Name: Kardiale Reaktion auf β-adrenerge Stimulation durch Druck-Volumen-Schleifenanalyse bestimmt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie die Druck-Volumen-Schleifenanalyse zur Bewertung der kardialen Funktion und der β-adrenergen Reserve bei Mäusen. Diese offene Thorax-Methode ermöglicht präzise Messungen der Herzkontraktilität.

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Wir danken Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter und dem Team der Interfakultären Biomedizinischen Forschungseinrichtung (IBF) der Universität Heidelberg für die kompetente technische Unterstützung.
Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), dem BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung), einem baden-württembergischen Landesinnovationsfonds und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 und dem Sonderforschungsbereich (SFB) 1118.

Alle Tierversuche wurden nach den Vorschriften des Regierungspräsidiums Karlsruhe und der Universität Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) genehmigt und durchgeführt und entsprechen den Richtlinien der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz wissenschaftlich verwendeter Tiere. Die in diesem Protokoll gezeigten Daten stammen von männlichen Wildtypen C57Bl6/N (17 ± 1,4 Wochen). Mäuse wurden unter spezifizierten pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung (IBF) der Medizinischen Fakultät Heidelberg gehalten. Die Mäuse waren in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, mit einer relativen Luftfeuchtigkeit zwischen 56-60%, einem 15-fachen Luftwechsel pro Stunde und einer Raumtemperatur von 22 ° C +/- 2 ° C. Sie wurden in konventionellen Käfigen Typ II oder Typ II gehalten, die lange zeit mit Tierstreu und Seidenpapieren als Bereicherung versehen waren. Standard autoklavierte Nahrung und autoklaviertes Wasser standen zur Verfügung, um ad libitumzu konsumieren.
1. Herstellung von Instrumenten und Arzneimittellösungen
<ol><li>Zentraler Venenkatheter: Schneiden Sie den Mikroschlauch (0,6 mm Außendurchmesser) in ~20 cm lange Katheterröhren. Verwenden Sie eine Pinzette, um ein Ende des Rohres auf die Spitze einer 23-Gauge-Kanüle zu ziehen. Schneiden Sie das andere Ende des Schlauches diagonal ab, um eine scharfe Spitze zu erzeugen, die die Oberschenkelvene durchbohren kann.</li>
	<li>Endotrachealtube: Für ein Intubationsröhrchen schneiden Sie eine 20-Gauge-Venen-Kanüle von 3 cm Länge, um den Spritzenaufsatz zu entfernen.<ol>
<li>Wenn das Intubationsrohr nicht perfekt in den Ventilatoranschluss passt, wickeln Sie den Parafilm über das Ende des Rohrs, an dem das Beatmungsgerät angeschlossen ist. Die Verbindung muss stabil und durch die Eindickung abgedichtet sein (Abbildung 1A). Kürzen Sie den Metallführungsstift der 20-Gauge-Venenkanüle auf 2,7 cm und verwenden Sie ihn als Intubationshilfe. Verfeinerte Ansätze für die Intubation, einschließlich Lichtfasern zur Erleichterung der Visualisierung der Luftröhre, werden ebenfalls gut beschrieben, zum Beispiel von Das und Mitarbeitern16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anästhesiemischung für die Intubation: Mischen Sie 200 μL Heparin (1000 I.E./ml) mit 50 μL 0,9% NaCl und 750 μL 2 mg/ml-Etiomidat aus einem Produkt auf Öl-in-Wasser-Basis. Verwenden Sie 7 μL/g Körpergewicht (BW) für jede Maus (0,1 mg/kg BW Buprenorphin 10 mg/kg BW-Etiomidat).</li>
	<li>Muskelrelaxans: Lösen Sie 100 mg Pancuronium-Bromid in 100 ml 0,9% NaCl auf. Verwenden Sie 1,0 μL/g Körpergewicht (1 mg/kg KG) für jede Maus.</li>
	<li>Isoproterenollösungen: Lösen Sie 100 mg Isoproterenol in 100 ml 0,9% NaCl (1 μg/μL) auf. Die folgenden Verdünnungen (Tabelle 1) werden vorbereitet und jeweils in eine 1 ml Spritze gegeben.<ol>
<li>Um die Verdünnung 1 zu erhalten, verdünnen Sie den Bestand 1:1,8. Um die Verdünnung 2 zu erhalten, verdünnen Sie die Brühe 1:6. Um Verdünnung 3 zu erhalten, verdünnen Sie die Verdünnung 1 in 1:10. Schließlich erhält man Verdünnung 4 durch eine 1:10 Verdünnung der Verdünnung 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>15% hypertones NaCl (w/v): 1,5 g 0,9% NaCl in 10 mL doppelt destilliertemH2O auflösen. Die Lösung wird mit einem 0,45 μm Porenspritzenfilter filtriert.</li>
	<li>Herstellung von 12,5% iger Albuminlösung (w/v): 1,25 g Rinderserumalbumin in 10 ml 0,9% NaCl auflösen. Die Lösung bei 37 °C für 30 min inkubieren. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und die Lösung mit einem 0,45 μm Porenspritzenfilter filtrieren.</li>
	<li>Vorbereitung des Setups: Zuerst die Heizplatte einschalten und auf 39-40 °C einstellen. Legen Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte Spritze auf das Heizkissen und übertragen Sie den PVL-Katheter (Pressure-Volume Loop) in die Spritze. Den Katheter mindestens 30 Minuten vor der Anwendung zur Stabilisierung vorbrüsten. Das von uns verwendete Setup besteht aus einem 1,4-F-Druckleitfähigkeitskatheter, einer Steuereinheit und der entsprechenden Software, und es ist grafisch in Abbildung 1B beschrieben und Anbieterreferenzen sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt .</li>
</ol>2. Anästhesie
<ol><li>Buprenorphin (0,1 mg/kg KÖRPERGEWICHT intraperitoneal) 30 min vor der Intubation injizieren.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine Acrylglaskammer, die mit 2,5% Isofluran vorgesättigt und mit einem Heizkissen auf dem Boden der Kammer vorgewärmt ist.</li>
