Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

Dieses Protokoll erläutert die notwendigen Schritte zur Durchführung von Mikrodissektionen, Immunfluoreszenzfärbungen und Mikroskopie speziell für den Sinusknoten und AV-Knoten in der Maus. Die Whole-Mount-Methode ist vorteilhaft, um die exakte 3D-Lokalisation und Morphologie des Sinus- und AV-Knotens zu untersuchen und die Beziehung zum umgebenden Gewebe zu untersuchen. Die Gewebemorphologie bleibt weitgehend erhalten, mit nur minimaler Gewebedehydration und physikalischer Ruptur.

Zu Beginn stechen Sie das Herz mit einer 27-Gauge-Nadel im Bereich der Spitze, indem Sie die Nadel vorsichtig in den linken Ventrikel schieben und vorsichtig fünf bis 10 Milliliter eiskaltes PBS injizieren, um das Herz zu überschwemmen. Hebe das Herz vorsichtig mit einer Pinzette an und schneide die großen Gefäße auf, um das Herz zu entfernen. Legen Sie das Herz in eine Sezierschale, die mit eiskaltem PBS unter dem Präpariermikroskop gefüllt ist.

Nach der Bestimmung der Ausrichtung des Herzens drehen Sie das Herz so, dass sich die Vorderseite des Herzens am unteren Rand der Schale befindet. Blockieren Sie das Herz, indem Sie kleine Stifte durch die Spitze und das Vorhofohr in die Agarose am Boden der Präparierstale stecken. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette und einer Schere vorsichtig nicht-kardiales Gewebe um die obere und untere Hohlvene.

Um den interkavalen Bereich freizulegen, entfernen Sie den Großteil der Herzkammern, indem Sie mit einer Mikroschere parallel zur Rille zwischen den Ventrikeln und den Vorhöfen schneiden. Zur Fixierung und Dehydrierung wurde die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius in 4%-Paraformaldehyd eingelegt. Am nächsten Tag das Herz in 15%ige Saccharoselösung überführen und 24 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation wird das Herz für weitere 24 Stunden bei vier Grad Celsius in eine 30%ige Saccharoselösung überführt. Waschen Sie das Herz in 1%Triton X-100, verdünnt in PBS. Dann blockieren und permeabilisieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius in einer Blockierlösung.

Legen Sie das Herz in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es sieben Tage lang bei vier Grad Celsius mit Kaninchen-Anti-Maus-Antikörpern Connexin 43 und Ratten-Anti-Maus-HTN4-Antikörpern, verdünnt mit Blockierungslösung. Entfernen Sie nach sieben Tagen die Lösung, die Primärantikörper enthält, mit einer Pipette. Waschen Sie das Herz dreimal eine Stunde lang pro Waschgang mit 1%iger Triton X-100-Lösung auf dem Orbitalschüttler.

Wiederholen Sie die Waschschritte nach der Inkubation mit Sekundärantikörpern und DAPI. Nachdem du Plastikringe vorbereitet und mit Plastilin gefüllt hast, legst du das Herz mit der Rückseite des Herzens nach oben in die Plastilinrille. Identifizieren Sie das SAN, das sich auf der dorsalen Seite des Herzens mit der interkavalen Region befindet.

Geben Sie PBS zum Herzen, um die gesamte Luft in der Höhle zu verdrängen, bis das Herz vollständig mit PBS bedeckt ist. Tragen Sie Silikon auf die Ränder des Kunststoffrings auf. Drücken Sie den umgebenden Teil der Probe vorsichtig in das Plastilin, um das Herz zu fixieren, und decken Sie das Herz mit einem Deckglas ab.

Drücken Sie dann vorsichtig auf die Rückseite des Plastilins, um einen Teil des PBS herauszudrücken, und befestigen Sie das Herz an dem Deckglas, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen im Bildbereich vorhanden sind. Positionieren Sie die Whole-Mount-Färbeproben kopfüber auf der Plattform des Konfokalmikroskops und fahren Sie mit der Bildgebung fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Parameter für jeden Kanal des Konfokalmikroskops werden mit der jeweiligen Software eingestellt.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine konfokale mikroskopische Bildgebung sowohl des Sinusknotens als auch des atrioventrikulären Knotens bei Mausherzen durchzuführen. Die spezifische Färbung des Reizleitungssystems und des funktionierenden Myokards mit fluoreszierenden Antikörpern, die auf HCN4 bzw. Connexin 43 abzielen, ermöglicht die Identifizierung des Sinusknotens und des atrioventrikulären Knotens innerhalb der intakten Anatomie. Dieses Whole-Mount-Färbeprotokoll ermöglicht es, die Interaktion verschiedener Zelltypen unter Verwendung verschiedener Antikörper zu untersuchen.