Name: Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Lernen Sie die Erweiterungsmikroskopie zur Visualisierung glomerulärer Proteine mit Nanometerauflösung. Diese Methode erreicht 70 nm Auflösung am konventionellen Mikroskop und ermöglicht detaillierte Studien zu Nephrin, Actin und Podocin.

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Die Autoren danken Blanka Duvnjak und Nikola Kuhr für ihre hervorragende technische Unterstützung.

1. Spaltung und Aussaat von Zellen
<ol><li>Warmup sterile Dulbecco Modified Eagle es Medium (DMEM) einschließlich 10% fetales Kalbsserum (FCS), sterile Phosphat gepufferte Saline (PBS) und steriles Trypsin auf 37 °C. Aktivieren Sie die saubere Bank.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie jedem Brunnen mit sterilen Zangen einen sterilen Glasdeckelschlupf (10 mm) hinzufügen.</li>
	<li>Legen Sie eine 10 cm Zellkulturschale mit Cos7-Zellen unter die saubere Bank. Unter der sauberen Bank, aspirieren Sie das Medium der Zellen mit einem Vakuumgerät.</li>
	<li>Halten Sie die gewinkelte Zellkulturschale in einer Hand und fügen Sie 10 ml sterile PBS an der Seite der Zellkulturschale hinzu, um das Abspülen von Zellen zu vermeiden. Legen Sie die Zellkultur auf, damit PBS das komplette Zellkulturgericht spült.</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin in die Mitte der Zellkulturschale und inkubieren für 5 min bei 37 °C.</li>
	<li>Beenden Sie die Trypsinisierungsreaktion, indem Sie 10 ml DMEM einschließlich 10% FCS und Pipette die Zelllösung nach oben und unten mit einem Pipettier hinzufügen, um die Zellen manuell zu trennen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellenzahl pro Milliliter mit einer Zählkammer.</li>
	<li>Säen 68.000 Zellen in 2 ml Medium pro Brunnen auf die Glasabdeckung rutscht in die 6-Well-Platte. Verteilen Sie die Zellen innerhalb der 6-Well-Platte, indem Sie die Platte vorsichtig horizontal und vertikal schütteln. HINWEIS: Zellen sollten verstreut liegen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 °C Inkubator mit 5%CO2.</li>
</ol>2. Transfektion von Zellen
<ol><li>Bereiten Sie zwei sterile 1,5 ml-Röhrchen vor (eine für verdünnte DNA (A) und eine für verdünnte Reagenz für kationische Lipidtransfektion (B)). Pipette 0,75 g Nephrin und 0,75 g Podocin-cDNA-Expressionsplasmid pro Bohrung in ein 1,5 ml-Rohr und verdünnen Sie es in 100 l reduziertes Serummedium pro Brunnen. Fügen Sie dem zweiten 1,5 ml-Rohr 3 l kationisches Lipidtransfektionsreagenz pro Brunnen hinzu und verdünnen Sie es mit 100 l reduziertem Serummedium. Inkubieren Sie beide Reaktionen für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Kombinieren Sie beide Reaktionen (A und B) zu einem DNA-Lipid-Komplex und inkubieren Sie 20 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie vorsichtig 200 l des DNA-Lipid-Komplexes zu jedem Brunnen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h, ohne das Medium zu verändern.</li>
</ol>3. Immunolabeling von Zellstrukturen
<ol><li>Bereiten Sie eine Befestigungslösung (4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS, 1 ml/well), die Permeabilisationslösung (0,5% (w/v) Triton X-100 in PBS, 1 ml/well) und eine Blockierendelösung (5% (v/v) Rinderserumalbumin in PBS, 1 ml/well) vor.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium mit einem Vakuumgerät. Fügen Sie 2 ml PBS zu jedem Brunnen hinzu, um zusätzliches Medium zu entfernen. Aspirieren Sie die PBS vollständig. HINWEIS: Um das Abwaschen von Zellen mit PBS zu vermeiden, achten Sie darauf, PBS nicht direkt auf die Glasabdeckung zu kinpetten.</li>
	<li>Fixzellen mit 4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 10 min bei Raumtemperatur gelöst. HINWEIS: Alternativ können Sie Zellen in 3% (v/v) Glyoxal-Ethanol18fixieren.</li>
	<li>Entsorgen Sie PFA und Waschzellen zweimal in PBS (jeweils 2 ml), indem Sie eine direkte Pipettierung auf die Glasabdeckung vermeiden. Permeabilisieren Sie die festen Zellen mit Triton X-100 0.5% (w/v) in PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die Permeabilisationslösung und waschen Sie zweimal mit PBS, wie in Schritt 3.2 angegeben.</li>
	<li>Blockieren Sie die Zellen, indem Sie 1 ml 5% (v/v) BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen mit 200 l des primären Antikörpers (Antipodocin-Antikörper 1:200 in 1% (v/v) BSA in PBS) über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Alternativ können Sie den primären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie dreimal mit PBS wie in Schritt 3.2. Fügen Sie den sekundären Antikörper (Ziegenanti-Kaninchen Alexa 488 1:1000 in 1% (v/v) BSA in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur hinzu. Halten Sie die Zellen mit einer Box im Dunkeln.</li>
