Name: Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Methode der fettbedeckten Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe zur Untersuchung von Insel-Engraftment-Mechanismen. Dieses einfach replizierbare Verfahren ermöglicht die Detektion transplantierter Inseln ohne Biobindemittel.

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Diese Studie wurde durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (C) (19K09839, NS) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie finanziert.

Das folgende Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt. Der erste Schritt umfasst die Induktion von Diabetes bei den Empfängermäusen und die Isolierung von Spenderinseln. Der zweite Schritt beinhaltet die Vorbereitung von Inselchen vor der Transplantation. Im dritten Schritt wird die Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und die Abdeckung der Inseln mit dem Fettgewebe durchgeführt. Danach wurden die therapeutischen Wirkungen bewertet. Der Umgang mit den Mäusen und die in dieser Studie durchgeführten experimentellen Verfahren entsprechen den ''Principles of Laboratory Animal Care'' (Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, National Institutes of Health Publikation 8. Auflage, 2011), und das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee der Fukuoka University genehmigt (Zulassungsnummer: 186018).
1. Chirurgische Vorbereitung
<ol><li>Induktion von Diabetes: Induzieren Sie Diabetes in 20-25 g Körpergewicht, 8-12 Wochen alten männlichen Empfängermäusen durch intravenöse Injektion von 18 mg / ml Streptozotocinlösung, die in 0,1 Mio. Citratpuffer (180 mg / kg Körpergewicht) hergestellt wurde. Mäuse mit einem Blutzuckerspiegel von mehr als 400 mg / dl gelten als Diabetiker. Verwenden Sie diabetische Mäuse innerhalb von 1 Woche nach Diabetes-Induktion vor übermäßiger Atrophie des epididymalen weißen Fettgewebes zur Abdeckung der Inseln.</li>
	<li>Inselisolierung: Führen Sie einen Tag vor der Transplantation eine murine Inselisolierung nach Gotohs Methode27 zur Inselisolierung durch.</li>
	<li>Kurz gesagt, verdauen Sie Pankreasgewebe mit Kollagenaselösung. Isolieren Sie Inseln durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung einer geeigneten Zelltrennlösung. Dann kultivieren Sie Inselchen über Nacht in einem Inkubator bei 22 °C und 5%CO2 (Kultur bei <37 °C wurde berichtet, um den Inseltod zu verhindern 28,29,30,31). HINWEIS: Behandeln Sie die gereinigten Inselkulturen in einer Sicherheitswerkbank. Filtersterilisieren Sie alle Lösungen, die für die Inselisolierung und -kultur verwendet werden, mit einem 0,22-μm-Filter.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Inselchen für die Transplantation
<ol><li>Sammeln Sie die geeigneten Instrumente und Materialien, wie in Abbildung 1A dargestellt.</li>
	<li>Da Verdauungsenzyme wie Amylase und Lipase zu einer Verletzung der isolierten und transplantierten Inseln führen können und ein Verlust von Inseln auftreten kann, wenn sie in kontaminierendem fibrösem Gewebe innerhalb der Kulturschale eingeschlossen sind, verwenden Sie vor der Transplantation eine Pinzette, um alle Komponenten der zusätzlichen Insel aus der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und Fasergewebe, von Hand auszuwählen (Abbildung 1B). unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie nach der Ernte ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern.</li>
	<li>Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die ein geeignetes Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung (z. B. DMEM mit niedrigem Glucosegehalt, RPMI1640, CMRL1066 oder HBSS) enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin, um eine Anhaftung der Insel an Kunststoff zu verhindern, und die Schale schwenken, um die Inseln in der Mitte der Schale zu positionieren (Abbildung 1C). Entnehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P200-Mikropipette und dem Mikroskop in ein geeignetes Sammelröhrchen (Abbildung 1D).</li>
	<li>Setzen Sie ein neues, 40-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Kunststoffröhrchen (Abbildung 1E links und Mitte) und waschen Sie den Filter mit frischem Medium (Abbildung 1E rechts).</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1000-μL-Pipette, um die Inseln in das Sieb zu geben, um die Inseln und einzelnen Azinuszellen zu trennen (Abbildung 1 F1 und Abbildung 1F2). HINWEIS: Die gereinigten Inseln auf dem Zellsieb sind ungefähr 100% rein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf einer neuen, 60 oder 100 mm großen, unbehandelten Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, die mit Rinderserum oder Albumin ergänzt wird (Abbildung 1 F3 und Abbildung 1F4). Verwenden Sie frisches Medium/Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen. Fügen Sie dann genügend Medium/Puffer in die Kulturschale ein, um ein Gesamtvolumen von ca. 20 ml zu erreichen.</li>
