehe Abbildung 3B). Der Chip wird die Heizung um einen kleinen Betrag überhängen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trocknen Sie den [18F]fluorid und Phasentransferkatalysator.<ol>
<li>Erhitzen Sie den Chip für 1 minute, indem Sie die Heizung im Regelprogramm auf 105 °C einstellen, um die Tröpfchen trocken zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand von [18F] Fluorid und TBHACO3zu hinterlassen. Kühlen Sie nach 1 minute den Chip ab, indem Sie die Heizung ausschalten und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie die Vorläuferlösung hinzu.<ol>
<li>Mit einer Mikropipette wird eine 6 μL-Lösung des Fallypridvorläufers auf den getrockneten Rückstand an der ersten Reaktionsstelle hinzugefügt.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Verwenden Sie den Optimierungsplan, um zu bestimmen, welche Konzentration der Verdünnungsreihe für jede Reaktionsstelle verwendet wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Fluorierungsreaktion durch.<ol>
<li>Erhitzen Sie jeden Chip für 7 min auf 110 °C mit dem Steuerungsprogramm, um eine Radiofluorierungsreaktion durchzuführen. Kühlen Sie anschließend den Chip, indem Sie die Heizung ausschalten und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie die Rohprodukte von den Reaktionsstellen.<ol>
<li>Sammeln Sie das Rohprodukt an der ersten Reaktionsstelle, indem Sie 10 μL Sammellösung aus dem dafür vorgesehenen Mikrozentrifugenröhrchen über mikropipette hinzufügen. Nachdem Sie 5 s gewartet haben, verwenden Sie die Mikropipette (mit der gleichen Spitze installiert), um das verdünnte Rohprodukt abzusaugen und in das entsprechende markierte Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt 4 Mal mit derselben Pipettenspitze für alle Operationen.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Sammelvorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Syntheseanalyse zur Bestimmung der Reaktionsleistung und optimaler Bedingungen
<ol><li>Bestimmen Sie die "Sammeleffizienz" für die erste Reaktion auf dem Chip.<ol>
<li>Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem gesammelten Rohprodukt der ersten Reaktionsstelle in den Dosiskalibrator, um die Aktivität zu messen. Zeichnen Sie die Messung und den Zeitpunkt der Messung auf.</li>
		<li>Berechnen Sie die Sammeleffizienz, indem Sie die Aktivität des gesammelten Rohprodukts durch die für dieselbe Reaktionsstelle gemessene Startaktivität dividieren (Zerfallskorrektur der Aktivitätswerte auf denselben Zeitpunkt).</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Zusammensetzung (Fluorierungseffizienz) jedes gesammelten Rohprodukts. HINWEIS: Um die Analyse aller Proben in kurzer Zeit praktisch zu machen, wird die Fluorierungseffizienz mit einem zuvor beschriebenen Hochdurchsatz-Radiodünnschichtchromatographie -Ansatz (Radio-TLC) analysiert14. Diese Technik ermöglicht es, bis zu acht Proben parallel zu verarbeiten, indem sie nebeneinander (5 mm Raster, 0,5 μL pro Spot) auf einer einzigen TLC-Platte spotten, dann zusammen entwickeln und gemeinsam mit Cerenkov Imaging14,15auslesen. Für die Beispieloptimierung mit 16 parallelen Reaktionen werden 2 TLC-Platten benötigt. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung der Radio-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Radio-HPLC) für die Analyse, obwohl die Zeit für Trennung, Reinigung und Gleichgewicht die Anzahl der proben, die analysiert werden können, begrenzen kann.<ol>
<li>Zeichnen Sie für jede TLC-Platte (50 mm x 60 mm) mit einem Bleistift eine Linie in 15 mm Entfernung von einer 50-mm-Kante (unten) und eine andere Linie in 50 mm Entfernung von derselben Kante. Die erste Zeile ist die Ursprungslinie; die zweite ist die Lösungsmittelfrontlinie. Zeichnen Sie 8 kleine "X" entlang der Ursprungslinie in einem Abstand von 5 mm, um die Probenposition für jede der 8 "Bahnen" zu definieren.</li>