	<li>Sobald die Maus schläft (fehlender Reflex), wird die Anästhesiemischung (7 ml/kg KG) mit 10 mg/kg Etipradat und Heparin (1.200 I.E./kg KG) intraperitoneal injiziert.</li>
</ol>3. Belüftung
<ol><li>Das Tier wird 3-4 Minuten nach der Anästhesieinjektion auf die Intubationsplattform (Abbildung 1C) überführt. Die Maus hängt an den Zähnen mit der Dorsalansicht zum Bediener.</li>
	<li>Heben Sie die Zunge vorsichtig mit einer Pinzette an. Um die Stimmritze zu identifizieren, heben Sie den Unterkiefer der Maus mit einer zweiten Pinzette leicht an.</li>
	<li>Führen Sie den Endotrachealtubus (Abbildung 1A) vorsichtig in die Luftröhre ein und entfernen Sie die Führungsstange.</li>
	<li>Übertragen Sie das Tier auf die Heizplatte, legen Sie es auf die Rückseite und verbinden Sie das Intubationsrohr mit dem Kleintierbeatmungsgerät.</li>
	<li>Stellen Sie die Atemfrequenz auf 53,5 x (Körpergewicht in Gramm)-0,26 [min-1], wie von anderen beschrieben12, und das Tidalvolumen auf maximalen Inspiratordruck von 11 ± 1 cmH2O ein.</li>
	<li>Fixieren Sie vorsichtig die Extremitäten der Maus auf der Heizplatte mit Klebestreifen und tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.</li>
	<li>Setzen Sie einen rektalen Temperaturfühler ein und halten Sie die Körperkerntemperatur bei 37 ± 0,2 °C.</li>
	<li>Installieren Sie ein 1-Kanal-EKG und überwachen Sie die Herzfrequenz online als Indikator für Anästhesietiefe und -stabilität.</li>
	<li>Bei Fehlen interdigitaler Reflexe intraperitoneal 1 mg/kg KÖRPERGEWICHT des Muskelrelaxans Pancuroniumbromid injizieren. Dies verhindert respiratorische Artefakte während pvl-Messungen.</li>
</ol>4. Chirurgie
<ol><li>Allgemeine Empfehlungen<ol>
<li>Während der Operation mit ~ 1,5-2% Isofluran belüften, das mit O2 verdampftist. Die Isoflurankonzentration kann auch von Variablen wie Mausstamm, Geschlecht, Alter und Gewicht der Tiere abhängen, muss aber individuell und experimentell bestimmt werden und die Werte hier sind Referenz für den C57BL6/N-Mausstamm. Wichtig ist, dass das Beatmungsgerät an ein Absaugsystem angeschlossen ist, um zu verhindern, dass der Bediener Isofluran einatmet.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Vergrößerung zwischen 1,5-4x aus dem Stereomikroskop für chirurgische Eingriffe. HINWEIS: Beachten Sie die institutionellen/lokalen Leitlinien zur Vorbereitung des Tieres auf Operationen ohne Überleben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Femurkanüle<ol>
<li>Spülen Sie den Hinterteil mit 70% Ethanol ab, schneiden Sie die linke Leistenregion ein und legen Sie die linke Oberschenkelvene frei.</li>
		<li>Sprengen Sie die Epigastrikel und vene mit einer Kauterisation.</li>
		<li>Ligat die Oberschenkelvene mit einer Nähte, die distal zum Katheterzugang platziert wird.</li>
		<li>Passieren Sie eine Naht unter der Oberschenkelvene und bereiten Sie einen Knoten schädel der Punktionsstelle vor. Punktion der Oberschenkelvene mit dem vorbereiteten Mikroröhrchen (siehe Schritt 1.1), das an einer 1 ml Spritze befestigt ist.</li>
		<li>Binden Sie den Knoten fest, um das Rohr im Inneren des Gefäßes zu befestigen.</li>
		<li>Wirken Sie dem Flüssigkeitsverlust durch die Infusion von 0,9% NaCl, ergänzt mit 12,5% Albumin, bei einer Infusionsrate von 15 μL/min mit einer automatischen Spritzenpumpe entgegen. Halten Sie das exponierte Gewebe außerdem mit vorgewärmtem 0,9% NaCl feucht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thorakotomie<ol>
<li>Spülen Sie den Thorax mit 70% Ethanol ab.</li>
		<li>Schneiden Sie die Haut direkt unter dem Xyphoid-Prozess ein und trennen Sie die Brustmuskeln stumpf mit einer Pinzette oder einem Kauterium von der Brustwand.</li>
		<li>Heben Sie den Xyphoid-Prozess mit einer Pinzette an und schneiden Sie dann die Brustwand durch, die sich seitlich auf beiden Seiten mit einem Kauterium bewegt, bis das Zwerchfell von unten vollständig sichtbar ist.</li>
		<li>Schneiden Sie das Zwerchfell von unten ein und legen Sie die Herzspitze frei. Entfernen Sie dann vorsichtig das Perikard mit einer Pinzette.</li>
		<li>Führen Sie eine begrenzte Costotomie auf der linken Seite durch, wie zuvor beschrieben6.</li>
		<li>Führen Sie eine Naht unter der Vena caval inferior durch, um in späteren Stadien eine Vorlastreduktion durchzuführen.</li>
		<li>Punktieren Sie die Herzspitze vorsichtig mit einer 25-Gauge-Kanüle (maximal 4 mm). Entfernen Sie die Kanüle und führen Sie den PV-Katheter ein, bis sich alle Elektroden im Ventrikel befinden.</li>
		<li>Stellen Sie die Position des Katheters durch sanfte Bewegungen und Drehungen ein, bis rechteckige Schlaufen erhalten sind (Abbildung 2A).</li>
		<li>Halten Sie immer das gesamte exponierte Gewebe feucht mit vorgewärmtem 0,9% NaCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Messungen
<ol><li>Allgemeine Empfehlungen<ol>
<li>Während der Messungen mit ~ 1,5-2% Isofluran belüften, das mit 100% O2 verdampftist.
</li>
