Name: Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von T-Lymphozyten aus verkalktem Aortenklappengewebe mit bestrahltem Buffy-Fell als Feederzellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse immunologischer Mechanismen bei der kalzifizierenden Aortenklappenstenose.

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Alle für dieses Protokoll verwendeten Mantelbeutel wurden dank der Verfügbarkeit von Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer und dem gesamten Team der Radiologie der Charité Benjamin Franklin bestrahlt. Stipendiatin/Mary Roxana Christopher, diese Arbeit wird durch ein Stipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie (DGK) unterstützt.

Die Studie wurde gemäß der Satzung der Charité zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis durchgeführt und die gesetzlichen Richtlinien und Bestimmungen zu Datenschutz und Ethik wurden eingehalten. Die Ethikkommission genehmigte alle Menschenversuche und die Privatsphäre und Anonymität der Patienten wurden in Übereinstimmung mit den auf dem Ethikformular angegebenen Regeln gewahrt.
HINWEIS: Für das unten beschriebene Protokoll wurden frische humanstenotische Klappenproben verwendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes
<ol><li>Bereiten Sie das angereicherte RPMI-Komplettmedium vor, indem Sie RPMI 1640 Medium hinzufügen: Nicht-essentielle Aminosäuren; Natriumpyruvat, L-Glutamin, ß-Mercaptoethanol und Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep). Filtern Sie es vor der Verwendung. Bei +4 °C lagern und innerhalb von zwei Monaten verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium (CCM) für die Klonierungsphase unter Verwendung des angereicherten RPMI 1640-Gesamtmediums vor, das mit wärmeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), HB-Basalmedium, 50 E Interleukin 2 (IL-2) und humanem Serum (HS) versetzt wird. Filtern und verwenden Sie es innerhalb des Tages. Nicht lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium für die Nachsaatphase unter Verwendung des angereicherten RPMI 1640-Komplettmediums mit zugesetztem FBS, HB-Basalmedium, 30 E IL-2 und HS vor. Filtern und verwenden Sie es innerhalb des Tages. Nicht lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie den Waschpuffer mit 250 ml RPMI und 5 ml Pen/ Streptokokken vor. Bei +4 °C lagern, innerhalb von zwei Monaten verwenden.</li>
</ol>2. Isolierung menschlicher T-Lymphozyten und Kultur in T-25-Kolben
<ol><li>Legen Sie die stenotische Ventilprobe in eine sterile Petrischale, die mit Wash Buffer gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass die gesamte Ventilprobe damit bedeckt ist. 15 Minuten stehen lassen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Stenotikklappe mit einem Skalpell in kleine Stücke und lassen Sie sie wieder für 10 Minuten stehen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 50 E IL-2 vor, wie zuvor beschrieben, und filtern Sie es.</li>
	<li>Fügen Sie das CCM in die T25-Kolben ein, und legen Sie die Ventilstücke mit einer sterilen Kunststoffzange in die Kolben.</li>
	<li>Lagern Sie die Kolben eine Woche lang in vertikaler Position in einem CO2-Inkubator und achten Sie darauf, den Status des Kolbens unter dem Mikroskop zu beobachten. T-Zell-Klone sollten etwa drei Tage nach dem Kulturschritt sichtbar sein; Zur besseren Beobachtung ist es ratsam, die Kolben vor der mikroskopischen Analyse 20 Minuten lang in horizontale Position zu stellen. ANMERKUNG: Die Menge des Zellkulturmediums hängt von der Menge der vorhandenen Probe und davon ab, wie viele T25-Kolben verwendet werden. In Anbetracht der Tatsache, dass jedes Ventilstück 10 ml CCM in einem Kolben benötigt, sind 25 ml CCM in einem T25-Kolben für 3 Ventilstücke geeignet.</li>
</ol>3. Klonphase
HINWEIS: Für die Klonphase von T-Zellen ist es notwendig, mit der Isolierung von Feederzellen aus einem bestrahlten Buffy Coat (BC) nach dem PBMCs-Protokoll zu beginnen.
<ol><li>Öffnen Sie den BC-Beutel unter der Laminar-Flow-Haube mit dem Beutelspike mit nadelfreiem Ventil und geben Sie 50 ml Blut in einen T150-Kolben. Fügen Sie 70 ml PBS hinzu, um das Blut im Kolben zu verdünnen.</li>
	<li>Nehmen Sie vier konische 50-ml-Röhrchen und geben Sie jeweils 20 ml Dichtegradientenmedium hinein und schichten Sie vorsichtig 30 ml Blut darüber.</li>
	<li>Zentrifuge für 25 min bei 800 x g und 20 °C bei ausgeschalteter Bremse.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn als Abfall. Sammeln Sie den PBMCs-Ring in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen und fügen Sie die PBS-Lösung bis zu einem Volumen von 50 ml hinzu.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 20 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet, indem Sie die PBS-Lösung bis zu einem Volumen von 50 ml hinzufügen. Wiederholen Sie die Zentrifugationsphase für 10 min bei 400 x g und 20 °C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die FCs in 10 ml Zellkulturmedium.</li>