	<li>Zählen Sie die Inseln unter einem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-ml-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf (Abbildung 1G). Zum Beispiel würden zweihundert 100-200 μm Inseläquivalente (IEQ) von zwei Mäusen zu jeder von zwei Röhrchen hinzugefügt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2.100 x g innerhalb von 1 Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Etwa 20-30 μL Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen (Abbildung 1H).</li>
</ol>3. Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und Abdeckung mit epididymalem weißem Fettgewebe
<ol><li>Sammeln Sie vor der Operation ein Anästhesiegerät für Kleintiere, Stereomikroskop, Lichtquelle, 50-200 μL Mikropipette mit 200 μL Mikropipettenspitzen, Wattestäbchen, ein 4-0-Nahtset und desinfizierte chirurgische Instrumente (Abbildung 2A). Autoklavieren Sie die Cooper-Schere, die Augenschere, die Erbsenzange, die Pinzette und die Nadelhalter. Nach dem Autoklavieren tauchen Sie das Gerät in eine 1%ige Povidon-Jod-Lösung (Abbildung 2A). Verwenden Sie Wattestäbchen zur Mobilisierung des Nebenhoden-Fettgewebes und zur Hämostase bei Blutungen. Verwenden Sie eine Mikropipette mit 50-200 μL Spitzen für die Inseltransplantation.</li>
	<li>Verabreichung der Anästhesie an die diabetische Empfängermaus mit einem inhalativen Anästhetikum (2% Isofluran in Sauerstoff). Tragen Sie Augengleitmittel auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Legen Sie dann die Maus in Rückenlage (Abbildung 2B links) und entfernen Sie die Haare aus dem Bauch, um eine Infektion mit Haarschneidemaschine und/oder Enthaarungscreme zu verhindern. Desinfizieren Sie den Bauch und die Leistengegend mit mindestens drei abwechselnden Runden einer Povidon-Jod-Lösung, gefolgt von 70% Ethanol (Abbildung 2B rechts). Bestätigen Sie vor der Operation die Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes. Bieten Sie intraoperative thermische Unterstützung mit einem Heizkissen und verwenden Sie einen chirurgischen Vorhang, um den sterilen chirurgischen Bereich zu sichern.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein (Abbildung 2C links). Ein Hautschnitt von ca. 2 cm Länge wird empfohlen. Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit der Pean-Pinzette (auch eine schonende Pinzette oder ein Retraktor können verwendet werden) und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern (Abbildung 2C rechts). Verringern Sie nach der Laparotomie den Prozentsatz von Isofluran auf 1,0-1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus (dh der linken Seite des Bedieners) zu mobilisieren. Das linke Nebenhoden-weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich. Mobilisieren Sie das epididymale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen (Abbildung 2D links) und strecken Sie das Gewebe aus (2D rechts).</li>
	<li>Verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer 200-μL-Pipettenspitze, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-ml-Röhrchen mit sanftem Pipettieren zu erfassen (Abbildung 2E links), wobei darauf zu achten ist, dass bei der Entnahme keine Inseln im Röhrchen verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft an der Spitze der Pipette absetzen (Abbildung 2E rechts).</li>
	<li>Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe. Achten Sie darauf, ein übermäßiges Ausspülen des Mediums/Puffers in der Spitze zu vermeiden, und säen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe (Abbildung 2F links). Bestätigen Sie nach der Aussaat eine korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop (Abbildung 2F rechts).</li>
	<li>Bedecken Sie die Inseln mit dem epididymalen weißen Fettgewebe (Abbildung 2G). Die Verwendung von Nähten oder Biobindemitteln ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Legen Sie den linken Hoden unter das epididymale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück (Abbildung 2H). Schließen Sie die Haut in zwei Schichten (Peritoneum, dann Muskel und Haut) mit einer 4-0-Naht (alle Nähte wie Nylon oder resorbierbare Nähte können verwendet werden) (Abbildung 2I). Acetylsalicylsäure (300 mg/kg; SQ) in der Nähe der Wunde für postoperative Analgesie. Legen Sie dann die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.</li>
</ol>4. Überwachung nach Inseltransplantation (Zusammenfassung)
<ol><li>Beurteilung der therapeutischen Wirkungen der Inseltransplantation durch Überwachung des Blutzuckers, des Glukosetoleranztests und der histologischen Beurteilung am postoperativen Tag (POD) 28.<ol><li>Überwachen Sie den Blutzucker, einschließlich der Messungen des Blutzuckers beim Glukosetoleranztest, mit einem kleinen Blutzuckermessgerät.</li>
		<li>Sammeln Sie die Blutproben (ein wenig Mikroliter) aus der Schwanzvene. In Bezug auf die histologische Beurteilung wurden murines Insulin (zum Nachweis von transplantierten Inseln) und der von-Willebrand-Faktor (zum Nachweis von Gefäßen, was ein Beweis für Inseltransplantation ist) in transplantierten Inseln im wiedergewonnenen Nebenhodenfettgewebe durch Immunhistochemie nachgewiesen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mold-casted+non-degradable%2C+islet+macro-encapsulating+hydrogel+devices+for+restoration+of+normoglycemia+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).</li>
</ol>