		<li>Führen Sie 2 Baseline-Messungen sowie 2 Vena-Cava-Okklusionen für jeden Schritt des Dosis-Wirkungs-Protokolls durch. HINWEIS: Es ist wichtig, dass nach dem ersten und zweiten Vena-Cava-Verschluss sowohl die Druck- als auch die Volumenwerte auf Steady-State-Werte wie vor der ersten Okklusion zurückkehren. Diese Beobachtung ist notwendig, um eine Verschiebung der Katheterposition aufgrund serieller Reduktionen des intraventrikulären Volumens zu erkennen. Wäre eine Verschiebung der Katheterposition der Fall, würden vor allem Volumenwerte verschoben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Online-Analyse der Parameter (Herzfrequenz, Schlagvolumen, dP / dtmax)durch und warten Sie, bis die Steady-State-Herzfunktion erreicht ist. Für den erwarteten Parameterbereich mit der hier verwendeten Einstellung bei C57Bl6/N-Mäusen verweisen wir auf die veröffentlichten Ergebnisse6.</li>
	<li>Stoppen Sie das Beatmungsgerät an der Endexspirationsposition und notieren Sie die Ausgangsparameter. Reduzieren Sie nach 3 bis 5 Sekunden die kardiale Vorbelastung, indem Sie die Naht unter der Vena caval inferior mit einer Pinzette anheben, um vorlastunabhängige Parameter zu erhalten (Abbildung 2B). Schalten Sie das Beatmungsgerät ein. Warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion, bis die hämodynamischen Parameter stabilisiert sind.</li>
	<li>Nach Erhalt der Messungen unter basalen Bedingungen fahren Sie mit der Dosis-Wirkungs-Beziehung von Isoproterenol fort, indem Sie zu den vorbereiteten Spritzen wechseln. Hier bleibt die Infusionsrate unverändert, um Veränderungen der kardialen Vorbelastung zu vermeiden. Achten Sie beim Wechseln der Spritze darauf, keine Luftblasen zu infundieren.<ol>
<li>Warten Sie mindestens 2 Minuten, bis eine neue Steady-State-Herzfunktion erreicht ist, stoppen Sie das Beatmungsgerät erneut an der endexspiratorischen Position und zeichnen Sie die Ausgangsparameter auf. Reduzieren Sie nach 3 bis 5 Sekunden die kardiale Vorbelastung, indem Sie die Naht unter der Vena caval inferior anheben, um vorlastunabhängige Parameter zu erhalten.</li>
		<li>Warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion. Anschließend auf die vorbereitete Spritze mit der nächsten Isoproterenolkonzentration umschalten und die Aufzeichnungen der Baseline- und Preload-unabhängigen Parameter wiederholen. HINWEIS: Artefakte wie die endsystolische Druckspitze (ESPS, Abbildung 2C)können während der Erhöhung der Dosierung von Isoproterenol auftreten, die aus einer Kathetereinklemmung resultiert. Artefakte, die vor dem Beginn der basalen Parameter auftreten, können durch Neupositionierung des Katheters leicht korrigiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Kalibrierung
HINWEIS: Die Kalibrierungsverfahren können je nach verwendetem PVL-System variieren.
<ol><li>Kalibrierung der Parallelleitung<ol>
<li>Schließen Sie nach der letzten Messung der Isoproterenol-Dosis-Wirkungs-Beziehung eine Spritze mit einer 15%igen NaCl-Lösung an die Oberschenkelkanüle an. Füllen Sie vorsichtig 5 μL der hypertonen Lösung, die in der Röhre verbleibt, bis sich das PVL während der Online-Visualisierung leicht nach rechts verschiebt. Warten Sie dann, bis die Schleifen wieder in den stationären Zustand zurückkehren.</li>
		<li>Stoppen Sie das Beatmungsgerät am Ende der Exspiration und injizieren Sie innerhalb von 2 bis 3 Sekunden einen Bolus von 10 μL 15% NaCl. Überprüfen Sie, ob sich PVL während der Online-Visualisierung weitgehend verbreitert und nach rechts verschoben wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalibrierung von Leitfähigkeit zu Volumen<ol>
<li>Warten Sie 5 Minuten, nicht weniger, damit der hypertone Salzbolus vollständig verdünnt ist. Anschließend den Katheter entfernen und mit einer 1 mL Spritze und einer 21-Gauge-Kanüle mindestens 600 μL Blut aus dem linken Ventrikel des schlagenden Herzens entnehmen. Zu diesem Zeitpunkt wird das Tier unter Tiefernarkose und Analgesie durch massive Blutungen eingeschläfert, indem die Beatmung und Entfernung des Herzens gestoppt wird.</li>
		<li>Das Blut wird in die vorgewärmte (in einem Wasserbad bei 37 °C) Kalibrierküvette mit Zylindern bekannten Volumens überführt. Legen Sie den PV-Katheter zentral in jeden Zylinder und zeichnen Sie den Leitwert auf. Durch die Berechnung einer Standardkurve für jedes Tier können die Leitwerteinheiten in absolute Volumenwerte umgerechnet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Würdigung
<ol><li>Nach erfolgreichen PVL-Messungen unter basalen Bedingungen und Isoproterenol-Stimulation visualisieren, digitalisieren, berechnen und extrahieren Sie Parameter, die die Herzfunktion charakterisieren (wie PRSW, dP/dt, enddiastolischer Druck und Volumen, endsystolischer Druck und Volumen, Relaxationskonstante Tau, unter anderem) mit einer geeigneten PVL-Analysesoftware. Weitere statistische Analysen und grafische Darstellungen können mit standardisierter Analysesoftware durchgeführt werden.</li>
	<li>Analyse von Preload-unabhängigen Parametern HINWEIS: Für diesen Schritt ist es entscheidend, das Verfahren zu standardisieren.<ol>
<li>Wählen Sie die ersten 5-6 PVLs, die eine abnehmende Vorspannung während aller Messungen zeigen, für die Analyse der vorlastunabhängigen Parameter (Abbildung 2D). Eine konstante Anzahl von PVLs, die für die Analyse während der Vorlastreduzierung ausgewählt werden, verringert die Variabilität zwischen den Messungen der erhaltenen Parameter.</li>
		<li>Berechnen Sie den Mittelwert der beiden Messungen für jeden Schritt des Protokolls.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Es muss kein Interessenkonflikt erklärt werden.