		<li>Mit einer Mikropipette werden 0,5 μL des ersten Rohprodukts auf die TLC-Platte am "X" für die erste Spur übertragen. Wiederholen Sie dies für zusätzliche Rohprodukte (bis zu 8 pro TLC-Platte). Warten Sie, bis die rohen Produktflecken auf der TLC-Platte getrocknet sind.</li>
		<li>Für jede TLC-Platte wird eine mobile Phase von 60% MeCN in 25 mMNH4 HCO2mit1% TEA (v/v) entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die Lösungsmittelfront erreicht. Warten Sie, bis das Lösungsmittel auf der TLC-Platte getrocknet ist, und decken Sie es dann mit einem Glasmikroskopobjektträger (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm dick) ab.</li>
		<li>Erhalten Sie ein Radioaktivitätsbild jeder TLC-Platte, indem Sie die Platte für eine 5-minütige Belichtung in ein Cerenkov-Bildgebungssystem legen. Führen Sie Standardbildkorrekturen durch (Dunkelstromsubtraktion, Flachfeldkorrektur, Medianfilterung und Hintergrundsubtraktion).</li>
		<li>Verwenden Sie die ROI-Analyse (Region of Interest) für die erste Spur der ersten TLC-Platte. Zeichnen Sie Bereiche um jedes Band, das in der Spur sichtbar ist. Die Software berechnet den Anteil der integrierten Intensität jeder Region (Band) im Vergleich zur gesamten integrierten Intensität aller Regionen (Bänder).</li>
		<li>Bei dieser mobilen Phase werden bei den angegebenen Retentionsfaktoren folgende Bänder erwartet: Rf = 0,0: Unreacted [18F]fluorid; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Nebenprodukt. Bestimmen Sie die Fluorierungseffizienz als Anteil der Aktivität im [18F]fallypriden Band.</li>
		<li>Wiederholen Sie diese Analyse für alle anderen Fahrspuren auf allen TLC-Platten. HINWEIS: Wenn keine Cerenkov-Bildgebungskammer verfügbar ist, kann ein optisches In-vivo-Bildgebungssystem für kleine Tiere (präklinisch) verwendet werden, um die TLC-Platten abbilden. Alternativ kann ein 2-dimensionaler TLC-Scanner verwendet werden. Alternativ, wenn nur ein 1-dimensionaler TLC-Scanner verfügbar ist, können die TLC-Platten analysiert werden, indem mit einer Schere in Streifen geschnitten (1 pro Spur) und jeder Streifen einzeln gescannt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmen Sie die rohe radiochemische Ausbeute (Roh-RCY) für jede Reaktionsstelle.<ol>
<li>Bestimmen Sie den Roh-RCY für das erste Rohprodukt, indem Sie die Sammeleffizienz mit der Fluorierungseffizienz multiplizieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Ergebnisse<ol>
<li>Aggregieren Sie Werte für alle Replikationsexperimente zu einer Mittel- und Standardabweichung.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Sammeleffizienz, die Fluorierungseffizienz und den rohen RCY als Funktion des parameters auf, der variiert wurde (Vorläuferkonzentration in diesem Beispiel).</li>
		<li>Wählen Sie die optimalen Bedingungen anhand der gewünschten Kriterien aus. In der Regel ist dies der maximale rohe RCY. Darüber hinaus wird der Punkt oft in einem Bereich gewählt, in dem die Steigung des Diagramms relativ flach ist, was darauf hindeutet, dass er unempfindlich gegen kleine Änderungen des Parameters ist, was ein robusteres Protokoll bietet.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Regenten der University of California haben Sofie, Inc. Technologie lizenziert, die von Dr. van Dam erfunden wurde, und haben sich im Rahmen der Lizenztransaktion an Sofie, Inc. beteiligt. Dr. van Dam ist Gründer und Berater von Sofie, Inc. Die übrigen Autoren erklären keine Interessenkonflikte. Diese Arbeit wurde teilweise vom National Cancer Institute (R33 240201) unterstützt.

