Name: Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Erfahren Sie ein proinflammatorisches Organkulturmodell zur Simulation von Bandscheibendegeneration mit bovinen Caudal-IVDs im Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von IDD-Pathophysiologie und die Testung therapeutischer Strategien.

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Diese Arbeit wurde von der AO Foundation und AOSpine International unterstützt. Babak Saravi erhielt Fellowship-Unterstützung von der Deutschen Wirbelsäulenstiftung und der Deutschen Arthrose-Stiftung. Gernot Lang wurde unterstützt durch das Berta-Ottenstein-Programm für Advanced Clinician Scientists, Medizinische Fakultät, Universität Freiburg, Deutschland.

Die Experimente wurden mit Rinderschwänzen aus lokalen Schlachthöfen durchgeführt. Die in der aktuellen Studie verwendeten biologischen Materialien stammen aus der Nahrungskette und bedürfen keiner ethischen Zulassung im schweizerischen und europäischen Recht.
1. Dissektion der Bandscheibe des Rinds
<ol><li>Spülen Sie den ganzen Schwanz gründlich mit Leitungswasser ab, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Bei intakten, distalen Enden können je nach gewünschter Größe der IVDs maximal 9 IVDs (Steißbein 1-9) pro Schwanz für die Experimente verwendet werden. Unter Berücksichtigung des gewünschten Durchmessers zwischen 15-20 mm haben wir für die Experimente 12 Rinderschwänze mit 5 IVDs pro Schwanz verwendet.</li>
	<li>Tauchen Sie den ganzen Schwanz für 10 Minuten in eine Schachtel mit 1% igen Betadinlösung. Trocknen Sie den Schwanz kurz mit steriler Gaze ab und legen Sie ihn auf einen sterilen Vorhang. HINWEIS: Befeuchten Sie während der Dissektion der Scheibe die Schwänze mit Ringers lösungsbenetzter Gaze, um Austrocknung zu verhindern. Lagern Sie die Schwänze (oder übrig gebliebenen Segmente) in nasser Gaze eingewickelt, bis der gesamte Seziervorgang abgeschlossen ist.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Skalpell (Nr. 20), um das Weichgewebe so vollständig wie möglich von der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querprozesse der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange. HINWEIS: Wählen Sie IVDs mit dem gewünschten Durchmesser aus. In der aktuellen Studie wurden IVDs mit einem Durchmesserbereich von 15-20 mm verwendet.</li>
	<li>Schneiden Sie quer mit einer Knochenzange durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um individuelle Bewegungssegmente zu erhalten. Legen Sie Bewegungssegmente in eine Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist.</li>
	<li>Lokalisieren Sie ivD und Wirbel durch Palpation und durch sanftes Bewegen der Bewegungssegmente. Machen Sie zwei parallele Schnitte mit der Bandsäge in der Wachstumsplatte der IVDs, einen auf jeder Seite der IVD. Identifizieren Sie die Position der Wachstumsplatte, indem Sie die konvexe Stelle des knöchernen Endplattenteils (hart) neben der Scheibe (weich) mit einem Sicherheitsabstand von etwa 0,5-1 mm vom IVD zum Wirbel berühren und finden. Stellen Sie sicher, dass das Blatt der Bandsäge beim Schneiden der Wirbel mit Ringers Lösung gekühlt wird.</li>
	<li>Übertragen Sie IVDs in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist. HINWEIS: Die Gaze sollte angefeuchtet und nicht zu nass sein, um ein Anschwellen der IVDs zu verhindern.</li>
	<li>Verwenden Sie die Skalpellklinge, um den Wirbelkörper (rot / rosa Knochen), die Wachstumsplatte (weißer Knorpel) abzukratzen, lassen Sie die Endplatte intakt (gelb-rosa). Machen Sie die beiden Flächen flach und parallel für den Ladevorgang. Übertragen Sie geschabte IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist. HINWEIS: Tragen Sie einen Kettenhemdhandschuh, um die Hand zu schützen, während Sie die IVD halten und abkratzen.</li>
	<li>Messen Sie die Scheibenhöhe und den Durchmesser mit einem Bremssattel. Reinigen Sie die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit Ringers Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.</li>
	<li>Übertragen Sie die IVDs auf 50 ml Kunststoffröhrchen, eine IVD pro Röhrchen. Fügen Sie 25 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 10% Penicillin / Streptomycin (P / S) pro IVD hinzu und lassen Sie es 15 Minuten auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur schütteln.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 10 ml PBS + 1% P / S pro IVD für 2 minuten hinzu, um die IVDs zu spülen.</li>