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der in vivo Herzfunktion bei Mäusen unter zunehmender β-adrenerger Stimulation zur Verfügung. Das Verfahren kann verwendet werden, um sowohl Die Basisparameter der Herzfunktion als auch die adrenerge Reserve (z. B. Inotropie und Chronotropie) bei genetisch veränderten Mäusen oder bei Eingriffen zu adressieren. Der wichtigste Vorteil von PVL-Messungen (Pressure-Volume Loop) im Vergleich zu anderen Mitteln zur Bestimmung der Herzfunktion ist die Analyse der intrinsischen, lastunab...

Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen typischerweise die Herzfunktion. Diese Frage weist auf die Bedeutung der Beurteilung der detaillierten In-vivo-Herzfunktion in Tierversuchsmodellen hin. Tierversuche sind von einem Rahmen der drei Rs (3Rs) Leitprinzipien (Reduce/Refine/Replace) umgeben. Im Falle des Verständnisses komplexer Pathologien mit systemischen Reaktionen (d.h. Herz-Kreislauf-Erkrankungen) auf der aktuellen Entwicklungsebene besteht die Hauptoption darin, die verfügbaren Methoden zu verfeinern. Die Verfeinerung wird auch zu einer Verringerung der erforderlichen Tierzahlen aufgrund der geringeren Variabilität führen, was die Aussagekraft der Analyse und der Schlussfolgerungen verbessert. Darüber hinaus bietet die Kombination von kardialen Kontraktilitätsmessungen mit Tiermodellen von Herzerkrankungen, einschließlich solcher, die durch neurohumorale Stimulation oder durch Drucküberlastung wie Aortenbanding induziert werden, die beispielsweise veränderte Katecholamin/β-adrenerge Spiegel1,2,3,4nachahmen, eine leistungsfähige Methode für präklinische Studien. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die katheterbasierte Methode nach wie vor der am weitesten verbreitete Ansatz zur eingehenden Beurteilung der kardialen Kontraktilität5ist, wollten wir hier eine verfeinerte Messung der In-vivo-Herzfunktion bei Mäusen durch Druck-Volumen-Schleifen-Messungen (PVL) während der β-adrenergen Stimulation auf der Grundlage früherer Erfahrungen, einschließlich der Bewertung spezifischer Parameter dieses Ansatzes, vorstellen6. ( 7) DIE MITGLIEDSTAATEN SIND IN DEN
Zur Bestimmung kardialer hämodynamischer Parameter stehen Ansätze zur Verfügung, die bildgebende oder katheterbasierte Techniken umfassen. Beide Optionen gehen mit Vor- und Nachteilen einher, die für die jeweilige wissenschaftliche Fragestellung sorgfältig abgewogen werden müssen. Bildgebende Ansätze umfassen Echokardiographie und Magnetresonanztomographie (MRT); beide wurden erfolgreich bei Mäusen eingesetzt. Echokardiographische Messungen sind mit hohen Anschaffungskosten durch eine Hochgeschwindigkeitssonde verbunden, die für die hohe Herzfrequenz der Mäuse erforderlich ist. Es ist ein relativ einfacher nicht-invasiver Ansatz, aber er ist variabel unter den Bedienern, die idealerweise Erfahrung in der Erkennung und Visualisierung von Herzstrukturen haben sollten. Darüber hinaus können keine Druckmessungen direkt durchgeführt werden und Berechnungen werden aus der Kombination von Größengrößen und Durchflussmessungen erhalten. Zum anderen hat es den Vorteil, dass mehrere Messungen am selben Tier durchgeführt werden können und die Herzfunktion beispielsweise während des Krankheitsverlaufs überwacht werden kann. Hinsichtlich der Volumenmessung ist die MRT das Goldstandardverfahren, aber ähnlich wie bei der Echokardiographie sind keine direkten Druckmessungen möglich und es können nur vorlastabhängige Parameter erhalten werden8. Limitierende Faktoren sind auch die Verfügbarkeit, der Analyseaufwand und die Betriebskosten. Hier sind katheterbasierte Methoden zur Messung der Herzfunktion eine gute Alternative, die zusätzlich die direkte Überwachung des intrakardialen Drucks und die Bestimmung lastunabhängiger Kontraktilitätsparameter wie preload recruitable stroke work (PRSW)9ermöglichen. Die ventrikulären Volumina, die mit einem Druckleitfähigkeitskatheter (durch Leitfähigkeitsbestimmung) gemessen werden, sind jedoch kleiner als die aus dem MRT, aber die Gruppenunterschiede werden im gleichen Bereich beibehalten10. Um zuverlässige Volumenwerte zu ermitteln, ist die entsprechende Kalibrierung erforderlich, die ein kritischer Schritt bei den PVL-Messungen ist. Es kombiniert ex vivo Messungen der Blutleitfähigkeit in volumenkalibrierten Küvetten (Umwandlung von Leitfähigkeit in Volumen) mit der in vivo Analyse für die Parallelleitung des Myokards während der Bolusinjektion der hypertonen Kochsalzlösung11,12. Darüber hinaus sind die Positionierung des Katheters im Ventrikel und die korrekte Ausrichtung der Elektroden entlang der Längsachse des Ventrikels entscheidend für die Nachweisbarkeit des von ihnen erzeugten umgebenden elektrischen Feldes. Mit der reduzierten Größe des Mausherzens ist es möglich, Artefakte zu vermeiden, die durch Veränderungen der intraventrikulären Ausrichtung des Katheters verursacht werden, selbst in erweiterten Ventrikeln5,10, aber Artefakte können sich unter β-adrenerger Stimulationentwickeln 6,13. Zusätzlich zu den Leitwertmethoden schien die Entwicklung der zulassungsbasierten Methode die Kalibrierschritte zu vermeiden, aber hier werden die Volumenwerte eher überschätzt14,15.
Da die Maus eines der wichtigsten präklinischen Modelle in der kardiovaskulären Forschung ist und die β-adrenerge Reserve des Herzens von zentralem Interesse in der Herzphysiologie und -pathologie ist, stellen wir hier ein verfeinertes Protokoll zur Bestimmung der in vivo Herzfunktion bei Mäusen durch PVL-Messungen während β-adrenerger Stimulation vor.