Aufgrund der Einschränkungen herkömmlicher radiochemischer Systeme, die nur eine oder eine kleine Anzahl von Reaktionen pro Tag zulassen und eine signifikante Menge an Reagenzien pro Datenpunkt verbrauchen, kann in der Praxis nur ein winziger Teil des gesamten Reaktionsparameterraums untersucht werden, und oft werden Ergebnisse ohne Wiederholungen gemeldet (n = 1). Im Vergleich zu herkömmlichen Systemen macht es diese Multireaktions-Tröpfchen-Radiosyntheseplattform praktisch, umfassendere und strengere Studien der Radios...

Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Radiopharmazeutika werden häufig als Forschungswerkzeuge zur Überwachung spezifischer biochemischer Prozesse in vivo und zur Untersuchung von Krankheiten sowie zur Entwicklung neuer Medikamente und Therapien eingesetzt. Darüber hinaus ist PET ein wichtiges Instrument zur Diagnose oder Staging von Krankheiten und zur Überwachung des Ansprechens eines Patienten auf die Therapie1,2,3. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von PET-Radioisotopen (z. B. 110 min für Fluor-18-markierte Radiopharmazeutika) und der Strahlengefährdung werden diese Verbindungen mit speziellen automatisierten Systemen hergestellt, die hinter der Strahlenabschirmung arbeiten und müssen kurz vor der Verwendung vorbereitet werden.
Aktuelle Systeme, die zur Synthese von Radiopharmazeutika verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie große Chargen produzieren, die in viele Einzeldosen aufgeteilt werden, um die Produktionskosten zu teilen. Während aktuelle Systeme für die Herstellung weit verbreiteter Radiotracer wie [18F]FDG geeignet sind (da mehrere Patientenscans und Forschungsexperimente an einem einzigen Tag geplant werden können), können diese Systeme für die Herstellung neuartiger Radiotracer in der frühen Entwicklungsphase oder weniger häufig verwendeter Radiotracer verschwenderisch sein. Die Volumina, die herkömmliche Systeme verwenden, liegen typischerweise im Bereich von 1-5 ml, und die Reaktionen erfordern Vorläufermengen im Bereich von 1-10 mg. Darüber hinaus ist die Verwendung herkömmlicher Radiosynthesizer bei Optimierungsstudien in der Regel umständlich, da die Apparatur nach dem Gebrauch kontaminiert wird und der Benutzer vor dem nächsten Experiment auf den Zerfall der Radioaktivität warten muss. Abgesehen von den Ausrüstungskosten können die Kosten für das Radioisotop und die Reagenzien daher für Studien, die die Herstellung mehrerer Chargen erfordern, sehr hoch werden. Dies kann beispielsweise bei der Optimierung von Syntheseprotokollen für neuartige Radiotracer auftreten, um eine ausreichende Ausbeute und Zuverlässigkeit für erste in vivo Bildgebungsstudien zu erreichen.
Mikrofluidische Technologien werden zunehmend in der Radiochemie eingesetzt, um mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Systemen zu nutzen4,5,6. Mikrofluidische Plattformen, einschließlich solcher, die auf 1-10 μL Reaktionsvolumina7,8,9basieren, haben eine signifikante Reduzierung des Reagenzienvolumens und des Verbrauchs teurer Vorprodukte sowie kurze Reaktionszeiten gezeigt. Diese Reduzierungen führen zu niedrigeren Kosten, schnelleren Erhitzungs- und Verdampfungsschritten, kürzerer und einfacherer nachgeschalteter Reinigung, einem insgesamt "grüneren" chemischen Prozess10und einer höheren molaren Aktivität der produzierten Radiotracer11. Diese Verbesserungen machen es praktischer, umfangreichere Optimierungsstudien durchzuführen, indem die Reagenzkosten jeder Synthese gesenkt werden. Weitere Vorteile können durch die Durchführung mehrerer Experimente aus einer einzigen Charge von Radioisotopen an einem einzigen Tag erreicht werden. Zum Beispiel können mikrofluidische Strömungschemie-Radiosynthesizer, die im "Entdeckungsmodus" arbeiten, Dutzende von Reaktionen nacheinander durchführen, wobei jede nur 10s des μL-Reaktionsvolumens12verwendet.