	<li>Den sekundären Antikörper entsorgen und dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 200 l Anti-Nephrin-Antikörper 1:100 in 1% (v/v) BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur. Dreimal mit PBS waschen. Halten Sie die Zellen mit einer Box im Dunkeln.</li>
	<li>PBS entfernen und mit dem sekundären Antikörper Esel Anti-Meerschweinchen 633, 1:200, für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dreimal mit PBS waschen. Halten Sie die Zellen mit einer Box im Dunkeln.</li>
</ol>4. Erweiterungsmikroskopie
<ol><li>Vorbereitung
	<ol>
<li>Um die Abstandshalter für die Gelationskammer zu bilden, schlumpft die Glasabdeckung mit einem Diamantmesser #1,0 und #1,5 in 5 mm Streifen (jeweils vier pro Glasschlitten). Positionieren Sie die #1,5 mm Bezugsstreifen so, dass sie ein Quadrat von 2,5 cm Länge auf einer Glasrutsche bilden, und legen Sie sie in eine Färbekammer(Abbildung 2A1-C1). Pipette ein Tröpfchen von ddH2O in die Ecken des Quadrats, um die Glasabdeckung Slip Streifen zueinander und auf die Glasrutsche(Abbildung 2A2-C2). HINWEIS: Vermeiden Sie eine vollständige Trocknung von ddH2O, da die Haftkraft verloren geht. Bei Bedarf weitere Tröpfchen von ddH2O auftragen. Warten Sie ca. 20 min, damit #1,5 mm Deckslips stabil befestigt werden, bevor Sie mit Schritt 4.1.2 beginnen.</li>
		<li>Legen Sie vier #1,0 Glasabdeckungsstreifen pro Deckelschlupf auf die #1,5 mm Bezugsscheine. Befestigen Sie die Streifen, indem Sie ein Tröpfchen auf jedem #1,5 mm Abdeckstreifen verkleben (Abbildung 2A3-C3). HINWEIS: Die Dicke des Gels sollte mindestens 0,15 mm betragen, um die Handhabung im Verlauf des Protokolls zu erleichtern. Um jedoch übermäßiges Gel auf der Oberseite der Zellen zu vermeiden, halten Sie die Abstandshalterhöhe in der Nähe des Zellsubstrats. Durch die Verwendung von #1.5- und #1.0-Abdeckungsstreifen als Abstandshalter beträgt die Abstandshöhe ca. 0,3 mm. Die Zellen haften am Deckglas (Höhe 0,12 mm). Daher wird das Gel dick genug sein, um zu handhaben, aber übermäßiges Gel auf der Oberseite der Zellen wird vermieden, mit #1.0 und #1.5 Glasstreifen als Abstandshalter zu bedecken.</li>
		<li>Für den Gelationskammerdeckel ein Deckglas (#1.5) mit Paraffinfolie einwickeln. Vermeiden Sie Falten oder Schmutz auf der Paraffinfolie(Abbildung 2A5-C5).</li>
	</ol></li>
	<li>Verankerung und Polymerisation (Gelation)
	<ol>
<li>Bereiten Sie den Verankerungspuffer vor (siehe Tabelle 1). Für die Verankerungsbehandlung PBS durch 250 l Verankerungspuffer pro Brunnen direkt auf den Glasdeckelschlupf ersetzen und bei Raumtemperatur 3 h inkubieren. Halten Sie Substrat im Dunkeln mit einer Box. HINWEIS: Alternativ können Sie über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie frischen Ankerpuffer für jedes Experiment vor und warten Sie 10-15 min, bis er richtig aufgelöst ist. 6-(Acryloyl)amino)hexanosäure, succinimidylester (AcX) sollte alle 4-5 Monate ersetzt werden, um eine ausreichende Verankerung zu gewährleisten.</li>
		<li>Entfernen Sie den Verankerungspuffer und waschen Sie einmal mit 1,5 ml PBS pro Brunnen.</li>
		<li>Um Aktinfasern zu färben, tauen Sie eine ExM-kompatible Phalloidin-Lösung auf und inkubieren Sie das Phalloidin (5 l Phalloidin in 195 l von 1% (v/v) BSA in PBS/Well) für 45 min bei Raumtemperatur. Halten Sie Proben im Dunkeln mit einer Box.</li>
		<li>In der Zwischenzeit Natriumacrylat inddH2O mit einem Rührgerät auflösen. Auf Eis die Monomerlösung vorbereiten (siehe Tabelle 1). HINWEIS: Gelöstes Natriumacrylat sollte eine klare und farblose Lösung sein. Wenn die Lösung gelb ist, durch neues Natriumacrylat ersetzen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Gelierlösung auf Eis vor (siehe Tabelle 1). Pipette Ammoniumperoxidsulfat (APS) in die Gelierlösung direkt vor dem Auftragen der Gelierlösung auf die Gelierkammer.</li>
		<li>Phalloidin aus den Zellen nehmen und bei Raumtemperatur zweimal mit 1,5 ml PBS waschen. Lassen Sie 1,5 ml PBS im Brunnen, um die Entnahme der Probe auf dem Glasdeckelzuschlag zu erleichtern.</li>
		<li>Legen Sie die Zellen auf dem Deckglas mit Zangen und einer Kanüle in die Gelierkammer, um den Deckelglasschlupf von der 6-Well-Platte zu heben. HINWEIS: Die Zellen sollten sich auf der Oberseite des Glasdeckels befinden. Der Glasdeckel-Slip sollte die Abstandshalter nicht berühren.</li>
		<li>Fügen Sie APS der Gelierlösung hinzu und wirbeln Sie in Kürze. Pipette 200 L Gelierlösung auf der Probe (Abbildung 2A4-C4). Schließen Sie vorsichtig die Gelationskammer, indem Sie Luftblasen innerhalb des Gels vermeiden (Abbildung 2A5-C5).</li>