Wir haben keinen Interessenkonflikt.

Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode umfasst Techniken aus zwei verschiedenen Transplantationstechniken: intraperitoneale Inseltransplantation und intraadipöse Gewebeinseltransplantation. Da die Oberflächenmembran des epididymalen weißen Fettgewebes als das weiße Fettgewebe angesehen wird, das vom Peritoneum bedeckt ist und an den Nebenhoden befestigt ist, kann die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode anatomisch als eine Art intraperitoneale Inseltransplantation kategorisiert werden. Die Technik, mit der di...

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie für Patienten mit schwerem Diabetes mellitus. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass sich die Insulinunabhängigkeitsraten drei Jahre nach der Transplantation auf bis zu 44 %1 verbessern und dass etwa 80 % der Empfänger, die insgesamt mehr als 600.000 Inseläquivalente erhalten, eine Insulinunabhängigkeit erreichen2. Darüber hinaus wurde im jüngsten Bericht des Collaborative Islet Transplant Registry festgestellt, dass der Nüchternblutzuckerspiegel bei über einen Zeitraum von 5 Jahren bei über 70% der Patienten, die sich einer Inseltransplantation unterzogen hatten, über einen Zeitraum von 5 Jahren bei 60-140 mg / dl gehalten wurde. Die Studie ergab auch, dass etwa 90% der Patienten, die nach einer Nierentransplantation nur eine Inseltransplantation oder eine Inseltransplantation erhielten, über 5 Jahre lang keine schweren hypoglykämischen Ereignisse entwickelten3.
Obwohl sich die klinischen Ergebnisse dieser Behandlung verbessert haben, müssen noch einige Einschränkungen angegangen werden, einschließlich der Notwendigkeit, eine optimale Transplantationsstelle zu etablieren. Die Leber ist eine typische Transplantationsstelle für die klinische Inseltransplantation, da sie das größte Organ ist, das ein hohes Volumen an Inseln aufnehmen kann. Bei einigen Patienten ist jedoch die Leber nicht verfügbar (z. B. aufgrund von portaler Hypertonie, Hepatitis und/oder Zirrhose4) und daher andere Stellen, einschließlich des renalen subkapsulären Raums5,6, des omentalen Beutels 7,8,9,10, des Mesenteriums 11, des Magen-Darm-Trakts 12, der Skelettmuskulatur 13, des Unterhautgewebes 13, des Knochenmarks 14 und der Milz 15 ,16,17, wurden als alternative Transplantationsstellen in Betracht gezogen.
Obwohl die intraperitoneale Inseltransplantation leicht unter örtlicher Betäubung durchgeführt werden kann, was die intraperitoneale Höhle zu einem attraktiven Ort für die klinische Inseltransplantation macht, sind die Inseln nach der Transplantation über die gesamte intraperitoneale Höhle verteilt, was die Inseltransplantationserkennung und die erfolgreiche Bestätigung der Anpflanzung erschwert. Daher ist die intraperitoneale Höhle nicht allgemein als ideale klinische Transplantationsstelle anerkannt. Stattdessen wird es häufig als Kontrollmodell für präklinische Studien verwendet, um die Wirksamkeit von transplantierten eingekapselten18 und biotechnologisch hergestellten Inselnzu untersuchen 19. Ein genauer Vergleich zwischen biotechnologisch hergestellten und Kontrollinseln ist jedoch aufgrund der Herausforderungen bei der Durchführung einer genauen Engraftment-Bewertung schwer zu erreichen.
Im Gegensatz dazu wurde die Verwendung von intraperitonealem weißem Fettgewebe im omentalen Beutel8, Mesenterium und anderen extrahepatischen Stellen gut berichtet 10,20,21,22,23 und viele der Studien, die die Funktion von biotechnologisch hergestellten Inseln untersuchten, die mit weißem Fettgewebe transplantiert wurden, konnten vielversprechende therapeutische Ergebnisse berichten20,24,25, 26. Da die Verwendung von Nebenhodenfettgewebe den Nachweis transplantierter Inseln erleichtert, wurde die "fettbedeckte Inseltransplantationsmethode" entwickelt, bei der epididymales Fettgewebe verwendet wird, um die Einschränkungen der intraperitonealen Inseltransplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wird die fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhodenfettgewebe beschrieben.