Inspiriert von diesen Vorteilen wurde ein Multi-Reaction-Droplet-Array-Chip entwickelt, bei dem Mikrovolumenreaktionen auf eine Reihe von Oberflächenspannungsfallen auf einer Siliziumoberfläche beschränkt sind, die mit einer gemusterten Teflonbeschichtung erzeugt werden. Diese Chips ermöglichen die gleichzeitige Durchführung mehrerer Reaktionen auf der Skala von 1-20 μL, was die Möglichkeit eröffnet, 10 verschiedene Reaktionsbedingungen pro Tag mit jeweils mehreren Replikaten zu untersuchen. In diesem Artikel wird der Nutzen dieses neuen Hochdurchsatzansatzes für die Durchführung schneller und kostengünstiger radiochemischer Optimierungen demonstriert. Die Verwendung von Multireaktions-Tröpfchenchips ermöglicht eine bequeme Untersuchung der Auswirkungen von Reagenzkonzentrationen und Reaktionslösungsmitteln, und die Verwendung mehrerer Chips könnte die Untersuchung der Reaktionstemperatur und -zeit ermöglichen, während gleichzeitig sehr geringe Mengen an Vorläufern verbraucht werden.

<table><tbody><tr><td>2,3-Dimethyl-2-butanol (thexylalkohol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-60-5</td><td>98%</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>KMG Chemikalien</td><td></td><td>Reinraum LP</td></tr><tr><td>Qualität Ammoniumformiat (NH4HCO2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>540-69-2</td><td>97%</td></tr><tr><td>Wasserfreies Acetonitril (MeCN)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td>99,80%</td></tr><tr><td>Keramikheizung</td><td>Watlow</td><td>Utramic CER-1-01-0093</td><td>25 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Cerenkov Bildgebungskammer</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Andere Instrumente können für das Auslesen von DC-Platten verwendet werden, einschließlich: optisches In-vivo-Bildgebungssystem für Kleintiere, 2D-Radio-TLC-Scanner, 1D-Radio-TLC-Scanner</td></tr><tr><td>DI-Wasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten, 3 mL</td><td>Falcon</td><td>13-680-50</td><td></td></tr><tr><td>Dosiskalibrator</td><td>Capintec, Inc.</td><td>CRC-25 PET</td><td></td></tr><tr><td>Fallypride</td><td>ABX Advanced Biochemical Compounds</td><td>1560.0010.000</td><td>Fallypride Referenzstandard, >95%</td></tr><tr><td>[18F]Fluorid in [18O]H2O</td><td>UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility</td><td></td><td>Aufgrund der kurzen Halbwertszeit muss dies aus einem lokalen Radiochemielabor oder einer kommerziellen Radiopharmazie</td></tr> <tr><td>bezogen werdenAbdeckplatten aus Glas (76,2 mm x 50,8 mm x 1 mm dick)</td><td>C& Ein Scientific</td><td>6101</td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc.</td><td>PWM50-PS-R790 Sipinner-System</td><td>PWM50-Steuerbox, PS-Motor, R790-Schüssel</td></tr><tr><td>Hochtemperaturofen</td><td>Carbolite</td><td>HTCR 6 28</td><td></td></tr><tr><td>Kochplatte</td><td>Thermo Scientific</td><td>Super-Nuova HP133425</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td>KMG Chemikalien</td><td></td><td>Reinraum</td></tr><tr><td>LP-Qualität Mask Aligner</td><td>Karl Süss</td><td>MA/BA6</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td>&ge&ge; 99,9%</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.301</td><td>500 &micro; L, farblos, Polypropylen</td></tr><tr><td>Mikropipette (0,5-10 & Mikro; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette (100-1000 & Mikro; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette (10-100 & Mikro; L)</td><td>Labnet</td><td>BioPette