		<li>Inkubieren Sie die Gelierkammer für mindestens 1 h bei 37 °C, um das Gel in der nassen Färbekammer zu polymerisieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Homogenisierung (Verdauung)
	<ol>
<li>Nehmen Sie die Färbekammer aus dem Inkubator. Um den Gelationskammerdeckel zu öffnen, führen Sie eine Rasierklinge zwischen deckel und Abstandhalter ein. Entfernen Sie den Deckel vorsichtig. Entfernen Sie die Abstandshalter mit der Rasierklinge und beseitigen Sie alle zusätzlichen Gel, indem Sie es mit der Rasierklinge schneiden.</li>
		<li>Setzen Sie die Folie mit dem Gel und Deckenglas in eine Schale mit PBS gefüllt. Durch sanftes Schütteln entfernen Sie das abgetrennte Deckglas aus dem Gel. Um das Gel leicht von der Schale zu entfernen, legen Sie die Folie unter das Gel, um das Gel an der Folie zu befestigen.</li>
		<li>Mit dem Gel auf der Folie, teilen Sie das Gel in kleine Stücke (Viertel des Gels ist in zwei bis drei Stücke unterteilt) mit der Rasierklinge. Drücken Sie vorsichtig ein Stück Gel in einen Brunnen einer 6-Well-Platte mit Glasboden und umschließen Sie es mit einem Pinsel. Halten Sie das Gel mit einer kleinen Menge PBS mit dem Pinsel, um eine Austrocknung des Gels zu vermeiden. HINWEIS: Die Zellen zeigen nach unten.</li>
		<li>Nehmen Sie mit einem invertierten Mikroskop Übersichtsbilder mit niedriger numerischer Blende, um den Expansionsfaktor nach der Expansion zu bestimmen.</li>
		<li>Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor (siehe Tabelle 1). Proteinase K bis 4 U/ml im Verdauungspuffer verdünnen, um die Verdauungslösung zu erhalten. HINWEIS: Der Verdauungspuffer ohne Proteinase K kann 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 500 l der Verdauungslösung hinzu und tauchen Sie das Gel in die Lösung ein. Lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur verdauen und schließen Sie den Deckel, um die Proben im Dunkeln zu halten. HINWEIS: Alternativ lassen Sie es bei 37 °C für 1 h verdauen.</li>
	</ol></li>
	<li>Expansion
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Verdauungslösung mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. 1 ml ddH2O hinzufügen. Das eingetauchte Gel 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie das Wasser und fügen Sie 1 ml frische ddH2O. Warten Sie auf 10 min und fahren Sie Wasser alle 10 min, bis ein Plateau der Expansion erreicht ist. HINWEIS: Eine Probenerweiterung bis zum 4,5-fachen ist erreichbar. Das Gel wird optisch klar.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Wasser aus dem Gel und starten Sie direkt mit der Mikroskopie. Verwenden Sie mit hilfe eines invertierten Mikroskops in erster Linie ein Luftobjektiv (niedrige Vergrößerung), um abgebildete Zellen im Zustand vor der Ausdehnung zu finden (Schritt 4.3.4).</li>
		<li>Wechseln Sie zu einem 40x (Öl/Wasser) und 63x Objektiv für eine bessere Auflösung. Erregen Sie mit der Wellenlänge des Interesses und nehmen Sie das Bild über die Kamera.</li>
	</ol></li>
	<li>Validierung
	<ol>
<li>Sehen Sie sich ein Übersichtsbild des Beispiels an. Suchen und anpassen Sie dieselben Strukturen innerhalb des Beispiels, die in Schritt 4.3.4 abgebildet wurden. Verwenden Sie den Kanal mit dem besten Signal-Rausch-Verhältnis für die Validierung (Abbildung 3 A-B). HINWEIS: Passen Sie die Bildparameter an, um eine ähnliche Helligkeit zu erzielen wie in dem Bild, das im nicht erweiterten Zustand aufgenommen wurde (Schritt 4.3.4).</li>
		<li>Überlagern Sie Vor- und Nacherweiterungsbilder, indem Sie sie mit ImageJ drehen und verschieben. Verwenden Sie das Entfernungsmesswerkzeug in ImageJ, um die Abstände zwischen klar identifizierbaren Strukturen zu messen. Messen Sie mindestens 10 verschiedene Strukturen. HINWEIS: Alternativ können Sie ein Python-Skript verwenden, um Entfernungen zu messen, wie in14beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie den Expansionsfaktor, indem Sie Die Messungen nach/vor der Ausdehnung dividieren.</li>
		<li>Um Verzerrungen zu bestimmen, nehmen Sie Bilder mit einer höheren numerischen Blende auf (Abbildung 4A-B). Überlagern Sie diese Bilder und analysieren Sie sie mit ImageJ oder wie in15beschrieben. HINWEIS: Die Bestimmung von Verzerrungen sollte routinemäßig, aber nicht unbedingt für jede Probe durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, zelluläre Proteine, z.B. Podocin, Nephrin und zytoskelettale Komponenten, z.B. F-Actin, zu visualisieren. Innerhalb dieses Protokolls werden transfizierte cos7-Zellen als Modell verwendet, um die Wechselwirkung von Spaltmembranproteinen mit F-Actin zu untersuchen. Leider drücken verewigte Podozytenzelllinien nicht genügend endogene Mengen an Spaltmembranproteinenaus 19.
Mit dieser Methode können zelluläre Proteine mit...

