Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Baumwollkapselwurm ist einer der zerstörerischsten Schädlinge weltweit. Genome Editing mit der CRISPR/Cas9-Technologie ermöglicht die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in diesem Organismus. Die beiden Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie eine hohe Spezifität aufweist und verfügbar ist.

Um die sgRNA-Targets auszuwählen, gehen Sie auf die CRISPR-Online-Website, um nach möglichen Leitstellen und exons in der Nähe der fünf wichtigsten untranslatierten Regionen des Gens zu suchen. Geben Sie die Exonsequenz in das Textfeld ein und wählen Sie das Zielgenom für Helicoverpa armigera aus. Wählen Sie die PAM-Option für 20 BPNGG und belassen Sie die anderen Einstellungen gemäß den Benutzerhandbüchern der Website auf den Standardparametern.

Vergleichen Sie die vorhergesagten Führungssequenzen aus der Software und wählen Sie eine Führungssequenz von 20 Basenpaaren, die ein oder zwei Guanine in der Nähe der fünf unübersetzten Prime-Regionen mit der höchsten vorhergesagten Effizienz und den geringsten Fehlanpassungen enthalten, um die Bearbeitungseffizienz zu verbessern und die Off-Target-Bearbeitung zu reduzieren. Wählen Sie für die Embryonalvorbereitung 50 gesunde Personen aus drei Tage alten Männchen und zwei Tage alten Weibchen aus und mischen Sie sie in einem sauberen Netzkäfig. Legen Sie ein Stück feuchte Baumwolle mit 10% Zuckerlösung in den Käfig.

Bedecken Sie die Netzkäfige mit Gaze und fixieren Sie die Gaze mit einem Gummiband. Sprühen Sie Wasser auf die Gaze, um sie feucht zu halten. Schneiden Sie ein schwarzes Tuch in eine geeignete Größe und ersetzen Sie die feuchte Gaze durch dieses schwarze Tuch, um eine freie Eizellposition für 30 Minuten zu ermöglichen.

Kleben Sie doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger. Kleben Sie die Flecken mit der Pinzette mit den Eiern in einer Reihe auf die Oberfläche des doppelseitigen Klebebandes. Drücken Sie auf den Rand jedes Patches, um sicherzustellen, dass sie fest am Band haften.

Sammeln Sie 50 bis 100 Eier pro Objektträger. Halten Sie den Objektträger vor der Mikroinjektion auf Eis, um die Entwicklung der Embryonen zu verzögern. Bereiten Sie die Nadel vor, indem Sie ein Kapillarglas mit einem Mikropipettenzieher ziehen, wie im Textmanuskript beschrieben.

Schleifen Sie die Nadelspitze mit einem Mikroschleifer zu einer scharfkantigen Spitze. Bereiten Sie Injektionslösungen vor, indem Sie zwei Mikroliter des kommerzialisierten Cas9-Proteins und sgRNA zu RNace-freiem Wasser in einem PCR-Röhrchen hinzufügen, um eine 10-Mikroliter-Volumenmischung zu erhalten. Gut durch Pipettieren mischen und auf Eis legen.

Stellen Sie die Parameter des elektronischen Mikroinjektors ein. Laden Sie zwei Mikroliter der Mischung mit einer Mikrolader-Pipettenspitze in eine Nadel und leiten Sie so viel Restluft wie möglich in der Nadelspitze ab. Schließen Sie die Injektionsnadel an einen Mikromanipulator an und sorgen Sie für eine enge Verbindung zwischen den beiden Teilen.

Legen Sie einen Objektträger in eine Petrischale und legen Sie ihn auf die Bühne des Mikroskops. Führen Sie die Nadelspitze vorsichtig in die obere Hemisphäre eines Embryos in einem Winkel von 45 Grad ein. Drücken Sie das Pedal, um die Mischung in den Embryo abzugeben, was zu einer leichten Ausdehnung des Embryos führt.

Ziehen Sie die Nadel sofort vom Embryo zurück und bewegen Sie die Petrischale mit einer Hand, bis sich der nächste Embryo in der Nähe der Nadel befindet. Injizieren Sie mindestens 300 Embryonen mit dem gleichen Verfahren, um eine ausreichende Schlüpfmenge zu gewährleisten. Decken Sie den Deckel der Petrischalen nach der Injektion ab.

Wenn sich die Oberflächenfarbe der Embryonen verdunkelt hat, legen Sie künstliche Diät in die Petrischale um den Objektträger. Bereiten Sie 24-Well-Kulturplatten vor und füllen Sie jede Vertiefung auf 1/3 ihrer volumetrischen Kapazität mit künstlicher Diät. Wählen Sie schlüpfende Larven mit einem kleinen Pinsel aus und übertragen Sie sie auf die 24-Well-Kulturplatte, so dass ein Brunnen eine Larve hat.

Wenn die Larve zum dritten Stadium des Stadiums heranwächst, übertragen Sie sie auf eine neue glasduktile Ethrae. Die neu eingeschlossenen männlichen G-Zero-Erwachsenen und wildtypischen weiblichen Erwachsenen werden im gleichen Verhältnis in einen frischen Netzkäfig gebracht. Versorgen Sie sie mit 10% Zuckerlösung, die in Wattebällchen fällt.

Hintere Insekten mit Routinemethoden bis zur Verpuppung von G-one. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig ein Hinterbein zu entfernen und legen Sie jedes Bein in ein Lysing Matrix-Rohr. Homogenisieren Sie das Hinterbein mit einem Gewebehomogenisator.

Extrahieren Sie die genomische DNA der homogenisierten Probe mit einem kommerziellen gDNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Amplifizieren Sie das Gensegment mit Genotypisierungsprimern und den PCR-Reaktionsbedingungen aus dem Textmanuskript. Bestätigen Sie den Genotyp mit einem Gensequenzierungsdienst.

Setzen Sie G-One-Individuen desselben Genotyps in einen Netzkäfig, kreuzen Sie die G-One-Nachkommen selbst und fahren Sie fort, mit den gleichen Methoden zu screenen. Die Zielstelle des interessierenden Gens befand sich in seinem zweiten Exon. Diese Stelle war hoch konserviert und das Zielbandfragment der synthetisierten sgRNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt.

Der mutierte Nachweis eines einzelnen sgRNA-Targets erfolgte durch Sequenzierung der PCR-Produkte aus G-one-Elterneinheiten. Die Wirksamkeit der Verwendung von nicht überlappenden sgRNA-Paaren über verschiedene Exons hinweg wurde gezeigt, da die große Deletion der Mutanten leicht von den Wildtyppfannen unterschieden werden konnte. Nach der Gewinnung einer bestimmten Anzahl von mutierten Individuen können elektrophysiologische oder Verhaltensexperimente durchgeführt werden, um die Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen zu klären.