</ol>2. IVD-Kultur und -Beladung
<ol><li>Übertragen Sie die Scheiben in IVD-Kammern und fügen Sie IVD-Kulturmedium hinzu (Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, 4,5 g/L DMEM mit hohem Glukosegehalt für die physiologische Gruppe und 2 g/L DMEM mit niedrigem Glukosegehalt für die pathologische Gruppe) + 1% P/S + 2% fetales Kalbsserum + 1% ITS (enthält 5 μg/ml Insulin, 6 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Selennsäure) + 50 μg/ml Ascorbat-2-phosphat + 1% nicht essentielle Aminosäure + 50 μg/ml antimikrobielles Mittel für Primärzellen) und in einen Inkubator bei 37 °C, 85 % Feuchtigkeit und 5 % CO2legen.</li>
	<li>Kulturieren Sie die Bandscheiben für 4 Tage innerhalb eines Bioreaktorsystems nach experimentellen Gruppen16. In der pathologischen Gruppe degenerative Belastungsbedingungen bei 0,32-0,5 MPa, 5 Hz für 2 h / Tag beibehalten. Verwenden Sie in der physiologischen Kontrollgruppe ein Ladeprotokoll von 0,02-0,2 MPa, 0,2 Hz für 2 h / Tag. HINWEIS: Positionieren Sie die IVDs während der Ladevorgänge in Kammern mit 5 ml IVD-Medium. Das Volumen hängt von der Größe der Ladekammern des Bioreaktors ab. Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit 7 ml IVD-Kulturmedium zur Erholung der freien Quellung.</li>
	<li>Zur Analyse der Änderungen der Bandscheibenhöhe während des Versuchszeitraums messen Sie die Scheibenhöhe mit einem Bremssattel nach IVD-Dissektion (Baseline) und dann täglich nach der freien Quellperiode und nach dynamischer Belastung für die experimentelle Dauer.</li>
</ol>3. Intradiskale Injektion des Tumornekrosefaktors alpha (TNF-α)
<ol><li>Direkt nach dem ersten dynamischen Ladezyklus an Tag 1 legen Sie die IVDs in eine Petrischale in vertikaler Position und stabilisieren die IVDs mit einer Pinzette.</li>
	<li>Rekombinante TNF-α (100 ng in 70 μL PBS pro IVD) mit einer 30-Gauge-Insulinnadel in das Nucleus pulposus-Gewebe der pathologischen Gruppe17injizieren. Langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 70 μL in 1 min injizieren.</li>
	<li>Ziehen Sie die Spritze nach der Injektion auf halbem Weg zurück in die IVD und ziehen Sie den Spritzenkolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung zurückläuft, bevor Sie die Nadel und die Spritze vollständig aus der IVD entfernen. HINWEIS: Führen Sie ein Pilotexperiment durch, indem Sie PBS mit trypanblauem Farbstoff injizieren, um die Verteilung der injizierten Lösung nach dem Laden und der Kultur über Nacht zu bewerten.</li>
</ol>4. Genexpression
<ol><li>Ernte die IVDs an Tag 4. Sammeln Sie das Nucleus pulposus (NP) Gewebe (geliger Teil in der Mitte der IVD) mit einem Biopsiestempel. Sammeln Sie den äußeren Annulus fibrosus (AF) mit einer Skalpellklinge (Nr. 20). HINWEIS: Für die Ausgangsreferenz am Tag 0 sammeln Sie Gewebe unmittelbar nach der Dissektion für die RNA-Extraktion.</li>
	<li>Verwenden Sie die Menge an NP- oder AF-Gewebe, die für die Genexpressionsanalyse benötigt wird, abhängig vom experimentellen Design. HINWEIS: Für die vorliegenden Experimente wurden ca. 150 mg Gewebe verwendet. Das Verhältnis von RNA-Isolationslösung zu Gewebemasse sollte für eine effiziente Extraktion mindestens 2 ml pro 100-150 mg Gewebe betragen.</li>
	<li>Verdauen Sie das NP- oder AF-Gewebe mit der Aufschlusslösung (0,2% Pronase in DMEM, Filter sterilisiert) und inkubieren Sie es für 1 h bei 37 °C unter magnetischem Rühren18.</li>
	<li>Die Gewebeproben mit flüssigem Stickstoff einfrieren und zu einem feinen Pulver pulverisieren. Teilen Sie das pulverisierte Gewebepulver gleichmäßig in zwei 2-ml-Röhrchen mit jeweils 1 ml Guanidinthiocyanat und Phenol in einer Monophasenlösung (RNA-Isolationslösung).</li>
	<li>Führen Sie die Homogenisierung in 2 ml Röhrchen durch, die die RNA-Isolationslösung und das pulverisierte Gewebepulver enthalten. Homogenisieren Sie das Gewebepulver 5x mit einer 8 mm Edelstahlkugel und einem Tissue-Lyzer bei 30 Hz für 3 min. Zentrifuge bei 12.000 x g,4 °C für 10 min und den Überstand in ein frisches Rohr überführen. Die Überstände können bei -80 °C für mindestens einen Monat gelagert werden.</li>