Albuminurie ist ein Ersatzparameter des kardiovaskulären Risikos und resultiert aus einer Störung des Glomerularfilters1. Der glomeruläre Filter besteht aus dem fenestrated Endothel, der glomerulären Kellermembran und dem durch Podozyten gebildeten Schlitzzwerchfell. Primäre und sekundäre Fußprozesse von Podozyten wickeln sich um die Kapillarwand des Glomerulums2. Die empfindliche Struktur der Fußprozesse wird durch kortikale Aktinbündel aufrechterhalten, die auch als Anker für mehrere Spaltmembranproteine und andere Adapterproteine dienen2. Das Rückgratprotein des Spaltzeswirdn stutztisch heißt Nephrin und interagiert auf homophile Weise mit Nephrinmolekülen gegensätzlicher Podozyten. Über verschiedene Adapterproteine wird Nephrin mit dem Aktin-Zytoskelett2,3verbunden. Mutationen im Nephrin-kodierenden Gen NPHS1 führen zu einem nephrotischen Syndrom des finnischenTyps 4.
Eines der interagierenden Proteine von Nephrin ist Podocin, ein haarförmiges Protein der Stomatin-Familie3. Podocin rekrutiert Nephrin zu Lipidflößen und verbindet es mit dem Aktin-Zytoskelett5. Podocin wird durch das NPHS2-Gen kodiert. Mutationen in NPHS2 führen zu steroidresistentem nephrotischem Syndrom6.
Um Aktin-Adapterproteine zu visualisieren und mitzulokalisieren, können Immunfluoreszenztechniken eingesetzt werden. Leider begrenzt die Beugungsbarriere des Lichts die Auflösung herkömmlicher Fluoreszenzmikroskope auf 200-350 nm7. Neuartige Mikroskopietechniken, z.B. stimulierte Emissionserschöpfung (STED)8, photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)9, stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM oder dSTORM) oder Bodenzustandslöschmikroskopie gefolgt von individueller Molekülrückführung (GSDIM)9,10,11, ermöglichen eine Auflösung bis ca. 10 nm. Diese Superauflösungstechniken erfordern jedoch sehr teure Mikroskope, gut ausgebildetes Personal und sind daher in vielen Laboratorien nicht verfügbar.
Die Erweiterungsmikroskopie (ExM) ist eine neuartige und einfache Technik, die eine hochauflösende Bildgebung mit herkömmlichen Mikroskopen ermöglicht und potenziell einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung steht12. In der Proteinretentionsexpansionsmikroskopie (proExM) ist die Vonsamkeitsprobe (Zellen oder Gewebe) fixiert und mit Fluorophoren13gefärbt. Proteine innerhalb der Probe werden dann kovalent durch ein kleines Molekül (6-((Acryloyl)amino)Hexanosäure, Succinimidylester, AcX) in ein anschwellendes Hydrogel13verankert. Durch enzymatische Verdauung mit Proteinase K (ProK) behalten Proteine und Fluorophore ihre relative Position innerhalb des Gels nach der Ausdehnung13bei. Nach Schwellung des Gels dehnt sich die Probe bis zum 4,5-fachen (90-fache volumetrische Ausdehnung) aus, was zu einer effektiven lateralen Auflösung von ca. 60-70 nm (300 nm/4,5) führt. Modifikationen dieser Technik können sogar eine 10-fache Erweiterung ermöglichen (1.000-fache volumetrische Expansion), wodurch eine Auflösung von 20-30 nm bei herkömmlichen Mikroskopen14,15,16.
Glomeruläre Strukturen von Maus und menschlichen Nieren wurden über ExM17visualisiert. In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes proExM-Protokoll vor, um Superauflösungsbilder von F-Actin und dem Actin-Adapter-Proteinpodocin in Zellen mit einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren.