<table><tbody><tr><td>1.4F SPR-839 Katheter</td><td>Millar Instruments, USA</td><td>840-8111</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>Beckton Dickinson, USA</td><td>REF303172</td><td></td></tr><tr><td>Bio Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Bridge-Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE221</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin Roth</td><td>, Deutschland</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphinhydrochlorid</td><td>Bayer, Deutschland</td><td>4007221026402</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrierküvette</td><td>Millar, USA</td><td>910-1049</td><td></td></tr><tr><td>Differenzdruckmessumformer MPX</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Deutschland</td><td>Typ 39912</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5/45</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzetten #7B</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>EcoLab-PE-Micotube</td><td>Smiths, USA</td><td>004/310/168-1</td><td></td></tr><tr><td>Etomidate Lipuro</td><td>Braun, Deutschland</td><td>2064006</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm, Deutschland</td><td>R26881</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte und Steuereinheit</td><td>Labotec, Deutschland</td><td>Heizplatte 062</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter, Deutschland</td><td>HDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>Abbot</td><td>Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Isoprenalinhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I5627</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch mit feiner Bohrung 0,61 mm Außendurchmesser, 0,28 mm ID</td><td>Smiths Medical International Ltd, UK</td><td>Ref. 800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>MiniVent Beatmungsgerät für Mäuse</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Deutschland</td><td>Typ 845</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra PVL System</td><td>Millar Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem, Deutschland</td><td>A3597</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9% isotonisch</td><td>Braun, Deutschland</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Pancuroniumbromid</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>BCBQ8230V</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor 11 Plus</td><td>Harvard Apparat</td><td>Nr. 70-2209</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/35 Steuergerät</td><td>ADInstruments, USA</td><td>PL3504</td><td></td></tr><tr><td>Wiederaufladbares Kauter-Set</td><td>Faromed, Deutschland</td><td>09-605</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>140094-11</td><td></td></tr><tr><td>Software LabChart 7 Pro</td><td>ADInstruments, USA</td><td>LabChart 7.3 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Standard Mausnahrung</td><td>LASvendi GmbH, Deutschland</td><td>Rod18</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Nahtmaterial 8/0</td><td>Suprama, Deutschland</td><td>Ch.B.03120X</td><td></td></tr><tr><td>Venenpunktionskanüle Venflon Pro Safty 20-gauge</td><td>Beckton Dickinson, USA</td><td>393224</td><td></td></tr><tr><td>Kanülenzange für Gefäße</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>00574-11</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (Filtropur S 0.45)</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>Ref. 83.1826</td><td></td></tr></tbody></table>