P3940-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (0,1-10 & Mikro; L)</td><td>USA Scientific Inc Spitzen</td><td>11113810</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (2-200 & Mikro; L)</td><td>BrandTech</td><td>13-889-143</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen (50-1000 & Mikro; L)</td><td>BrandTech</td><td>13-889-145</td><td></td></tr><tr><td>Fotolack-Entwicklerlösung</td><td>MicroChem</td><td>MEGAPOSIT MF-26A</td><td></td></tr><tr><td>Positiver Fotolack</td><td>MicroChem</td><td>MEGAPOSIT 220-7.0</td><td></td></tr><tr><td>Reaktiver Ionenätzer (RIE)</td><td>Oxford Instruments</td><td>Plasma Lab 80 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Silizium-Wafer-Cutter</td><td>Euro Tool</td><td>CSCB-431.00</td><td></td></tr><tr><td>Silizium-Wafer; 4" Durchmesser</td><td>Silicon Valley Microelectronics Inc.&nbsp;</td><td>0017227-048</td><td>Typ P, bordotiert, Dicke 525 &plusmn; 25 & micro; m</td></tr><tr><td>Teflon AF 2400</td><td>Chemie</td><td>D14896765</td><td>1% Feststoffe</td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumbicarbonat (TBAHCO3)</td><td>ABX Advanced Biochemical Compounds</td><td>808</td><td>Mit Ethanol stabilisierte wässrige Lösung, 0,075 M</td></tr><tr><td>Themalleitende Paste</td><td>OMEGA</td><td>OT-201-2</td><td></td></tr><tr><td>DC-Platten</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05554.0001</td><td>Kieselgel 60 F254, 50 mm x 60 mm, Aluminiumrücken</td></tr><tr><td>Tosyl-Fallypride</td><td>ABX Advanced Biochemical Compounds</td><td>1550.004.000</td><td>Fallypride Vorläufer, >90%</td></tr><tr><td>Trimethylamin (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-50-3</td><td>&ge 99%</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-07387-08</td><td>Edelstahl, feine Spitze</td></tr></tbody></table>

optimierung radiochemischer reaktionen mit droplet arrays

Optimization of Radiochemical Reactions using Droplet Arrays

Aktuelle automatisierte Radiosynthesizer sind für die Herstellung großer klinischer Chargen von Radiopharmazeutika ausgelegt. Sie eignen sich nicht gut für die Reaktionsoptimierung oder die neuartige radiopharmazeutische Entwicklung, da jeder Datenpunkt einen erheblichen Reagenzienverbrauch mit sich bringt und die Kontamination des Geräts Zeit für den radioaktiven Zerfall vor der nächsten Verwendung benötigt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde eine Plattform für die parallele Durchführung von Arrays von Miniatur-Tröpfchenreaktionen entwickelt, die jeweils in einer Oberflächenspannungsfalle auf einem gemusterten Polytetrafluorethylen-beschichteten Silizium-"Chip" eingeschlossen sind. Diese Chips ermöglichen schnelle und bequeme Untersuchungen von Reaktionsparametern wie Reagenzkonzentrationen, Reaktionslösungsmittel, Reaktionstemperatur und -zeit. Diese Plattform ermöglicht den Abschluss von Hunderten von Reaktionen in wenigen Tagen mit minimalem Reagenzienverbrauch, anstatt Monate mit einem herkömmlichen Radiosynthesizer zu dauern.

Zur Veranschaulichung dieser Methode wurde ein repräsentatives Experiment durchgeführt. Unter Verwendung von 16 Reaktionen wurden Optimierungsstudien des radiopharmazeutischen [18F]fallyprids durch unterschiedliche Vorläuferkonzentrationen (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 und 0,6 mM) in Thexylalkohol:MeCN (1:1, v/v) als Reaktionslösungsmittel durchgeführt. Reaktionen wurden bei 110 °C für 7 min durchgeführt. Die Sammlungseffizienz, die Probenzusammensetzung (d. h. die Anteile vo...

