Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung
December 23rd, 2020
Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.
Dieses Protokoll ermöglichte es, SARS-CoV-2-RNA in Zelllinien und in vollständig differenzierten, dreidimensionalen menschlichen Atemwegsepithelkulturen sichtbar zu machen, und bot damit ein Werkzeug zum besseren Verständnis der viralen Pathogenese und Replikation auf Einzelzellebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Sensitivität und Auflösung ist diese Methode nicht nur für grundlagenwissenschaftliche Studien zum SARS-Coronavirus-2 nützlich, sondern auch für Anwendungsprojekte, wie z. B. die Diagnostik. Das Verfahren wird von Agnieszka Suder, einer Doktorandin aus meinem Labor, vorgeführt.
Nach dem Fixieren und Permeabilisieren der Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben, entfernen Sie die 1X PBS-Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie mindestens 300 Mikroliter Amplifikationspuffer zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Röhrchen abkühlen.
Zur Herstellung von 300 Mikrolitern Amplifikationslösung verwenden Sie 18 Picomolen von jeder Haarnadel. Übertragen Sie die Haarnadellösung in Röhrchen und inkubieren Sie sie 90 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius. Anschließend 30 Minuten im Dunkeln auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie die snap-gekühlten H1- und H2-Haarnadeln zum Amplifikationspuffer hinzufügen. Geben Sie Tropfen von 30 bis 50 Mikrolitern Haarnadelmischung auf Parafilm. Legen Sie die Deckgläser mit den Zellen auf die Tropfen der Haarnadelmischung und inkubieren Sie die Proben über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Um die Objektträger zu montieren, geben Sie zwei 10-Mikroliter-Tropfen Eindeckmittel auf einen Objektträger und achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend voneinander getrennt sind, damit zwei Deckgläser auf einem einzigen Objektträger platziert werden können. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Deckgläser auf ein sauberes Handtuch klopfen. Legen Sie sie dann mit den Zellen nach unten in ein Eindeckmedium mit Lichtschutzmittel.
Legen Sie die eingespannten Proben im Dunkeln auf eine trockene, ebene Oberfläche und lassen Sie sie aushärten. Nach der Fixierung und Permeabilisierung der HAE-Zellen, wie im Textmanuskript beschrieben, werden die Proben voramplifiziert, indem sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Amplifikationspuffer inkubiert werden. Verwenden Sie 30 Picomole jeder Haarnadel, um 500 Mikroliter Amplifikationslösung herzustellen.
Übertragen Sie die Haarnadellösung in die Röhrchen und inkubieren Sie sie 90 Sekunden lang bei 95 Grad Celsius. Dann kühlen Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln auf Raumtemperatur ab. Bereiten Sie die Haarnadellösung vor, indem Sie alle abgekühlten Haarnadeln zu 500 Mikrolitern Amplifikationspuffer bei Raumtemperatur hinzufügen.
Entfernen Sie die Voramplifikationslösung und fügen Sie die vollständige Haarnadellösung hinzu. Anschließend werden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Legen Sie die ausgeschnittene Membran aus den Transwell-Einsätzen mit den Zellen nach oben auf 10 Mikroliter Antifading-Eindeckmedium und fügen Sie der Membran zusätzliches Eindeckmedium hinzu.
Decken Sie dann die Membranen mit Deckgläsern ab. Dieses Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde in zwei zellulären Systemen durchgeführt, einer Vero-Zelllinie und einer humanen 3D-Epithelkultur. Hier ist die Lokalisierung von subgenomischer RNA des SARS-Coronavirus-2 in infizierten und scheingeimpften Vero-Zellen dargestellt.
Virale RNA ist in Rot zu sehen. Die subgenomische RNA-Lokalisierung von SARS-Coronavirus-2 in infizierten und scheingeimpften menschlichen Atemwegsepithelzellen ist hier dargestellt. Das Permeabilisierungsprotokoll wurde in Vero-Zellen optimiert.
Die Permeabilisierung mit Detergens führt zu einem klaren, spezifischen Signal für die subgenomische RNA des SARS-Coronavirus-2, während die Verwendung von Ethanol zu einem verschwommenen und unscharfen Bild führt. Bei der Montage der Objektträger mit Vero-Zellen ist es wichtig, ein Deckglas mit den Zellen nach unten zu platzieren. Bei der Montage der HAE-Objektträger muss die Membran mit den Zellen nach oben platziert werden.
Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um den Nachweis jeder RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in Zukunft auftreten könnten. In Verbindung mit Immunfluoreszenz kann es verwendet werden, um die Protein-RNA-Wechselwirkungen auf Einzelzellebene zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz integriert, um SARS-CoV-2 RNA zu visualisieren. Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der SARS-CoV-2 RNA-Wirts-Interaktionen auf Einzelzellebene.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Virologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der viralen Pathogenese ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Diagnostik und Behandlungen.
- SARS-CoV-2 hat erhebliche Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit.
- Die Visualisierung von RNA auf Einzelzellebene kann Einblicke in die virale Replikation liefern.
- Die Kombination von RNA-FISH mit Immunfluoreszenz bietet hohe Spezifität und Empfindlichkeit.
Zweck der Studie
- Zur Visualisierung von SARS-CoV-2 RNA in verschiedenen Zellmodellen.
- Zum verbesserten Verständnis der viralen Interaktionen innerhalb von Wirtszellen.
- Zum Bereitstellen eines Werkzeugs für die Grundlagen- und angewandte Forschung in der Virologie.
Verwendete Methoden
- Fixierung und Permeabilisierung von Zellen.
- Anwendung eines Amplifikationspuffers für die RNA-Visualisierung.
- Verwendung von HCR-Haarnadeln für die spezifische RNA-Erkennung.
- Immunfluoreszenztechniken zur Ergänzung von RNA-FISH.
Hauptergebnisse
- SARS-CoV-2 RNA wurde erfolgreich in Zelllinien und humanen Atemwegsepithelkulturen visualisiert.
- Die Methode zeigte hohe Spezifität und Empfindlichkeit.
- Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der viralen Pathogenese bei.
- Dieses Protokoll ist sowohl für Forschungs- als auch für diagnostische Zwecke anwendbar.
Schlussfolgerungen
- Die kombinierte Methode ist effektiv für die Untersuchung von SARS-CoV-2 auf Einzelzellebene.
- Sie liefert wertvolle Einblicke in RNA-Wirts-Interaktionen.
- Dieser Ansatz kann bei der Entwicklung diagnostischer Werkzeuge helfen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