	<li>Nehmen Sie ein neues Auffangröhrchen und verdünnen Sie die FCs mit PBS 1:10, indem Sie 9,9 ml PBS und 100 μL aus dem Röhrchen mit FCs und Zellkulturmedium hinzufügen. Mit einer Pipette gut ausspülen und 7 μL aus dieser Verdünnung entnehmen und die Zellen unter dem Mikroskop zählen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium für die Klonierungsphase vor: 70 ml mit 50 E IL-2 und teilen Sie es dann in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf, wobei jedes Röhrchen 25 ml Zellkulturmedium enthält, wie unten beschrieben:<ul style="list-style-type: disc;">
<li>Röhrchen 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% Phytohämagglutinin (PHA)</li>
		<li>Röhre 2: 25 ml CCM + T-Lymphozyten ANMERKUNG: Das Ziel der PC-Methode ist es, 2 x 106 Zellen für jeden ml zu erhalten, so dass die 25 ml ccm hergestellten CCM (Rohr 1) entsprechend berechnet werden müssen. Die allgemeine Formel lautet: Anzahl der gezählten Zellen x 106: 1 ml = CCM x 106: X</li>
	</ul>
</li>
</ol>4. T-Lymphozyten-Kultur in Multiwell-Platten
<ol><li>Sammeln Sie mit der elektronischen Pipette das gesamte Zellkulturmedium in den Kolben und übertragen Sie es in ein 50 ml erisches Rohr. Die leeren Flaschen können weggeworfen werden.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 400 x g und 20 °C.</li>
	<li>Den Überstand entsorgen, das Pellet in 50 ml PBS suspendieren und die Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 400 x g und 20 °C sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml CCM. Nehmen Sie 7 μL aus dieser Verdünnung und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. HINWEIS: Die Anzahl der gezählten Zellen muss für das Volumen der Kammer und für die aufgetragene Verdünnung multipliziert werden.</li>
	<li>Verdünnen Sie die gezählten Zellen von 105 bis 103 im Zellkulturmedium und nehmen Sie dann 500 μL von 103 und legen Sie sie in das Röhrchen 2.</li>
	<li>Gießen Sie das 25 ml Zellkulturmedium von Tube 1 in eine 100 mm x 15 mm große Kunststoff-Petrischale.</li>
	<li>Nehmen Sie vier 96-HE-Boden-Multiwellplatten und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, die in jedem Bohrloch auf 100 μL Seed FCs eingestellt ist.</li>
	<li>Nehmen Sie die Tube 2 und gießen Sie das Zellkulturmedium in eine Petrischale. Mit einer Mehrkanalpipette, die auf 100 μL eingestellt ist, samen T-Zellen in jedem Bohrloch.</li>
	<li>Lagern Sie die Multiwell-Platten eine Woche lang in einem CO2-Inkubator.</li>
</ol>5. Erste Nachbearbeitungsphase
<ol><li>Befolgen Sie mit einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel die PBMCs-Methode, um FCs zu erhalten, wie in der vorherigen Methode beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die passende Menge CCM ohne PHA vor und filtern Sie sie.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μL aus jeder Vertiefung und stellen Sie sicher, dass der Boden des Bohrlochs nicht berührt wird.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL FCs in alle Vertiefungen als Fütterungsschicht hinzu, um Zellkulturnährstoffe bereitzustellen und das Medium zu wechseln. HINWEIS: Für jedes Multiwell wird empfohlen, 6 ml CCM in Betracht zu ziehen, so dass die empfohlene Menge für 4 Multiwells etwa 30 ml beträgt. PHA (0,4% der gesamten CCM-Menge) muss alle zwei Wochen zum CCM hinzugefügt werden.</li>
</ol>6. Zweite Nachschubphase
<ol><li>Wiederholen Sie die Nachsaatphase nach der oben beschriebenen Passage. 0,4% PHA müssen dem Zellkulturmedium zugesetzt werden.</li>
</ol>7. Erste Spaltungsphase von 1 Bohrloch/Probe zu 2 Vertiefungen/Probe
<ol><li>Überprüfen Sie alle vier Multiwells unter dem Mikroskop und teilen Sie diese Wells mit T-Zell-Klonen (TCCs) auf.</li>
	<li>Befolgen Sie das PBMCs-Protokoll, um Feederzellen aus einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel zu isolieren.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 30 U IL-2 vor. Fügen Sie die FCs hinzu und nehmen Sie eine neue 96-Well-Multiwell-Platte mit U-Boden.</li>
	<li>Spülen Sie mit einer Pipette, die auf 100 μL eingestellt ist, gut in die Vertiefungen der ausgewählten Proben und teilen Sie das in jedem Bohrloch enthaltene Volumen von 200 μl in 2 neue Vertiefungen der neuen Multiwell-Platte auf, um 100 μL Volumen für jedes der neuen 2 Bohrlöcher zu haben.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL FCs in alle neuen Vertiefungen hinzu. Jede Vertiefung muss ein Gesamtvolumen von 200 μL enthalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und geben Sie 100 μL in zwei zusätzliche Vertiefungen, die nur FCs enthalten, die als Kontrolle dienen. HINWEIS: Verwenden Sie Lichtmikroskopie, um alle Multiwell-Platten zu beobachten, um festzustellen, welche Wellen erfolgreich TCC gewachsen sind. Um die Auswahl der Klone zu erleichtern, kann ein Vergleich mit dem Steuerelement (die beiden Vertiefungen enthalten nur FCs) durchgeführt werden, wobei der Klon im Vergleich zum Steuerelement dunkler und größer erscheint. Die zu wählenden Vertiefungen sind diejenigen mit einem großen, klaren, runden Klon mit dicht gepackten Lymphozyten. Wenn nach zwei Wochen Nachfütterung keine TCCs vorhanden sind, wird empfohlen, eine weitere Woche zu warten und eine zusätzliche Nacheeding-Phase durchzuführen.</li>