<table><tbody><tr><td>4-0 Nylon</td><td>Alfresa</td><td>ER2004NA45-KF2</td><td>Abdomen</td></tr><tr><td>schließen Alexa 488-konjugierter Esel Anti-Meerschweinchen</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>706-546-148</td><td>Sekundärer Antikörper gegen Insulin Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa 647-konjugierter Esel Anti-Kaninchen</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>Sekundärer Antikörper gegen Von-Willebrand-Faktor</td></tr><tr><td>Antikörper DMEM, niedrige Glukose, Pyruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885084</td><td>Kultivieren von Inseln, Verpflanzen von Inselzellen</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>051-06515</td><td>Verwendung zum Färben von Gewebe mit Eosin</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Auffangen von Inseln&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Auffanginseln</td></tr><tr><td>Falcon 40 & micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Verwendung zur Trennung von Inselzellen von anderem Pankreasgewebe</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>Verwerfen von überschüssigem Medium/Puffer</td></tr><tr><td>Meerschweinchen-Anti-Insulin</td><td>Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)</td><td>IR002</td><td>Primärantikörper für Mausinsulin</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd.</td><td>30002</td><td>Verwendung zur Färbung von Gewebe mit Hämatoxylin-Isodin-Lösung</td></tr><tr><td>10%</td><td>Shionogi&Co., Ltd.</td><td>keine Katalognummer</td><td>Verwendung zur Desinfektion</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>095-06573</td><td>Verwendung für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Labcon 1000 & micro; L ZapSilk Pipettenspitzen mit niedriger Retention</td><td>Labcon</td><td>1177-965-008</td><td>Zur Trennung von Inselzellen von anderem Pankreasgewebe</td></tr><tr><td>Labcon 200 & micro; L ZapSilk Low Retention Pipettenspitzen</td><td>Labcon</td><td>1179-965-008</td><td>Verwendung zur Aussaat von Inselzellen auf nebenhodes weißes Fettgewebe</td></tr><tr><td>Mintsensor</td><td>Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,</td><td>8AEB02E</td><td>Verwendung zur Überwachung des Blutzuckers</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>Verwendung zur Trennung von Inselzellen von anderem Pankreasgewebe</td></tr><tr><td>Pipetteman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>Verwendung zur Aussaat von Inselzellen auf nebenhodes weißes Fettgewebe</td></tr><tr><td>Kaninchen anti-vWF</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td>Primärer Antikörper gegen murinen von-Willebrand-Faktor</td></tr></tbody></table>

fettbedeckte inseltransplantation mit nebenhoden-weißem fettgewebe

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie bei schwerem Diabetes mellitus. Die intraperitoneale Höhle ist typischerweise die Transplantationsstelle für dieses Verfahren. Die intraperitoneale Inseltransplantation hat jedoch einige Einschränkungen, darunter eine schlechte Transplantationswirksamkeit, eine schwierige Transplantaterkennung und einen Mangel an Graftektomiefähigkeit für die Analyse nach der Transplantation. In diesem Artikel wird die "fettbedeckte Inseltransplantation", eine intraperitoneale Inseltransplantationsmethode, die epididymales weißes Fettgewebe verwendet, verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln zu bewerten. Die Einfachheit der Methode liegt in der Aussaat von Inseln auf epididymales weißes Fettgewebe und die Verwendung des Gewebes zur Abdeckung der Inseln. Während diese Methode als intraperitoneale Inseltransplantationstechnik kategorisiert werden kann, teilt sie Merkmale mit der Transplantation von Injektionsinseln innerhalb des Fettgewebes. Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode zeigt jedoch robustere therapeutische Wirkungen als die Inseltransplantation im intrafetten Gewebe, einschließlich der Verbesserung des Blutzucker- und Plasmainsulinspiegels und des Potenzials zur Entfernung von Transplantaten. Wir empfehlen die Anwendung dieser Methode zur Beurteilung der Mechanismen der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe und der therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln.

Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von Kontrollempfänger-Diabetikern implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm (p = 0,0023; Abbildung 3A). Einen...

