Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Das Darmmodell ist eine weitgehend anpassungsfähige und physiologische Möglichkeit, um zu messen, wie undicht der Darm ist und wie Leukozyten bei Mäusen in vivo im Darm wandern. Diese Methode hilft, die Mechanismen besser zu verstehen, die einer erhöhten Darmpermeabilität und einer pathologischen Darmentzündung zugrunde liegen. Die Technik kann eingesetzt werden, um die Mechanismen zu verstehen, die der Darmbarrierefunktion und pathologischen Entzündungen zugrunde liegen, wie sie bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn beobachtet werden.

Dieses Modell verwendet ein gut vaskularisiertes, exteriorisiertes Darmsegment, entweder des Ileums oder des proximalen Dickdarms, zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion oder der Rekrutierung von Immunzellen bei der Maus. Mit dieser breiten Anwendung kann das Darmschleifenmodell Aufschluss über Erkrankungen geben, die entweder aus einer undichten Darmbarriere sowie der Entzündungsreaktion resultieren. Kämpfe können durch das Üben der chirurgischen Schritte überwunden werden.

Es ist von entscheidender Bedeutung, ein vollständig vaskularisiertes Darmsegment zu exteriorisieren und geeignete Stellen für die Ligationen auszuwählen, um Blutungen zu vermeiden. Das Darmschleifenmodell ist eine mikrochirurgische Technik, daher profitiert es, wie bei anderen chirurgischen Eingriffen, stark von der visuellen Demonstration und einer schrittweisen Darstellung der Methode. Nachdem Sie eine chirurgische Anästhesieebene erreicht haben, beginnen Sie mit dem Schrubben des Fells der Abdominalmittellinie mit Alkoholtupfern oder einem mit 70% Ethanol getränkten Mullschwamm.

Befeuchten Sie einen großen Bereich des Fells nicht mit Alkohol, um Unterkühlung zu verhindern. Führen Sie mit einer Schere eine Midline-Laparotomie durch. Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches und legen Sie das Peritoneum frei, wobei Sie darauf achten, die intraabdominalen Organe nicht zu verletzen.

Legen Sie vorgeschnittene nasse Baumwollgaze über die freiliegende Intraabdominhöhle. Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den Blinddarm zu mobilisieren und nach außen zu entfernen, und legen Sie ihn vorsichtig auf nasse Baumwollgaze. Mobilisieren Sie dann das Ileum und äußerlich.

Setzen Sie mindestens sechs Zentimeter terminales Ileum auf die nasse Baumwollgaze aus, ohne die Mesenterigefäße und die Blutversorgung zu stören. Halten Sie das exponierte Gewebe jederzeit mit warmem HBSS feucht. Identifizieren Sie die Hauptarterie, die das Ileum im Mesenterium in der Nähe des Blinddarms versorgt.

Lokalisieren Sie dann zwei Ligationsstellen im Mesentery, die frei von kritischen Blutgefäßen sind. Greifen Sie das terminale Ileum mit einer stumpfen Gewebezette fest und verwenden Sie eine feine Spitzenzette, um das Mesenterium zu fenestrieren und Blutgefäße zu vermeiden. Legen Sie die Seidennähte über die Perforation und binden Sie einen chirurgischen Knoten, um die erste Ligatur zu erzeugen.

Verwenden Sie das Lineal, um vier Zentimeter von der ersten Ligatur entfernt zu messen, und erstellen Sie die zweite Ligatur. Schneiden Sie vorsichtig neben jeder Ligatur mit einer feinen Schere, um die vier Zentimeter große Ilealschleife zu isolieren und die Blutversorgung und die Mesentermembran intakt zu halten. Spülen Sie den Inhalt des Ilealschleifensegments vorsichtig mit warmem HBSS mit einer flexiblen gelben Zuführsonde, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist.

Stellen Sie sicher, dass Sie den luminalen Inhalt aus der Bauchhöhle spülen, um die Operationsstelle sauber zu halten. Ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden der gespülten Ilealschlaufe mit Seidennäht. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel, um langsam 250 Mikroliter Reagenz wie FITC-Dextrans oder Chemokin in das Darmlumen zu injizieren.

Die Ilealschleife bläst sich auf und verursacht eine moderate Dehnung der Schleimhaut. Schließen Sie die Bauchdecke mit einem Nadelhalter, einer anatomischen Einer zette und 3,0 nicht resorbierbaren Seidennähten mit einer umgekehrten Schneidnadel. Nachdem Sie das Tier getrocknet haben, um eine Hypothermie zu verhindern, legen Sie es für die Inkubationszeit in eine temperaturregulierte Anästhesiekammer.