kardiale reaktion auf β-adrenerge stimulation durch druck-volumen-schleifenanalyse bestimmt

Cardiac Response to &#946;-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis

Die Bestimmung der Herzfunktion ist eine robuste Endpunktanalyse in Tiermodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, um Effekte spezifischer Behandlungen auf das Herz zu charakterisieren. Aufgrund der Machbarkeit genetischer Manipulationen ist die Maus zum häufigsten Säugetiertiermodell geworden, um die Herzfunktion zu untersuchen und nach neuen potenziellen therapeutischen Zielen zu suchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung der Herzfunktion in vivo unter Verwendung von Druck-Volumen-Schleifenmessungen und -analysen unter basalen Bedingungen und unter β-adrenergen Stimulation durch intravenöse Infusion von steigenden Isoproterenolkonzentrationen. Wir bieten ein verfeinertes Protokoll einschließlich Beatmungsunterstützung unter Berücksichtigung des positiven endexspiratorischen Drucks zur Verbesserung negativer Effekte bei Messungen am offenen Brustkorb und einer starken Analgesie (Buprenorphin), um unkontrollierbaren Myokardstress zu vermeiden, der durch Schmerzen während des Eingriffs hervorgerufen wird. Insgesamt ermöglicht die detaillierte Beschreibung des Verfahrens und die Diskussion über mögliche Fallstricke eine hochstandardisierte und reproduzierbare Druck-Volumen-Schleifenanalyse, die den Ausschluss von Tieren aus der experimentellen Kohorte reduziert, indem mögliche methodische Verzerrungen verhindert werden.

Die Druckvolumenschleifenmessung (PVL) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die kardiale Pharmakodynamik von Medikamenten zu analysieren und den kardialen Phänotyp gentechnisch veränderter Mausmodelle unter normalen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Das Protokoll ermöglicht die Beurteilung der kardialen β-adrenergen Reserve im erwachsenen Mausmodell. Hier beschreiben wir eine Open-Chest-Methode unter Isoflurananästhesie in Kombination mit Buprenorphin (Analgetikum) und Pancuronium (Muskelrelaxans), die sich...