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, den Mechanismus der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser fettbedeckten Inseltransplantationsmethode besteht darin, dass sie technisch einfach zu replizieren ist. Die Methode kann auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden.Zum Beispiel kann es verwendet werden, um ein Mausmodell von Krebs zu erstellen. Naoaki Sakata, außerordentlicher Professor an der Universität Fukuoka, demonstriert das Verfahren. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine P 200-Mikropipette, um zusätzliche Inselbestandteile aus den Verdauungen der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und fibrösem Gewebe, zu entfernen.Verwenden Sie dann ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern. Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die das entsprechende Kulturmedium oder die mit Rinderserum oder Albumin ergänzte Pufferlösung enthält, und schwenken Sie die Schale, um die Inseln in der Mitte zu positionieren. Nehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P 200 Mikropipette in ein geeignetes Auffangrohr.Setzen Sie ein neues 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Inseln zum Sieb hinzuzufügen, um die Inseln und die einzelnen Azinuszellen zu trennen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf eine neue 60 oder 100 Milliliter große, unbehandelte Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin.Verwenden Sie frisches Medium oder Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen, und fügen Sie dann genügend Medium oder Puffer zur Kulturschale hinzu, um ein Gesamtvolumen von etwa 20 Milliliter zu erreichen. Zählen Sie die Inseln unter dem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf. Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2, 100 G für eine Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.Etwa 20 bis 30 Mikroliter Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen. Nachdem Sie die Haare aus dem Bauch entfernt haben, um eine Infektion zu verhindern, legen Sie die Maus in Rückenlage. Nach der Desinfektion des Bauches und der Leistenregion schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein, wodurch ein Hautschnitt entsteht, der etwa zwei Zentimeter lang ist.Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit einer Pinzette oder Retraktoren und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus zu mobilisieren. Das linke epidermale weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich.Mobilisieren Sie das epidermale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen und dehnen Sie das Gewebe aus. Verwenden Sie eine P 200-Mikropipette, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-Milliliter-Röhrchen zu sammeln, und achten Sie darauf, dass bei der Entnahme keine Inseln in der Röhre verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft in der Spitze der Pipette absetzen.Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe und achten Sie darauf, eine übermäßige Spülung des Mediums oder einen Puffer in der Spitze zu vermeiden. Samen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe. Bestätigen Sie nach der Aussaat die korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop.Bedecken Sie die Inseln mit dem epidermalen weißen Fettgewebe, legen Sie dann den linken Hoden unter das episomale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück. Verschließen Sie die Haut in zwei Schichten mit einer 4-o-Naht. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von diabetischen Kontrolltieren implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm. Die intraperitoneale Glukosetoleranz wurde einen Monat nach der Transplantation durchgeführt.Der Blutzucker bei Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation wurde auf niedrigeren Werten gehalten als bei intraperitonealen Inseltransplantatmäusen. Die histologische Untersuchung wurde verwendet, um die Inseltransplantation in das epidermale weiße Fettgewebe zu beurteilen. Bei fettbedeckten Inseltransplantat-Empfängertieren zeigte die Hämatoxylin-Eozän-Färbung das Vorhandensein von Inseln im epidermalen weißen Fettgewebe.Darüber hinaus erleichterte die fluoreszenzkonjugierte Antikörperfärbung von insulinpositiven Inseln den Nachweis von von-Willebrand-Faktor-positiven Mikrogefäßen im epidermalen weißen Fettgewebe aller Empfängermäuse. Um mit diesem Verfahren erfolgreich zu sein, stellen Sie sicher, dass sich die Inseln vollständig an der Spitze der Pipette absetzen und sie auf das Fettgewebe säen, ohne zu verschütten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Unser Protokoll wurde entwickelt, um sauber und einfach liefern Inseln oder Zellen unter die Nierenkapsel von Mäusen. Die Zellen werden zu Pellets in den letzten Schlauch für die Transplantation der Zellen unter die Nierenkapsel verwendet konzentriert. Die Leichtigkeit dieser Technik reduziert den Stress auf die Zellen und der Maus.

Transplantation von Pankreas-Inseln in die Niere Capsule von diabetischen Mäusen

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Um die zellulären und molekularen Mechanismen neotissue Bildung und Stenose Entwicklung in Gewebezüchtungen Herzklappen zugrunde liegen, wurde ein Maus-Modell der heterotopen Herzklappentransplantation entwickelt. Eine Lungenherzklappe wurde mit der heterotopen Herztransplantation Technik, um Empfänger transplantiert.

Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation

Erfahren Sie die Methode der fettbedeckten Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe zur Untersuchung von Insel-Engraftment-Mechanismen. Dieses einfach replizierbare Verfahren ermöglicht die Detektion transplantierter Inseln ohne Biobindemittel.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

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