<table><tbody><tr><td>Acrylamid >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td><td></td></tr><tr><td>6-((Acryloyl)amino)hexansäure, Succinimidylester, Acryloyl-X, SE</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td>bis zu 4 Monate lagern</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser (Deckgläser)</td><td>Engelbrecht</td><td>K12432</td><td>24x32mm #1.0</td></tr><tr><td>Diamont Cutter</td><td>VWR</td><td>201-0392</td><td>zum Zuschneiden der Deckgläser</td></tr><tr><td>Guanidine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272-100G</td><td>8M Vorrat kann bei RT</td></tr><tr><td>aufbewahrt werden Marder Haarpinsel</td><td>Leon Hardy</td><td>3 (770)</td><td></td></tr><tr><td>"Menzel" Deckgl&auml; ser (Deckgläser)</td><td>Thermo Fischer&nbsp;</td><td>15654786</td><td>24x24mm #1,5</td></tr><tr><td>N,N'-Methylenbisacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Objekttr&auml; iger UniMark</td><td>Marienfeld</td><td>703010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacrylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408220</td><td>Reinheit prüfen&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Färbekammer</td><td></td><td></td>, <td>hergestellt in der Werkstatt der Universität</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>ROTH</td><td>2367.1</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Glasbodenplatten</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actin-ExM 546&nbsp;</td><td>chrometra</td><td>nicht verfügbar</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Anti Podocin hergestellt in Kaninchen</td><td>Sigma</td><td>P-0372-200UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Esel Anti Meerschweinchen CF633</td><td>Sigma</td><td>SAB4600129-50UL</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Ziege Anti Kaninchen 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11034</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Meerschweinchen Anti Nephrin</td><td>Origene</td><td>BP5030</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AXIO Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>nicht verfügbar</td><td></td></tr></tbody></table>