	<li>0,1 ml 1-Brom-3-chlorpropan (BCP) pro 1 ml RNA-Isolationslösung hinzufügen und 15 s kräftig schütteln. Lagern Sie die resultierende Mischung bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler für 15 min und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. HINWEIS: Die RNA verbleibt ausschließlich in der oberen wässrigen Phase.</li>
	<li>Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und fallen Sie RNA mit 0,25 ml Isopropanol und 0,25 ml Hochsalzausfällungslösung pro 1 ml RNA-Isolationslösung aus, die für die anfängliche Homogenisierung verwendet wird. Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Orbitalschüttler und einer Zentrifuge bei 12.000 x g für 8 min bei 4 °C. HINWEIS: Alternativ können Sie die säulenbasierte RNA-Extraktionsmethode verwenden, die im Allgemeinen zu einer höheren RNA-Reinheit, aber einer geringeren RNA-Ausbeute führt.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol pro 1 ml RNA-Isolationslösung, die für die anfängliche Homogenisierung verwendet wird. Zentrifuge bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Ethanol waschen und RNA-Pellet 3-5 min kurz an der Luft trocknen. Lösen Sie die RNA in 20 μL diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser auf, indem Sie die Lösung einige Male durch eine Pipettenspitze geben und 10-15 min bei 55-60 °C inkubieren.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 230 nm, 260 nm und 280 nm (A230, A260 bzw. A280). A260 von 1,0 entspricht 40 μg/ml RNA. Es wird ein A260/A280-Verhältnis von 1,6-1,9 erwartet, während die Kontamination zu einem A260/A280-Verhältnis von <1,6 führt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Reverse Transkriptase (RT) Reaktionsmischung für ein Reaktionsvolumen von 20 μL vor. Die Mischung enthält RT-Enzymmischung, Ribonuklease-Inhibitor, Helferprotein, Primer, dNTPs, MgCl2,RNase-freies Wasser und 0,4 μg RNA-Probe.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie kurz die RT-Röhrchen, um alle Komponenten am Boden des Rohres zu mischen.</li>
	<li>Legen Sie die Proben in das Thermocycler-Instrument. Wählen Sie das passende Programm für den RT. Führen Sie den RT für 10 min bei 25 °C aus, gefolgt vom umgekehrten Transkriptionsschritt für 120 min bei 42 °C und der Inaktivierung der Reverse Transkriptase für 5 min bei 85 °C, wobei er am Ende auf 4 °C abgekühlt wird.</li>
	<li>Verdünnen Sie die resultierende cDNA mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) (TE)-Puffer (10 mM Tris mit 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 0,4 μg RNA, die für RT pro 100 μL cDNA-Lösung verwendet wird. Lagern Sie die cDNA-Proben bei -20 °C.</li>
	<li>Führen Sie eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit einem Reaktionsvolumen von 10 μL durch. Das Reaktionsvolumen enthält die Mastermischung (enthält DNA-Polymerase, Uracil-DNA-Glykosylase, dNTPs mit dUTP, passive Referenz- und optimierte Pufferkomponenten), Forward Primer 45 μM, Reverse Primer 45 μM, Sonde 12,5 μM (enthält einen Reporterfarbstoff, der mit dem 5'-Ende der Sonde verbunden ist, ein kleines Rillenbindemittel am 3'-Ende der Sonde und einen nicht fluoreszierenden Quencher am 3'-Ende der Sonde) , 2 μL cDNA und DEPC-behandeltes Wasser.</li>
	<li>Führen Sie eine endogene Kontrolle (RPLP0) zur relativen Quantifizierung mit der 2-ΔΔCT-Methode 19durch.</li>
	<li>Fügen Sie Beispiele in Duplikaten hinzu, und führen Sie ein Steuerelement ohne Vorlage aus, indem Sie TE-Buffer anstelle von cDNA hinzufügen. Führen Sie die PCR unter Standardbedingungen durch (2 min bei 50 °C, 10 min bei 95 °C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C).</li>
	<li>Führen Sie eine relative Quantifizierung von mRNA-Targets nach der vergleichenden CT-Methode durch. Die Menge an mRNA, die auf die Baseline-Probe normalisiert wird, wird als 2-ΔΔCTberechnet, während ΔΔCT die Differenz zwischen der ΔCT (CT Target- CT endogene Kontrolle) der Probe und ΔCT (CT Target und CT endogene Kontrolle) der Baseline-Probe ist.</li>
</ol>5. Quantifizierung des Proteingehalts im IVD-Medium
<ol><li>Sammeln Sie das von den IVD-Proben konditionierte Medium, um den Proteingehalt im Medium zu messen. Führen Sie einen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) gemäß dem Protokoll des Zielproteins durch.</li>
	<li>Bovine Interleukine-8 (IL-8) wird durch ein Anti-Bovine IL8 ELISA Kit gemäß der Herstelleranweisung quantifiziert.</li>
</ol>