Diese Methode beschreibt den Einsatz einer neuartigen Hochdurchsatzmethode, basierend auf tröpfchenchemischen Reaktionen, zur schnellen und wirtschaftlichen Optimierung von Radiopharmazeutika unter Verwendung von Nanomolmengen an Reagenzien.

Optimierung radiochemischer Reaktionen mit Droplet Arrays

Current automated radiosynthesizers are designed to produce large clinical batches of radiopharmaceuticals. They are not well suited for reaction ...

Aktuelle automatisierte Radiosynthesizer sind für die Herstellung großer Chargen weit verbreiteter Radiopharmazeutika wie FDG ausgelegt. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Synthesen, die pro Tag möglich sind, und des relativ hohen Reagenzienverbrauchs sind diese Systeme jedoch nicht gut geeignet, um Syntheseoptimierungsstudien durchzuführen. Mit dieser Technik wird der Durchsatz durch bis zu 16 gleichzeitige Reaktionen parallel deutlich erhöht und der Reagenzienverbrauch um das Hundertfache reduziert.Darüber hinaus werden durch parallele Reaktionen faire Chargen von Radioisotopen benötigt, um eine Studie abzuschließen. Ein erhöhter Durchsatz ermöglicht eine breitere Untersuchung der Reaktionsbedingungen mit einer größeren Anzahl von Replikaten im Vergleich zur Verwendung herkömmlicher Instrumente. Während dieses Protokoll die Optimierung der Vorläuferkonzentration bei der Synthese von Fallyprid zeigt, kann die Technik zur Optimierung anderer Bedingungen und anderer Radiopharmazeutika verwendet werden.Beginnen Sie mit der Herstellung von Chargen von Multireaktions-Mikrotröpfchenchips aus Vier-Zoll-Siliziumwafern unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken. In diesem Protokoll wird die Hochdurchsatzoptimierung der Vorläuferkonzentration mit der Synthese des radiopharmazeutischen Fallyprids demonstriert. 16 gleichzeitige Reaktionen können auf einem einzigen Chip durchgeführt werden.Die zu vergleichenden Bedingungen werden den Reaktionsstellen zugeordnet. Bereiten Sie eine Stammlösung des Reaktionslösungsmittels bestehend aus Thexylalkohol und Acetonitril in einem Eins-zu-Eins-Volumen-Gemisch vor. Stellen Sie sicher, dass das Volumen ausreicht, um die geplante Verdünnungsreihe zu erstellen.Bereiten Sie eine 30-Mikroliter-Stammlösung des Vorläufers im Reaktionslösungsmittel mit der maximal zu untersuchenden Konzentration vor. Aus der Vorläuferlösung und dem Reaktionslösungsmittel werden zwei serielle Verdünnungen in einem Satz von Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt, um die unterschiedlichen Konzentrationen der Vorläuferlösung herzustellen. Bereiten Sie einen weiteren Satz Mikrozentrifugenröhrchen vor, um jedes Rohreaktionsprodukt mit einem Permanentmarker zu sammeln, um jedes Röhrchen mit einer eindeutigen Nummer zu beschriften.Stellen Sie sicher, dass die Gesamtzahl der Mikrozentrifugenröhrchen mit der Anzahl der Bedingungen multipliziert mit der Anzahl der Replikate übereinstimmt. Bereiten Sie einen 10-Milliliter-Bestand an Sammellösung vor, der aus neun bis einem Methanol zu entionisiertem Wasser besteht. Aliquot 50 Mikroliter von jedem in einen zusätzlichen Satz von 16 Mikrozentrifugenröhrchen, die als Sammellösung gekennzeichnet sind.Bereiten Sie eine Fluorid-Stammlösung vor, indem Sie etwa sieben Millicuries der Fluoridquelle mit 56 Mikrolitern 75 Millimolar tetrabutylammoniumbicarbonat mischen und mit DI-Wasser auf bis zu 140 Mikroliter verdünnen. Laden Sie mit einer Mikropipette einen acht Mikroliter tröpfchen