Bereiten Sie die Maus auf die Operation vor und exteriorisieren Sie den Blinddarm, wie zuvor gezeigt. Mit nassen Wattestäbchen das gesamte Ileum außen machen und auf eine nasse Baumwollgaze legen. Identifizieren Sie den proximalen Dickdarm und die Blutversorgung im Mesokolon.

Mobilisieren Sie den proximalen Dickdarm und erstellen Sie die erste Ligatur in einem Bereich, der frei von Gefäßen im Mesocolon ist, etwa 0,5 Zentimeter distal vom Blinddarm entfernt. Messen Sie zwei Zentimeter von der ersten Ligatur und erstellen Sie eine zweite Ligatur an einem Bereich, der frei von Blutversorgung im Mesokolon ist. Schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig neben jeder Ligatur ab, um eine zwei Zentimeter lange pcLoop zu isolieren.

Spülen Sie den pcLoop vorsichtig mit warmem HBSS, um Kot mit einer flexiblen gelben Ernährungssonde zu entfernen, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den luminalen Inhalt aus der Bauchhöhle spülen, um die Operationsstelle sauber zu halten. Dann ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden des gespülten pcLoop mit Seidennäht.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel, um langsam 200 Mikroliter Reagenz wie FITC-Dextran oder Chemokin in das Darmlumen zu injizieren. Der pcLoop bläst sich auf, was zu einer moderaten Dehnung der Schleimhaut führt. Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den ligierten pcLoop, das Ileum und den Blinddarm vorsichtig zurückzulegen.

Schließen Sie die Bauchdecke mit einem Nadelhalter, einer anatomischen Einer zette und 3,0 nicht resorbierbaren Seidennähten mit einer umgekehrten Schneidnadel. Nach der Inkubationszeit die anästhesierte Maus einschläfern und Gewebe zur Analyse sammeln. Um die Genauigkeit des I-Schleifenmodells zur Beurteilung der Darmpermeabilität zu überprüfen, wurde ein FITC-Dextran pcLoop-Assay durchgeführt, um die Rolle des Tight Junction-assoziierten Proteins Jam-a bei der Regulation der Darmbarrierefunktion in vivo zu bewerten.

Mit dem pcLoop-Modell wurde bei Jam-a-Nullmäusen im Vergleich zu Kontrollpersonen ein 2,5-facher Anstieg der FITC-Dextran-Serumspiegel quantifiziert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Mäusen erzielt, die einen selektiven Verlust von Jam-a auf Darmepithelzellen hatten. Das pcLoop-Modell wurde verwendet, um die Rekrutierung von polymorphonukleären Neutrophilen oder PMN in die Darmschleimhaut und die anschließende transepitheliale Migration in vivo zu untersuchen.

Die Anzahl der PMN im Luminalgehalt des pcLoop wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse quantifiziert. Die Anzahl der PMN im Segment des proximalen Dickdarms war unter physiologischen Bedingungen gering. Die Vorbehandlung mit entzündungsfördernden Zytokinen, TNF alpha und IFN gamma vor der Operation führte zu einer erhöhten Anzahl von PMN, die im pcLoop-Lumen rekrutiert wurden.

Die Verabreichung des PMN-Chemolockstoffs LTB4 führte zu einem dramatischen Anstieg der PMN-Zahlen. Immunhistochemische Färbung von PMN in der Dickdarmschleimhaut bestätigt die erhöhte Rekrutierung von PMN nach Stimulation mit Zytokinen und LTB4. Der Beitrag von Jam-a zur transepithelialen PMN-Migration wurde mit dem pcLoop-Modell an Mäusen untersucht, die einen selektiven Verlust von Jam-a auf Darmepithelzellen beherbergen.

Der Verlust von epithelialer Jam-a führte zu einer reduzierten Anzahl von transmigriertem PMN im Dickdarmlumen im Vergleich zu Littermatkontrollen. Ein kritischer Aspekt für diese Technik ist es, bei der Durchführung der Operation daran zu denken, die Blutversorgung des exteriorisierten Darmsegments auf zu erhalten. Nach diesem Protokoll können andere Methoden wie ein Darmpermeabilitätstest und ein neutrophiler transepithelialer Migrationstest durchgeführt werden, um den Verlust der Barriereintegrität und die Darmentzündung in vivo zu untersuchen.