</ol>8. Zweite Spaltungsphase von 2 Bohrlöchern/Probe zu 4 Vertiefungen/Probe
<ol><li>Stellen Sie die Pipette auf 100 μL, spülen Sie gut in die beiden Vertiefungen jeder Probe und säen Sie zwei neue Vertiefungen von 100 μL für jede Probe.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 30 U IL-2 vor und befolgen Sie die PBMCs-Technik, um die FCs aus dem Buffy-Coat-Beutel zu extrahieren und die FCs in das CCM zu legen.</li>
	<li>Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und säen Sie die FCs in alle Vertiefungen. Lagern Sie die Multiwells für eine Woche in einem CO2-Inkubator.</li>
</ol>9. Dritte Spaltungsphase von 4 Bohrungen/Probe zu 8 Vertiefungen/Probe:
<ol><li>Mit einer Mehrkanalpipette, die auf 100 μL eingestellt ist, spülen Sie gut in alle vier Vertiefungen jeder Probe und säen Sie 100 μL in jede der vier neuen Vertiefungen in einer neuen 96-Well-Platte.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor und folgen Sie der PBMCs-Technik, um die FCs aus einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel zu extrahieren.</li>
	<li>Platzieren Sie die FCs im CCM. Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und säen Sie die FCs in alle Vertiefungen. Lagern Sie die Multiwells für eine Woche in einem CO2-Inkubator</li>
</ol>10. Zytofluorimetrische Analyse
<ol><li>Nehmen Sie die Multiwellplatte mit der ältesten Datierung aus dem CO2-Inkubator und identifizieren Sie die Sammelröhrchen mit den zu analysierenden Probennummern.</li>
	<li>Mit einer mehrkanaligen Pipette, die auf 200 μL mit 2 Spitzen eingestellt ist, spülen Sie gründlich in zwei Vertiefungen derselben Probe und legen Sie beide in dasselbe Sammelrohr. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Beispiele. HINWEIS: Die FCs-Proben werden nicht analysiert, da sie nur als Kontrollen dienen.</li>
</ol>11. Antikörper-Färbepanel-Vorbereitung für die zytofluorimetrische Analyse
<ol><li>1 ml PBS-Lösung für jedes Röhrchen und jede Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 20 °C zugeben.</li>
	<li>Nach der Zentrifugationsphase den Überstand verwerfen. HINWEIS: Das Antikörper-Färbepanel befindet sich in Tabelle 1. Jede einzelne berechnete Antikörperkonzentration beträgt etwa 2 μL/Probe. Es wird empfohlen, die Antikörperröhrchen vor Gebrauch kurz zu drehen. Um die fluorophorkonjugierten Antikörper vor Licht zu schützen, sollten alle Schritte im Dunkeln durchgeführt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antikörpermischung in einem 1,5 ml Röhrchen vor und wirbeln Sie sie.</li>
	<li>Fügen Sie die Antikörper in den Proben hinzu und lassen Sie die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>In jede Probe 1 ml PBS geben und 10 min bei 400 x g und 20 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit 500 μL PBS-Lösung.</li>
	<li>Fahren Sie mit der zytofluorimetrischen Analyse fort (FACS-Analyse, Tabelle 1). HINWEIS: Die gefärbten Proben können mit 0,5% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS-Lösung, fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. ACHTUNG: PFA ist giftig und muss vorsichtig gehandhabt werden.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Markierung</td>
			<td>Fluorophor</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Leuchtend violett 510</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>Leuchtend violett 421</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>Brillantes Violett 711</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Antikörper-Färbepanel zum Nachweis der T-Lymphozyten-Population bei Verkalkungs-Aortenklappenerkrankungen.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Hier stellen wir eine Methode zur Charakterisierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen vor, die aus stenotischen Aortenklappenproben isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode erfordert die Verwendung von bestrahltem Buffy Coat, um die PBMCs zu isolieren. Die Strahlungsfrequenz, der die Buffy-Coat-Beutel ausgesetzt werden müssen, beträgt 9000 Rad/90 Gray (Gy) und stellt einen entscheidenden Schritt dar, um die Proliferation der Feederzellen zu stoppen. Die Rolle der aus den Buffy-Coat-Beuteln isolierten ...