Hier beschreiben wir eine Herzdruck-Volumen-Schleifenanalyse unter steigenden Dosen von intravenös infundiertem Isoproterenol zur Bestimmung der intrinsischen Herzfunktion und der β-adrenergen Reserve bei Mäusen. Für die Druck-Volumen-Schleifenmessungen verwenden wir einen modifizierten Open-Chest-Ansatz, bei dem wir die Beatmung mit positivem endexspiratorischem Druck einbeziehen.

Kardiale Reaktion auf β-adrenerge Stimulation durch Druck-Volumen-Schleifenanalyse bestimmt

Determination of the cardiac function is a robust endpoint analysis in animal models of cardiovascular diseases in order to characterize effects of ...

Unser Open-Chest-Ansatz, bei dem wir die Beatmung mit positivem endexspiratorischem Druck einbeziehen, ist für die Beurteilung und Analyse der Herzfunktion in vivo und der Zunahme der beta-adrenergen Stimulation von Bedeutung. Das Verfahren kann verwendet werden, um sowohl die Basisparameter der lastunabhängigen Herzfunktion als auch die beta-adrenerge Reserve bei genetisch veränderten Mäusen oder bei Eingriffen zu adressieren. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, desinfizieren Sie das linke Hinterglied der anästhesierten Maus mit 70% Ethanol und machen Sie einen Schnitt, um die linke Oberschenkelvene freizulegen.Sprengen Sie die Epigastrikel und vene mit einer Kauterisation. Um die Oberschenkelvene besser zu sehen, wird das Sichtfeld von einer Naht durch den Bauch überspannt. Dann wird eine Naht distal zum Katheterzugang gelegt, um die Oberschenkelvene zu ligatieren.Passieren Sie eine Naht unter der Oberschenkelvene und bereiten Sie einen Knoten schädelförmig zur Punktionsstelle vor. Punktieren Sie die Oberschenkelvene mit einem vorbereiteten Mikroröhrchen, das an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist, und befestigen Sie das Röhrchen im Inneren des Gefäßes mit der verknoteten Naht. Um einem Flüssigkeitsverlust entgegenzuwirken, verwenden Sie eine automatische Spritzenpumpe, um 0,9% Natriumchlorid, ergänzt mit 12,5% Albumin, bei einer Infusionsrate von 15 Mikrolitern zu infundieren und das exponierte Gewebe mit vorgewärmtem 0,9% Natriumchlorid zu hydratisieren.Um auf den Thorax zuzugreifen, spülen Sie den Thorax mit 70% Ethanol aus und schneiden Sie die Haut direkt unter dem Xiphoid-Prozess ein. Trennen Sie die Brustmuskeln stumpf von der Brustwand und heben Sie mit einer Pinzette den Xiphoid-Prozess an, damit die Brustwand geschnitten werden kann, bis das Zwerchfell vollständig sichtbar ist. Schneiden Sie das Zwerchfell von unten ein, um die Herzspitze freizulegen, und verwenden Sie eine Pinzette, um das Perikard vorsichtig zu entfernen.Führen Sie eine begrenzte Costotomie auf der linken Seite durch und passieren Sie eine Naht unter der unteren Caval-Vene, um eine nachgeschaltete Vorlastreduktion zu ermöglichen. Mit einer 25-Gauge-Kanüle die Herzspitze vorsichtig punktieren und die Kanüle durch einen Druck-Volumen-Katheter ersetzen, bis sich alle Elektroden im Ventrikel befinden. Stellen Sie dann die Position des Katheters vorsichtig ein, bis rechteckige Schlaufen erhalten sind.Um Druck-Volumen-Schleifenmessungen zu erfassen, führen Sie eine Online-Analyse der interessierenden Herzfunktionsparameter durch und warten Sie, bis eine stationäre Herzfunktion erhalten ist. Stoppen Sie das Beatmungsgerät an der endexspiratorischen Position und notieren Sie die Basisparameter. Verwenden Sie nach 3 bis 5 Sekunden eine Pinzette, um die Naht unter der Vena caval inferior anzuheben, um unabhängige Parameter für die Vorlast zu erhalten, und schalten Sie das Beatmungsgerät ein.Warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion, bis die hämodynamischen Parameter stabilisiert sind. Nachdem Sie die Messung unter basalen Bedingungen erhalten haben, montieren Sie eine isoproterenolbeladene Spritze auf die Spritzenpumpe. Warten Sie mindestens zwei Minuten, bis eine neue Steady-State-Herzfunktion beobachtet wird.Vor dem Absetzen des Atemschutzgeräts in der endexspiratorischen Position und der Aufzeichnung der Basisparameter. Heben Sie nach 3 bis 5 Sekunden die Naht unter der vena caval inferior an, um unabhängige Parameter für die Vorlast zu erhalten, und warten Sie mindestens 30 Sekunden auf die zweite Okklusion. Montieren Sie dann die Spritze mit der nächsten Isoproterenolkonzentration, wiederholen Sie die Baseline und laden Sie unabhängige Parameteraufzeichnungen vor.Um eine parallele Leitfähigkeitskalibrierung durchzuführen, schließen