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<li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells%3A+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Wir haben hier ein detailliertes Protokoll zur Simulation degenerativer und entzündlicher IVDD zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll kann für detaillierte Untersuchungen von Entzündungswegen angewendet werden, die zu den zerstörerischen Auswirkungen auf die Bandscheibe führen. Darüber hinaus kann das Protokoll helfen, vielversprechende therapeutische Ziele zu bestimmen, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass humane rekombinante TNF-α Entzündungen...

Rückenschmerzen (LBP) können Menschen jeden Alters betreffen und sind weltweit eine der Hauptursachen fürBehinderungen 1,2,3. Die gesamtkosten im Zusammenhang mit LBP übersteigen 100 Milliarden US$Dollar pro Jahr4,5. Symptomatische Bandscheibendegeneration (IVD) (IDD), eine Erkrankung, die durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet ist, ist eine Hauptursache für LBP6,7. Insbesondere ist IDD durch einen sich allmählich entwickelnden Zusammenbruch der extrazellulären Matrix (ECM) der IVD gekennzeichnet, der durch mehrere Faktoren induziert und ausgelöst wird, die zu einer beschleunigten Pathologie, neurologischen Störungen und schließlich zu einer Behinderung führen. Darüber hinaus ist IDD mit der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, veränderter Wirbelsäulenbiomechanik, Angiogenese und Nerveningrowth verbunden, was das Schmerzempfinden erhöht und insgesamt chronische LBP (aktive Diskopathie) verursacht6,8. Bisher umfassen die Behandlungsmöglichkeiten die Diskektomie und die anschließende Fusion der benachbarten Wirbel, die Implantation einer IVD-Prothese oder nicht-chirurgische Ansätze wie nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, Opioide und Muskelrelaxantien für Patienten mit IDD9. Beide derzeitigen Standardtherapieoptionen, chirurgische und nicht-chirurgische, sind nur teilweise wirksam und gehen nicht auf das zugrunde liegende biologische Problem ein9,10. Eine degenerative Bandscheibenerkrankung im Frühstadium ist durch eine anfängliche entzündliche Gewebereaktion gekennzeichnet, insbesondere durch eine Zunahme der Tumornekrosefaktor-alpha -Expression (TNF-alpha)11. Diese frühen Bandscheibenveränderungen treten hauptsächlich auf zellulärer Ebene auf, ohne die Bandscheibenarchitektur zu stören und konnten zuvor durch Nährstoffmangel unter entzündungsfördernden Zuständen nachgeahmt werden12. Daher ist eine präzise Simulation der In-vivo-Situation entscheidend, um diese Degenerationsmechanismen zu untersuchen und geeignete therapeutische Ziele zu finden. Zusätzlich zu diesen Simulationen molekularer Eigenschaften spielt die mechanische Belastungsumgebung der Scheiben eine Schlüsselrolle bei pathologischen und physiologischen Veränderungen der IVD. Folglich würde uns die Kombination dieser Ansätze einen Schritt nach vorne bringen, um die komplexe Mikroumgebung von IVDs in vivo nachzuahmen. Es gibt derzeit keine Studien, die den Aspekt der dynamischen Belastung zusammen mit dem entzündungsfördernden und ernährungsphysiologischen Setting nach bestem Wissen und Gewissen berücksichtigen.
Große Tiermodelle erlauben zwar die Untersuchung potentiell relevanter in vivo Wechselwirkungen, sind aber kostspielig und arbeitsintensiv. Da der Einsatz von Tiermodellen in der Forschung seit langem umstritten ist, ist die Reduzierung der Anzahl der Tiere, die zur Beantwortung wichtiger Forschungsfragen benötigt werden, von großem Interesse. Schließlich gibt es derzeit kein ideales Tiermodell, um IDD in der IVD-Forschung nachzuahmen13,14. Daher ist es notwendig, einen kostengünstigen und zuverlässigen Ersatz zu etablieren, z. B. ein Organkulturmodell, um IDD und damit verbundene entzündliche und degenerative Prozesse zu simulieren. Vor kurzem ermöglichte uns die Anwendung des vorliegenden Protokolls zur Etablierung eines proinflammatorischen und degenerativen Organkulturmodells zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium, die Wirkung entzündungshemmender Medikamente in der IDD-Organkultur zu untersuchen15.