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine der häufigsten Herzklappenerkrankungen mit starken Auswirkungen auf das Gesundheitswesen. Die Häufigkeit des Aortenklappenersatzes hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und wird aufgrund der wachsenden älteren Bevölkerung voraussichtlich weiter zunehmen1.
Die zugrunde liegende Pathophysiologie der CAVD ist nur teilweise bekannt und die aktuellen therapeutischen Strategien beschränken sich auf konservative Maßnahmen oder Aortenklappenersatz, entweder durch chirurgische oder perkutane Verfahren. Bis heute kann keine wirksame medizinische Behandlung das Fortschreiten der CAVD behindern oder umkehren, und eine hohe Mortalität ist mit einem frühen Symptombeginn verbunden, es sei denn, es wird ein Aortenklappenersatz (AVR) durchgeführt2. Bei Patienten mit schwerer symptomatischer Aortenstenose wurde das symptomfreie 3-Jahres-Überleben von nur 20%3 berichtet. Der Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) stellt eine neue Option dar, die die Behandlung von Hochrisikopatienten, insbesondere bei älteren Menschen, revolutioniert und die Mortalität, die in dieser Population an sich hoch war, dramatisch gesenkt hat4,5,6. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse von TAVR ist weitere Forschung notwendig, um die CAVD-Pathophysiologie zu verstehen, um neue frühe therapeutische Ziele zu identifizieren7,8,9.
CAVD, das früher als passiver, degenerativer Prozess angesehen wurde, wird heute als aktive progressive Erkrankung anerkannt, die durch einen osteoblastischen Phänotypschalter der Aortenklappen-Interstitialzellen gekennzeichnet ist10. Diese Krankheit beinhaltet eine fortschreitende Mineralisierung, fibrokalzische Veränderungen und eine verminderte Motilität der Aortenklappenblättchen (Sklerose), die letztendlich den Blutfluss behindern, was zu einer Verengung (Stenose) der Aortenklappenöffnung führt11.
Entzündung gilt als ein Schlüsselprozess in der CAVD-Pathophysiologie, ähnlich dem Prozess der vaskulären Atherosklerose. Endothelschäden ermöglichen die Ablagerung und Akkumulation von Lipidspezies, insbesondere von oxidierten Lipoproteinen in der Aortenklappe12. Diese oxidierten Lipoproteine provozieren eine Entzündungsreaktion, da sie zytotoxisch sind, wobei die entzündliche Aktivität zu einer Mineralisierung führt. Die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunität bei der CAVD-Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit wurde kürzlich hervorgehoben13. Die Aktivierung und klonale Expansion spezifischer Untergruppen von Gedächtnis-T-Zellen wurde bei Patienten mit CAVD und mineralisierten Aortenklappenblättchen dokumentiert, so dass angenommen wird, dass entzündliche Prozesse zumindest an der Entstehung von CAVD und vermutlich auch am Krankheitsverlauf beteiligt sind14. Obwohl Antigen-präsentierende Zellen und Makrophagen sowohl in der gesunden als auch in der erkrankten Klappe vorhanden sind, deutet das Vorhandensein von T-Lymphozyten auf eine gealterte und erkrankte Aortenklappe hin. Dieses lymphozytäre Infiltrat zusammen mit einer Zunahme der Neovaskularisation und Metaplasie sind charakteristische histologische Anzeichen von CAVD15.