Fluorid-Stammlösung auf den ersten Reaktionspunkt eines Multireaktionschips. Messen Sie die Aktivität des Chips, indem Sie ihn in einen Dosiskalibrator legen und den Zeitpunkt aufzeichnen, zu dem die Messung durchgeführt wird.Entfernen Sie den Chip aus dem Dosiskalibrator und laden Sie einen acht Mikroliter tröpfchen Fluorid-Stammlösung auf die zweite Reaktionsstelle. Messen Sie die Aktivität auf dem Chip und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Messung durchgeführt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Reaktionsstellen.Berechnen Sie die pro Reaktionsstelle belastete Aktivität, indem Sie die Aktivitätsmessung nach dem Laden des Radioisotops durchführen und die vorherige Messung subtrahieren, bevor diese Stelle geladen wurde. Um den Multireaktionschip auf der Heizung auszurichten, fügen Sie eine dünne Schicht Wärmeleitpaste auf die Keramikheizung hinzu. Legen Sie den Chip vorsichtig mit einer Pinzette auf die Heizung, um die Referenzecke des Chips mit der Referenzecke der Heizung auszurichten.Der Chip sollte die Heizung um einen kleinen Betrag überhängen. Erhitzen Sie den Chip für eine Minute, indem Sie die Heizung im Regelprogramm auf 105 Grad Celsius einstellen, um die Tröpfchen zu verdampfen und einen getrockneten Rückstand von Fluorid und Tetrabutylammoniumbicarbonat zu hinterlassen. Dann kühlte der Chip, indem sie die Heizung auf 30 Grad Celsius stellte und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschaltete.Fügen Sie mit einer Mikropipette eine Lösung von Fallypridenvorläufer mit sechs Mikrolitern auf den getrockneten Rückstand an der ersten Reaktionsstelle hinzu. Wiederholen Sie dies für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Verwenden Sie den Optimierungsplan, um zu bestimmen, welche Konzentration der Verdünnungsreihe für jede Reaktionsstelle verwendet wird.Erhitzen Sie den Chip sieben Minuten lang mit dem Steuerungsprogramm auf 110 Grad Celsius, um die Radiofluorierungsreaktion durchzuführen, kühlen Sie dann den Chip, indem Sie die Heizung auf 30 Grad Celsius einstellen und den Lüfter mit dem Steuerungsprogramm einschalten. Sammeln Sie das Rohprodukt an der ersten Reaktionsstelle, indem Sie 10 Mikroliter Sammellösung aus dem dafür vorgesehenen Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Nachdem Sie fünf Sekunden gewartet haben, saugen Sie das verdünnte Rohprodukt an und geben Sie es in das entsprechende Auffang-Mikrozentrifugenröhrchen.Wiederholen Sie diesen Vorgang insgesamt viermal mit derselben Pipettenspitze und schließen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diese Schritte, um das Rohprodukt von allen anderen Reaktionsstellen auf dem Chip zu sammeln. Um die Sammeleffizienz für die erste Reaktion auf dem Chip zu bestimmen, legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem gesammelten Rohprodukt der ersten Reaktionsstelle in den Dosiskalibrator, um die Aktivität zu messen.Zeichnen Sie die Messung und den Zeitpunkt der Messung auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der gesammelten Rohölprodukte. Berechnen Sie die Sammeleffizienz, indem Sie die Aktivität des gesammelten Rohprodukts durch die für dieselbe Reaktionsstelle gemessene Startaktivität dividieren.Wiederholen Sie dies für alle anderen Reaktionsstellen auf dem Chip. Als nächstes analysieren Sie die Zusammensetzung jedes gesammelten Rohölprodukts. Zeichnen Sie mit einem Bleistift eine Linie, die 15 Millimeter von der Unterkante der TLC-Platte und eine weitere