Hier beschreiben wir, wie man Bovin-Bandscheiben erhält und den Zustand der IDD im Frühstadium über eine katabole und proinflammatorische Mikroumgebung induziert, die durch direkte intradiskale Injektion von Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und degenerative Belastung in einem Bioreaktor unter niedrigen Nährmediumbedingungen verursacht wird. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Modell und zeigt den Bioreaktor, mit dem degenerative und physiologische Belastungsbedingungen simuliert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Abbildung 1: Abbildung des Versuchsaufbaus. A: Rinderschwanz; B: sezierte Bandscheiben von Rindern; C: Übertragung der Scheibe auf eine Well-Platte mit Kulturmedium; D: Laden der Simulation in einen Bioreaktor; E: intradiskale Injektionstechnik; F: IVD nach Injektion von PBS/Trypanblaufarbstoff, um die Verteilung aufzudecken. IDD: Bandscheibendegeneration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>1-Brom-3-chlorpropan(BCP)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbat-2-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Bandsäge</td><td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Deutschland</td><td>Modell 30/833</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Munndipharma, Frankfurt, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rind IL-8 Do.-it-Yourself ELISA</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>DIY1028B-003</td><td></td></tr><tr><td>Corning ITS Premix</td><td>Corning Inc., New York, USA</td><td>354350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>High Glucose Gibco von life technologies, Carlsbad, USA</td><td>10741574</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Low Glucose</td><td>Gibco von life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11564446</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol für die Molekularbiologie</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>09-0851</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco von life technologies, Carlsbad, USA</td><td>A4766801</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäurelösung</td><td>Gibco von life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td><td>gibco von life technologies, Carlsbad, USA</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung, Tablette</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, Sandiego, USA</td><td>ant-pm-05</td><td></td></tr><tr><td>Pulsavac Jet Lavage System</td><td>Zimmer, IN,USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Quiagen, Venlo, Niederlande</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidinn-HRP</td><td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td><td>AR0068-001</td><td></td></tr><tr><td>Hochgestelltes VILO</td><td>Invitrogen von life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>10704274</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Synthesekit</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>10400745</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix</td><td>Applied Biosystems von life technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-alpha, rekombinantes humanes Protein</td><td>R& D systems, Minnesota, USA</td><td>210-TA-005</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Pufferlösung</td><td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Gen bIL-6</td><td>Angewandte Biosysteme durch Lebenstechnologien</td><td>Maßgeschneiderte Sonden</td><td>Grundierung fw (5&Prime; &ndash; 3&Prime;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A Primer rev (5& prime; &ndash; 3&Prime;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT Sonde (5&prime; FAM/3&Prime; TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td></tr><tr><td>Gene bIL8</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>Bt03211906_m1</td><td></td></tr><tr><td>Gene bTNF-alpha</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>Sonderanfertigungen Sonden</td><td>Primer fw (5&prime; &ndash; 3&Prime;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A Primer rev (5& prime; &ndash; 3&Prime;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT Sonde (5&prime; FAM/3&Prime; TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td></tr><tr><td>GENE bIL1beta</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>Sonderanfertigungen</td><td>Sonden Primer fw (5&prime; &ndash; 3&Prime;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT Primer rev (5& prime; &ndash; 3&Prime;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A Sonde (5&prime; FAM/3&Prime; TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA TCA GCC TCA</td></tr><tr><td>A RPLP0</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>Bt03218086_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