Wir stellen die Hypothese auf, dass es eine Wechselwirkung zwischen den Aortenklappen-Interstitialzellen und der Aktivierung des Immunsystems gibt, die möglicherweise die Initiierung eines chronischen Entzündungsprozesses in der Aortenklappe auslöst. Das Assaying von T-Zellen aus stenotischem Aortenklappengewebe könnte ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Verkalkungsentwicklung zu klären, da es eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo liefern kann. In der vorliegenden Arbeit isolieren wir unter Verwendung von Aortenklappengewebe T-Lymphozyten, kultivieren und klonen sie und charakterisieren sie anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Frische Aortenklappenproben wurden von CAVD-Patienten entnommen, die einen chirurgischen Klappenersatz für schwere Aortenstenose erhielten. Nach der chirurgischen Exzision wurde die frische Klappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Zellen wurden kultiviert, kloniert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Daten können verwendet werden, um Veränderungen in der T-Lymphozytenverteilung im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Untergruppen von Interesse zu bewerten.
Die Extraktion von verkalktem Gewebe, die Isolierung von Leukozyten aus verkalktem Gewebe und insbesondere die Verwendung von Durchflusszytometrie an dieser Art von Gewebe kann aufgrund von Problemen wie Autofluoreszenz eine Herausforderung darstellen. Es gibt nur wenige Publikationen mit Protokollen für diesen speziellen Zweck16,17,18. Hierin stellen wir ein Protokoll vor, das speziell für die direkte Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten aus menschlichen Aortenklappenproben entwickelt wurde. Klonale Expansion von Lymphozyten ist ein Kennzeichen der adaptiven Immunität. Die Untersuchung dieses Prozesses in vitro liefert aufschlussreiche Informationen über die Heterogenität der Lymphozyten19. Nach einer dreiwöchigen Inkubationszeit sind die T-Zell-Klone bereit für die Explantation, da aus jedem Klon eine ausreichende Menge an T-Zellen gewonnen wurde, um die phänotypische und funktionelle Untersuchung zu ermöglichen. Anschließend wird der Phänotyp von T-Klonen mittels Zytofluorometrie untersucht.
Dieses immunologische Protokoll ist eine Adaption einer Methode, die zuvor von Amedei et al. zur Isolierung und Charakterisierung von T-Zellen aus menschlichem Gewebe entwickelt wurde und speziell für verkalktes menschliches Gewebe entwickelt wurde, wie in CAVD20,21,22. Das Protokoll hier für die Isolierung von PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) unter Verwendung von bestrahltem Buffy Coat beschreibt einen effektiven Weg, um Feederzellen (FC) zu erhalten, die speziell auf die Klonphase von T-Lymphozyten eingestellt sind, die aus ventilinterstitiellen Zellen isoliert wurden. Die Feederschicht besteht aus im Wachstum gestoppten Zellen, die noch lebensfähig und bioaktiv sind. Die Rolle von Feederzellen ist wichtig, um das In-vitro-Überleben und das Wachstum von T-Lymphozyten zu unterstützen, die aus Ventil-Interstitialzellen isoliert wurden23. Um die Proliferation von Feederzellen in Kultur zu vermeiden, müssen diese Zellen einen Wachstumsstillstand durchlaufen. Dies kann auf zwei Arten erreicht werden: durch physikalische Methoden wie Bestrahlung oder durch die Behandlung mit zytotoxischen Chemikalien wie Mitomycin C (MMC), einem antitumoralen Antibiotikum, das direkt auf die Kulturoberfläche aufgetragen werden kann24. Hier zeigen wir den Stopp des Feederzellwachstums, der durch Zellbestrahlung erreicht wird.
Diese Methode stellt eine effiziente, kostengünstige Möglichkeit dar, T-Zellen aus Aortenklappengewebe zu isolieren und zu charakterisieren, was dazu beiträgt, das Spektrum immunologischer Methoden zur Erforschung der CAVD-Pathophysiologie zu erweitern.