bildgebung der podozytischen proteine nephrin, actin und podocin mit erweiterungsmikroskopie

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Die Störung des glomerulären Filters, der aus dem glomerulären Endothel, der glomerulären Kellermembran und den Podozyten besteht, führt zu Albuminurie. Podozyten-Fußprozesse enthalten Aktinbündel, die an zytoskelettale Adapterproteine wie Podocin binden. Diese Adapterproteine, wie Podocin, verbinden das Rückgrat des glomerulären Schlitzzwerchfells, wie Nephrin, mit dem Aktin-Zytoskelett. Die Untersuchung der Lokalisation und Funktion dieser und anderer podozytischer Proteine ist für das Verständnis der Rolle des Glomerularfilters bei Gesundheit und Krankheit von wesentlicher Bedeutung. Das vorgestellte Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, Actin, Podocin und Nephrin in Zellen mit Superauflösung simtogebungsbildn auf einem herkömmlichen Mikroskop zu visualisieren. Erstens werden Zellen mit einer herkömmlichen Immunfluoreszenztechnik gefärbt. Alle Proteine innerhalb der Probe werden dann kovalent an einem anschwellenden Hydrogel verankert. Durch die Verdauung mit Proteinase K werden strukturelle Proteine spaltet, was eine isotropische Schwellung des Gels im letzten Schritt ermöglicht. Die Dialyse der Probe in Wasser führt zu einer 4-4,5-fachen Ausdehnung der Probe und die Probe kann über ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden, was eine mögliche Auflösung von 70 nm ergibt.

Das Konzept und das Timing dieses proExM-Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt. Am 5. Tag werden transfizierte Zellen fixiert und mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt, die auf das Protein von Interesse abzielen (Abbildung 1A,B). Am 6. Tag führt die Behandlung mit AcX zur Bildung von Amingruppen auf allen Proteinen (einschließlich Fluorophoren) (Abbildung 1A,B...

Die vorgestellte Methode ermöglicht die Visualisierung fluoreszierend markierter zellulärer Proteine mit Erweiterungsmikroskopie, die zu einer Auflösung von 70 nm auf einem herkömmlichen Mikroskop führt.

Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Dieses mikroskopische Erweiterungsprotokoll ermöglicht es dem Forscher, glomeruläre Proteine mit nanoskaliger Auflösung auf einem herkömmlichen Mikroskop zu visualisieren. Der Hauptvorteil der Erweiterungsmikroskopie besteht darin, dass sie für eine große Forschungsgemeinschaft zugänglich ist. Beginnen Sie damit, Abstandshalter für die Gelationskammer herzustellen.Schneiden Sie Nummer eins und Nummer 1,5 Glasabdeckung rutscht in fünf Millimeter Streifen, mit einem Diamantmesser. Legen Sie eine Glasrutsche in eine Färbekammer und positionieren Sie die Zahl 1,5-Abdeckungsstreifen auf der Glasrutsche, so dass sie ein Quadrat von 2,5 Zentimetern bilden. Pipette ein Tröpfchen von doppelt destilliertem Wasser in die Ecken des Quadrats, um die Glasabdeckung Rutschen Streifen zueinander und auf die Glasrutsche zu haften.Warten Sie ca. 20 Minuten, damit die Abdeckungsbelege der Nummer 1,5 stabil befestigt sind. Pipette ein Tröpfchen Wasser auf jeder Zahl 1.5 Abdeckung Slip Streifen. Legen Sie vier Glasabdeckungsstreifen Nummer eins auf die Nummer 1.5-Abdeckungsslips.Für den Gelationskammerdeckel ein Deckglas mit Paraffinfolie wickeln, um Falten oder Schmutz auf der Folie zu vermeiden. Für d

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Research

Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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