ein proinflammatorisches, degeneratives organkulturmodell zur simulation einer bandscheibenerkrankung im frühstadium.

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Die symptomatische Bandscheibendegeneration (IDD) ist eine große sozioökonomische Belastung und durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet. Aufgrund des Mangels an ursächlichen Therapien besteht ein dringender Bedarf an innovativen experimentellen Organkulturmodellen, um die Mechanismen des Fortschreitens der Krankheit zu untersuchen, therapeutische Ziele zu finden und den Bedarf an Tiermodellen zu reduzieren. Wir präsentieren hier ein neuartiges, dreidimensionales Organkulturmodellprotokoll, das die proinflammatorische und katabole Mikroumgebung nachahmt, die während der IDD vorhanden ist. 
Zunächst wurden bovine Kaud-IVDs im Gewebekulturmedium seziert, gereinigt und kultiviert. Dynamische physiologische oder pathologische Belastung wurde in einem maßgeschneiderten Bioreaktor für 2 Stunden pro Tag angewendet. IVDs wurden vier Tage lang einer Kontrollgruppe (hohes Glukosemedium, physiologische Belastung, phosphatgepufferte Kochsalzinjektion) und einer pathologischen Gruppe (niedriges Glukosemedium, pathologische Belastung, Tumornekrosefaktor-Alpha-Injektion) zugeordnet. Es wurde eine Genexpressionsanalyse aus gesammelten Nucleus pulposus-Zellen der IVDs und ein enzymgebundener Immunsorbent-Assay der konditionierten Organkulturmedien durchgeführt. 
Unsere Daten zeigten eine höhere Expression von Entzündungsmarkern und reduzierte Bandscheibenhöhen nach belastung in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Protokoll ist zuverlässig, um IVD-Entzündungen und -Degenerationen zu simulieren und kann weiter erweitert werden, um seinen Anwendungsbereich zu erweitern.

Die degenerative Belastung in niedrigem Glukosemedium in Kombination mit TNF-α-Injektion verursachte nach 4 Tagen Kultur eine signifikante Erhöhung der Genexpression der proinflammatorischen Marker Interleukin 6 (IL-6) und Interleukin 8 (IL-8) im Vergleich zur physiologischen Kontrollgruppe in NP-Zellen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine signifikanten Veränderungen für die proinflammatorischen Gene Interleukin 1β (IL-1β) und TNF-α in NP-Zellen (Daten nicht gezeigt). Darü...

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges experimentelles Modell der proinflammatorischen, degenerativen Rinderorgankultur vor, um die Bandscheibendegeneration im Frühstadium zu simulieren.

Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Das Protokoll zielt darauf ab, in vivo Bedingungen der Bandscheibendegeneration zu simulieren, um ihre Pathophysiologie ohne Tiermodelle zu untersuchen. Im Vergleich zur In-vitro-Zellkultur erhält die Bioreaktor-Organkulturtechnik die Zellen in ihrer nativen biologischen und biomechanischen mikroen Umgebung zusätzlich zur Versorgung mit einem kontrollierbaren und reproduzierbaren Kulturzustand. Beginnen Sie mit dem gründlichen Spülen des gesamten Rinderschwanzes mit Leitungswasser, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen, und tauchen Sie den Schwanz dann 10 Minuten lang in 1% Betadinlösung, um die Oberfläche zu desinfizieren.Verwenden Sie ein Skalpell Nummer 20, um das Weichgewebe aus der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der Bandscheiben oder IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querprozesse der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange. Schneiden Sie quer mit einer Knochenzange durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um einzelne Bewegungssegmente zu erhalten, und legen Sie dann die gesammelten Bewegungssegmente in eine Petrischale mit einer Gaze, die in Ringers Lösung benetzt ist.Lokalisieren Sie die IVD in Wirbeln, indem Sie die Bewegungssegmente sanft bewegen, und identifizieren Sie dann die Position der Wachstumsplatte, indem Sie die konvexe Seite der knöchernen Endplatte berühren und finden. Kühlen Sie die Klinge der Bandsäge mit Ringers Lösung ab und verwenden Sie sie, um zwei parallele Schnitte in der Wachstumsplatte der IVDs zu machen, einen auf jeder Seite. Die IVDs werden in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze überführen, die mit Ringers Lösung benetzt ist.Kratzen Sie den Wirbelkörper und die Wachstumsplatte mit der Skalpellklinge ab und lassen Sie die Endplatte intakt. Positionieren Sie die beiden Oberflächen flach und parallel für den Ladevorgang und übertragen Sie abgekratzte IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist. Messen Sie die Bandscheibenhöhe und den Durchmesser mit einem Bremssattel und reinigen Sie dann die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit Ringers Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.Desinfizieren Sie IVDs in PBS und 10% Penicillin Streptomycin mit Schütteln für 15 Minuten. Spülen Sie die hochkonzentrierten Antibiotika mit PBS und 1% Penicillin Streptomycin ab. Übertragen Sie die Scheiben in IVD-Kammern mit fünf Millilitern IVD-Kulturmedium und legen Sie sie mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 85% Luftfeuchtigkeit und 5% Kohlendioxid in das Bioreaktorsystem.Kulturieren Sie die Scheiben vier Tage lang innerhalb eines Bioreaktorsystems, indem Sie je nach den Versuchsgruppen unterschiedliche Belastungsbedingungen aufrechterhalten. In der physiologischen Kontrollgruppe werden die IVDs mit hohem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,02 bis 0,2 Megapascal und 0,2 Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert. In der pathologischen Gruppe werden die IVDs mit niedrigem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,32 bis 0,5 Megapascal und fünf Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert.Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit sieben Millilitern IVD-Kulturmedium, um die freie Quellung wiederhergestellt zu werden. Messen Sie die Scheibenhöhe täglich mit einem Bremssattel nach der freien Quellperiode und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer. Nach dem ersten dynamischen Ladezyklus am ersten Tag die IVDs direkt in eine Petrischale in vertikaler Position legen und mit einer Pinzette stabilisieren.Injizieren Sie rekombinantes TNF-alpha mit einer 30-Gauge-Insulinnadel langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa 70 Mikrolitern pro Minute in die IVDs der pathologischen Gruppe. Ziehen Sie nach der Injektion die Spritze auf halbem Weg zurück und ziehen Sie den Kolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung ausläuft, und entfernen Sie dann die Spritze vollständig aus der IVD. Degenerative Belastung in Kombination mit begrenzter Nährstoffversorgung und einer TNF-alpha-Injektion führte nach vier Tagen Kultur zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression der entzündungsfördernden Marker Interleukin six und Interleukin acht im NP-Gewebe.Die Freisetzung von Interleukin-Acht-Proteinen in das konditionierte Medium zeigte am zweiten und vierten Tag einen deutlichen Anstieg der pathologischen Gruppe. Die Verringerung der Bandscheibenhöhe nach belastung war in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur physiologischen Gruppe höher, und die Unterschiede waren nach den Tagen zwei und drei im Vergleich zum ersten Tag ausgeprägter, was auf eine fortschreitende Wirkung der degenerativen und entzündlichen Zustände hinweist. Eine standardisierte Dissektionstechnik ist wichtig für reproduzierbare IVD-Ganzorgankulturmodelle.Ein Bioreaktor ist erforderlich, um physiologische und degenerative Belastungen auf IVDs anzuwenden, um verschiedene biomechanische In-vivo-Bedingungen zu simulieren. Diese Technik kann auf menschliche IVD-Explantierungen angewendet werden, was von hoher klinischer Relevanz ist. Es ist ein neuartiges präklinisches Modell zur Entwicklung wirksamer Behandlungen bei Bandscheibendegeneration im Frühstadium.

a-proinflammatory-degenerative-organ-culture-model-to-simulate-early

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel...