<table><tbody><tr><td>50 mL Kunststoffspritzen</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Multiwell-Platten mit U-Boden</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>Bag Spike (nadelfrei)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Auf 4% verdünnen mit PBS</td></tr><tr><td>CD14 Brilliant violet 421</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE/Cy7</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Brillantviolett 711</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Brillantviolett 510</td>&<td>nbsp; Biolegend</td><td>301047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 Zählkammer aus Kunststoff</td><td>KOVA INTERNATIONAL</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>Filter für Kulturmedium 250 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Filter für Kulturmedium 500 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 Lyophilisiertes Supplement</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB Basalmedium</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS (fötales Rinderserum)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>HS (Humanserum)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PHA (Phytohämagglutinin)</td><td>Stammzelle Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen aus Kunststoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>R80115TS</td><td>10 0mm x 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter 0,45 Mikro; l</td><td>Rotilabo-Spritzenfilter</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Zellkulturflaschen</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Zellkulturflasche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der aortenklappenverkalkung durch isolierung und kultur von t-lymphozyten unter verwendung von feederzellen aus bestrahltem buffy-fell

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD), ein aktiver Krankheitsprozess, der von einer leichten Verdickung der Klappe bis hin zu schwerer Verkalkung reicht, ist trotz neuer Therapieoptionen wie dem Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) mit einer hohen Mortalität verbunden. 
Die kompletten Wege, die mit der Klappenverkalkung beginnen und zu einer schweren Aortenstenose führen, bleiben nur teilweise verstanden. Durch eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo könnte die Untersuchung von T-Lymphozyten aus stenotischem Klappengewebe ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Entwicklung der Verkalkung zu klären. Nach der chirurgischen Exzision wird die frische Aortenklappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Lymphozyten werden kultiviert, kloniert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.
Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können auch mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Ergebnisse können verwendet werden, um Änderungen der T-Zell-Konzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Subtypen von Interesse zu bewerten. In dieser Studie zeigen wir die Isolierung von T-Zellen, die an frisch verkalkten Aortenklappenproben durchgeführt wurden, und die Schritte der Analyse von T-Zell-Klonen mittels Durchflusszytometrie, um die Rolle der adaptiven Immunität in der CAVD-Pathophysiologie besser zu verstehen.