Linie 50 Millimeter von der gleichen Kante entfernt ist.Die erste Linie ist die Ursprungslinie und die zweite ist die Lösungsmittelfrontlinie. Zeichnen Sie acht kleine X entlang der Ursprungslinie im Abstand von fünf Millimetern, um die Probenposition für jede der acht Bahnen zu definieren. Übertragen Sie mit einer Mikropipette 0,5 Mikroliter des ersten Rohprodukts auf die TLC-Platte am X für die erste Spur.Wiederholen Sie dies für zusätzliche Rohölprodukte und warten Sie dann, bis die Stellen getrocknet sind. Entwickeln Sie jede TLC-Platte mit einer mobilen Phase von 60% Acetonitril in 25 Millimolar-Ammoniumformiat mit 1% TEA, bis die Lösungsmittelfront die Lösungsmittelfront erreicht. Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt die TLC-Platte aus der Kammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel auf der TLC-Platte getrocknet ist, legen Sie die TLC-Platte dann in das Cerenkov-Bildgebungssystem und bedecken Sie sie mit einem Glasmikroskopobjektträger.Erhalten Sie ein Radioaktivitätsbild jeder TLC-Platte, indem Sie das Cerenkov-Bildgebungssystem auf eine fünfminütige Belichtung einstellen, dann die erzeugte Datei des Bildes auf der TLC-Platte auswählen und Standardbildkorrekturen durchführen. Verwenden Sie die Regionsanalyse für die erste Spur der ersten TLC-Platte. Zeichnen Sie Bereiche um jedes Band, das in der Spur sichtbar ist, und berechnen Sie dann den Anteil der integrierten Intensität jeder Region im Vergleich zur gesamten integrierten Intensität aller Regionen.Bestimmen Sie die Fluorierungseffizienz als Anteil der Aktivität im Fallypridenband. Wiederholen Sie diese Analyse für alle anderen Fahrspuren auf allen TLC-Platten. Berechnen Sie dann die rohe radiochemische Ausbeute für jede Reaktion und wählen Sie die optimale Vorläuferkonzentration, indem Sie die rohe radiochemische Ausbeute als Funktion der Vorläuferkonzentration untersuchen.Optimierungsstudien des radiopharmazeutischen Fallyprids wurden durch unterschiedliche Vorläuferkonzentrationen in Thexylalkoholacetonitril durchgeführt. Reaktionen wurden bei 110 Grad Celsius pro sieben Minuten durchgeführt. Die Sammlungseffizienz und die Probenzusammensetzung werden hier gezeigt.Die Fluorierungseffizienz nahm mit zunehmender Vorläuferkonzentration zu und die Konzentration von nicht umgesetztem Fluorid nahm ab. Bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen gab es eine geringe Menge radioaktives Nebenprodukt, das bei den höheren Vorläuferkonzentrationen nicht gebildet wurde. Die Sammeleffizienz war für die meisten Bedingungen nahezu quantitativ, obwohl sie bei niedrigen Vorläuferkonzentrationen leicht zurückging.Die höchste rohe radiochemische Ausbeute wurde mit einer 39-millimolaren Vorläuferkonzentration erreicht. Unter dieser Bedingung betrug die Fluorierungseffizienz 96%Der rohe RCY betrug 87% und es gab keine beobachtete radioaktive Nebenproduktbildung. Es ist wichtig, einen Kartenplan zu haben, welcher Reaktionszustand welchem Reaktionströpfchen auf dem Chip entspricht, und entsprechend markierte Reagenzröhrchen und Produktsammelröhrchen zu haben, die während des Experiments überprüft werden können.Das Verfahren kann zur Optimierung anderer Reaktionsbedingungen wie Basenmenge, Lösungsmittelart oder Reaktionsvolumen eingesetzt werden. Es kann auch verwendet werden, um die Synthese anderer Radiopharmazeutika zu optimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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