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Kultivierung von Rinderbandscheiben in Bioreaktoren, um ein dreidimensionales Organkulturmodell zu entwickeln. Spezifische nährstoffarme Medien und degenerative Druckbedingungen werden auf die Bandscheiben angewendet, die die proinflammatorische und degenerative Mikroumgebung nachahmen, die bei Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium beobachtet wird. Die Scheibenhöhen werden nach der Behandlung gemessen, um die Auswirkungen von Nährstoffmangel und...

Generierung eines pro-inflammatorischen Organkulturmodells zur Simulation einer frühen Bandscheibenerkrankung

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines proinflammatorischen und degenerativen Organkulturmodells für Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium (IVD) unter Verwendung von TNF-α. Es wird das Verfahren zur Injektion von TNF-α in die Bandscheibe beschrieben und die Mechanismen erläutert, durch die TNF-α Entzündungen und Abbau der IVD induziert.

Generierung eines Organkulturmodells zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium

Ganz Organkultur der Bandscheibe (IVD) bewahrt die native extrazelluläre Matrix, Zellphänotypen und zelluläre-Matrix-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir ein IVD-Kultursystem mit Maus Lenden- und Schwanz IVDs in ihren funktionalen Wirbelsäuleneinheiten und mehrere Anwendungen, die dieses System nutzen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebrale Scheibendegeneration ist ein bedeutender Beitrag zu Rückenschmerzen und eine führende Ursache für Behinderung weltweit. Es gibt zahlreiche Tiermodelle der Bandscheibendegeneration. Wir zeigen ein Schafmodell der Bandscheibendegeneration, wobei ein Bohrer verwendet wird, der eine gleichbleibende Scheibenverletzung und ein reproduzierbares Niveau der Plattendegeneration erreicht.

Schaf-Lendenwirbelsäulen-Degenerationsmodell mit einer lateralen Retroperitoneal-Bohrer-Verletzung

Wir entwickelten ein Lumbar-Bandscheibendegeneration Maus-Modell durch Resektion von L3–L5 Spinnprozesse zusammen mit supra- und inter-spinous Bänder und Ablösung von paraspinous Muskeln.

Ein Mausmodell der Lumbar Spine Instability

Wir stellen eine Methode vor, um die räumliche Chondrozytenorganisation im Anulus fibrosus der Bandscheibe mit einer optischen Schnittmethode zu untersuchen.

Optische Schnittung und Visualisierung der Bandscheibe von der Embryonalentwicklung bis zur Degeneration

Das taktile Messsystem für den Finger quantifiziert den taktilen Druck auf den Finger mithilfe eines hochempfindlichen elektrochirurgischen Drucksensors, wobei die Software die Druckdaten und das Video in Echtzeit anzeigt und genau aufzeichnet. Zwei Analysemodule vereinheitlichen die Datenverarbeitung für das Daumen-Tracking und die Konditionierung während Tuina.

Operationelle und interventionelle Effekte von gezielter Tuina bei Modellkaninchen mit lumbaler Bandscheibendegeneration

Mäuse wurden als Modell für die Untersuchung vieler Formen der Transplantation verwendet, einschließlich der Hornhauttransplantation.  In diesem Bericht beschreiben wir ein Mausmodell sowohl für die akute als auch für die späte Hornhauttransplantation.

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Ex-vivo-Lung Perfusion (EVLP) konnten Lungentransplantation beim Menschen leichter, indem du die Fähigkeit, Organe zu bewerten und zu erweitern den Spenderkreis zur Verfügung stehen. Hier beschreiben wir die Entwicklung einer Ratte EVLP Programm und Verfeinerungen, die für ein reproduzierbares Modell für zukünftige Erweiterungen zu ermöglichen.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

Erfahren Sie ein proinflammatorisches Organkulturmodell zur Simulation von Bandscheibendegeneration mit bovinen Caudal-IVDs im Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von IDD-Pathophysiologie und die Testung therapeutischer Strategien.

Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium.

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