Wir verwendeten eine einfache und kostengünstige Methode, um die Leukozytenpopulation von frischen Aortenklappenproben von menschlichen Patienten mit schwerer Aortenklappenstenose zu charakterisieren (siehe Protokoll). Die Methode zur Isolierung von PBMCs ist ein wichtiger Schritt bei der Gewinnung von Feederzellen, die in jedem Schritt des Experiments (Klonierungs-, Nachfütterungs- und Spaltungsphasen) verwendet werden und den Nachweis und die Charakterisierung infiltrierender Leukozyten in Aortenklappenproben ermöglich...

In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen. Die Klonphase ermöglicht es, eine größere Anzahl von T-Klonen aus frischen Proben zu gewinnen. Darüber hinaus können der Phänotyp und die Funktion von T-Zellen leicht analysiert werden.Das Verfahren wird Mary Christopher, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Um das Klonen von T-Zellen zu induzieren, verwenden Sie den Beutelspike mit dem nadelfreien Ventil, um einen bestrahlten Buffy-Coat-Beutel in einer Laminar-Flow-Haube zu öffnen. Bis zu 50 Milliliter Blut aus dem Beutel in einen T-150-Kolben geben und 70 Milliliter PBS in den Kolben geben.Schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter des verdünnten Blutes auf 20 Milliliter Dichtegradient in jedem der vier 50 Milliliter konischen Röhrchen und trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und übertragen Sie das PBMC von jedem Rohr in ein einziges neues 50-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie PBS, um das Endvolumen auf 50 Milliliter zu bringen und das PBMC durch Zentrifugation zu sammeln.Nach einer zweiten Wäsche unter den gleichen Bedingungen werden die isolierten Feederzellen zur Zählung in 10 Milliliter Zellkulturmedium suspendiert und 25 Milliliter eines 70 Milliliter Zellkulturmediums, ergänzt mit 50 Einheiten IL-2-Lösung, in jeweils zwei 50-Milliliter-Röhrchen gegeben. Dann fügen Sie Feederzellen zu einem Röhrchen mit einer 2 x 10 bis 6. Zelle pro Milliliter Zellkulturmedium hinzu, ergänzt mit IL-2-Konzentration. Um eine T-Lymphozytenkultur einzurichten, poolen Sie den T-Zell-Klon, der Überstände aus dem stenotischen Klappenprobenkolben enthält, in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Waschen Sie das Pellet dreimal in 50 Milliliter PBS pro Wäsche, bevor Sie die Zellen in 1 Milliliter Zellkulturmedium zur Zählung wiederverwenden. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 bis 3. Zellen pro Milliliter und geben Sie 500 Mikroliter Zellen in das Röhrchen aus Zellkulturmedium, das mit IL-2 ohne Feederzellen ergänzt wird. Geben Sie die Feederzellensuspension in eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale aus Kunststoff und geben Sie 100 Mikroliter Feederzellen zu jeder Vertiefung der entsprechenden Anzahl von U-Bottom-96-Well-Platten für das Experiment hinzu.Dann geben Sie die T-Zellen in eine Petrischale und fügen Sie 100 Mikroliter T-Zellen zu jeder Feederzelle hinzu, die für eine einwöchige Inkubation im Zellkultur-Inkubator gut ergänzt wird. Die PBMC-Isolierung ist entscheidend für die Gewinnung von Feederzellen und ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung von infiltrierenden Leukozyten in Aortenklappenproben. Nach zwei Wochen Inkubation kann eine Klon-T-Zell-Population erhalten werden.Hier wird das Gating-Schema zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit kalzifischer Aortenklappenerkrankung gezeigt. Wie bei diesem Patienten beobachtet, gab es mehr CD4+T-Zellen als CD8+T-Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse von nicht geklonten T-Zellen bestätigt, dass die gleichen T-Zell-Marker sowohl in nativen Klappen- als auch in Klonproben vorhanden sind.Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass T-Zellen in verkalkten Aortenklappen mit CD45 + Leukozyten vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass eine kalzitive Aortenklappenerkrankung mit der Aktivierung des Immunsystems und der Entzündungsaktivität verbunden ist. Diese Methode ist sehr vielseitig. Es kann auf verschiedene Protokolle angewendet werden, für die Forscher in der Lage sein müssen, Zellen aus einem Gewebe für die funktionelle Charakterisierung zu isolieren.Denken Sie daran, dass es wichtig ist, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden und die Zellen unter dem Mikroskop kritisch zu beobachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Dieser Beitrag stellt eine Durchflusszytometrie-basierte Methode, um das Immunsystem Zusammensetzung der Aorta zu untersuchen. Das Papier zeigt auch eine weitere Technik, die Prüfung umgebenden Adventitia und Gefäßwand getrennt werden können. Diese Methode eröffnet Möglichkeiten, um phänotypische Analysen der Aorta Leukozyten führen und in mehreren immunologischen Assays für die Atherosklerose-Studien.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von interstitiellen Zellen der Aortenklappe aus dem Herzen einer erwachsenen Maus mit einem zweistufigen Kollagenase-Verfahren und deren anschließende Kultivierung in einem geringen Volumen an Wachstumsmedien.