Sie nach der letzten Isoproterenol-Dosis-Wirkungs-Messung eine mit der 15% igen Natriumchloridlösung beladene Spritze an die Oberschenkelkanüle an und infundieren vorsichtig 5 Mikroliter der hypertonen Lösung, bis sich die Druck-Volumen-Schleife leicht nach rechts verschiebt. Warten Sie, bis die Schleifen in den Steady-State zurückkehren, bevor Sie das Beatmungsgerät bei Derendex expiration stoppen und sofort einen 10-Mikroliter-Bolus mit 15% Natriumchlorid injizieren. Überprüfen Sie dann, ob sich die Druck-Volumen-Schleife weitgehend verbreitert und nach rechts verschoben hat.Um ein Konduktanz-zu-Volumen-Verhältnis durchzuführen, warten Sie 5 Minuten, bis der hypertone Kochsalzbolus vollständig verdünnt ist, bevor Sie den Katheter entfernen und eine 1-Milliliter-Spritze verwenden, die mit einer 21-Gauge-Kanüle ausgestattet ist, um mindestens 600 Mikroliter Blut aus dem linken Ventrikel des schlagenden Herzens zu entfernen. Dann das Blut in eine vorgewärmte Kalibrierküvette in einem 37 Grad celsius warmen Wasserbad mit Zylindern eines bekannten Volumens überführen und den Druck-Volumen-Katheter zentral in jeden Zylinder legen, um die Aufzeichnung der Leitfähigkeit zu ermöglichen. Bei dieser offenen Thorax-Druck-Volumen-Schleifen-Messmethode wird, wenn der Katheter korrekt im Ventrikel platziert ist, ein vollständiger Herzzyklus durch eine rechteckige Druck-Volumen-Schleife dargestellt.Wie dargestellt, beginnt systole mit einer Phase der isovolumetrischen Kontraktion, in der beide Herzklappen geschlossen sind. Wenn der ventrikuläre Druck den Aortendruck übersteigt, öffnet sich die Aortenklappe und das Blut wird während der Auswurfphase in die Aorta gepumpt. Anschließend, wenn der Aortendruck den ventrikulären Druck übersteigt, schließt sich die Aortenklappe und die Diastole beginnt.Während der isovolumetrischen Relaxation fällt der ventrikuläre Druck ab, bis der Vorhofdruck den ventrikulären Druck übersteigt und sich die Mitralklappe öffnet. Die passive diastolische Füllung, gekennzeichnet durch die enddiastolische Druck-Volumen-Beziehung, findet dann bis zum Beginn des nächsten Herzzyklus statt. Da es in der Lage ist, die Herzfunktion unabhängig von der Vorlast zu bestimmen, kann die Druck-Volumen-Analyse detaillierte Einblicke in die Herzfunktion, in die Herzkontraktilität liefern.Zum Beispiel induzierte Isoproterenol in dieser Analyse eine signifikante Wirkung auf jede gemessene Herzfunktion und jeden kardialen Kontraktilitätsparameter. Im Gegensatz dazu wurde eine Verringerung der diastolischen Parameter als Reaktion auf steigende Isoproterenolkonzentrationen beobachtet. Eine präzise Katheterplatzierung innerhalb des linken Ventrikels ist entscheidend, um reproduzierbare Schleifen ohne Artefakte zu erhalten.Um die Katheterplatzierung zu optimieren, bevorzugen wir den offenen Brustansatz. Nach PV-Schleifenmessungen kann eine allometrische Endysis bestimmt und Gewebe isoliert werden, um molekulare und histopathologische Veränderungen zu identifizieren, die durch Behandlungen und / oder genetische Veränderungen verursacht werden. Diese Technik ebnet den Weg zur Analyse der beta-adrenergen Reserve in Mausmodellen unter normalen und pathologischen Bedingungen und kann als Vorlage für das Testen anderer Reize verwendet werden.

cardiac-response-to-adrenergic-stimulation-determined-pressure-volume

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Medicine

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Hier wird ein Protokoll zur Beurteilung der biventrikulären Herzfunktion bei Mäusen vorgestellt, indem Druck-Volumen-Schleifen (PV) aus dem rechten und linken Ventrikel im selben Tier unter Verwendung einer geschlossenen Thoraxkatheterisierung erzeugt werden. Der Fokus liegt dabei auf dem technischen Aspekt der Chirurgie und der Datenerfassung.

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Funktionsbeurteilung des Spenderherzens während der Ex-situ-Perfusion : Erkenntnisse aus Druck-Volumen-Schleifen und Oberflächenechokardiographie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Bestimmung der Druck-Volumen-Beziehung durch transösophageale Stimulation, die als wertvolles Werkzeug zur Beurteilung der diastolischen Funktion in Mausmodellen der Herzinsuffizienz dient.

Ein schrittmachergesteuertes Verfahren zur Beurteilung herzfrequenzabhängiger diastolischer Funktionen in murinen Herzinsuffizienzmodellen

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