Isolierung von interstitiellen Zellen der Mausklappe: Eine enzymatische Methode zur Isolierung und Kultivierung von VICs aus der Aortenklappe der Maus

Dieses Video zeigt eine Färbetechnik zur Beurteilung der arteriellen medialen Verkalkung der vaskulären glatten Muskelzellen in vitro. Die von-Kossa-Methode nutzt eine photochemische Reaktion, um metallisches Silber an den Verkalkungsstellen abzuscheiden und eine schwarze Färbung zu verleihen.

Von-Kossa-Färbung von glatten Zellen der Aortengefäßmuskulatur: Eine in vitro-Technik zur Beurteilung der Verkalkung der arteriellen Medialschicht

Dieses Video zeigt eine Assay-Technik zur Beurteilung der Verkalkung der interstitiellen Zellen der Aortenklappe in vitro. Der Assay hilft bei der Quantifizierung der Calciumkonzentration mit dem Arsenazo III-Reagenz, einem calciumsensitiven Farbstoff, der mit Calciumionen reagiert und einen violett gefärbten Calcium-Arsenazo-Komplex bildet.

Kalzifizierungsassay zur Messung der Kalziumkonzentration in interstitiellen Zellen der Aortenklappe

Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen und trägt dazu bei. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Induktion der Verkalkung von kultivierten primären vaskulären glatten Muskelzellen und zur Quantifizierung der Verkalkung und Makrophagenbelastung in tierischen Aorten mittels Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung.

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Dieser Artikel enthält detaillierte Methodik zur Identifizierung und funktionelle T-Lymphozyten-Untergruppen, die innerhalb Maus Niere, Aorta und der Lymphknoten durch die intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu quantifizieren. Das Modell der Angiotensin-II-induzierte Hypertonie wurde zu erklären, ausgewählt, Schritt-für-Schritt, die Verfahren und die grundlegenden Prinzipien der Durchflusszytometrie und intrazelluläre Färbung.

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, die Kultur und die Verkalkung der Ratte abgeleitet Ventil interstitiellen Zellen, ein höchst physiologischen in Vitro Modell der Schulterarthrose Aortenklappe Krankheit (CAVD). Ausbeutung von diesem Rattenmodell erleichtert die CAVD Forschung in der Erforschung der Zelle und der molekularen Mechanismen, die diese komplexen Krankheitsgeschehen zugrunde liegen.

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

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Analyse der extrazellulären Vesikel-vermittelten Gefäßverkalkung mittels In-vitro- und In-vivo-Modellen

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Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell (Video) | JoVE Journal

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

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