Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli
26. Dezember 2020
Hier präsentieren wir eine Methode, um acetylierte Histonproteine mittels genetischer Codeerweiterung auszudrücken und rekonstituierte Nukleosomen in vitro zusammenzusetzen.
Die Gewinnung eines modifizierten Mononukleosoms ist entscheidend für die Gestaltung epigenetischer Experimente. Unser Protokoll bietet acetylierte rekonstituierte Mononukleosomen, die in biochemischen und Bindungsassays, zur Strukturbestimmung und mehr verwendet werden können. Der Hauptvorteil unserer Technik ist ihre Vielseitigkeit.
Dieses System kann leicht modifiziert werden, um viele Arten von Modifikationen in Mononukleosomen einzubauen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Liters autoklaviertes 2YT-Medium in einem Kulturkolben. Beimpfen Sie 20 Milliliter des Mediums, das geeignete Antibiotika enthält, mit dem co-transformierten Zellstamm, der das Plasmid und pEVOL-AckRS enthält, und züchten Sie sie bei 37 Grad Celsius, um einen OD von 0,6 zu erhalten.
Geben Sie geeignete Antibiotika in einen Liter autoklaviertes 2YT-Medium und impfen Sie es mit 20 Millilitern Starterkultur. Wachsen Sie die Kultur zwei bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um einen OD von 0,6, 2,8 zu erhalten. Induzierende Mittel und AcK für eine Endkonzentration von einem Millimolar IPTG, 0,2 % Arabinose und fünf Millimolar AcK zugeben.
Lass die Kultur sechs bis acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius wachsen. Dann pelletieren Sie die Zellen bei 2.700 x g für 15 Minuten und lagern sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius. Lösen Sie das Pellet in 50 Millilitern Histon-Lysepuffer pro Liter Kultur auf und beschallen Sie die Zellen drei Minuten lang mit einer Sekunde Ein- und einer Sekunde aus.
Einschlusskörper für Pellets bei 41.600 x g für 45 Minuten. Der Überstand wird verworfen und die Einschlusskörper werden in 30 Millilitern Histon-Lysepuffer resuspendiert, dann erneut 30 Minuten lang zentrifugiert. Die Einschlusskörper werden erneut in 30 Milliliter Pellet-Waschpuffer suspendiert und die Zentrifugation wiederholt.
Als nächstes lösen Sie Einschlusskörper in 25 Millilitern sechs molaren Guanidinhydrochlorid-Puffer auf. Eine Stunde lang unter Rühren bei 37 Grad inkubieren, dann 45 Minuten zentrifugieren. Der Überstand wird zwei Stunden lang mit einem Milliliter Nickel-NTA-Harz inkubiert, das mit sechs molaren Guanidiniumhydrochlorid-Puffern äquilibriert ist, und die Nickel-NTA-Reinigung unter denaturierten Bedingungen durchgeführt.
Waschen Sie die Säule mit drei Säulenvolumina Waschpuffer und eluieren Sie dann acetyliertes Histonprotein mit 10 Millilitern Elutionspuffer. Dialysieren Sie das acetylierte Histonprotein gegen 5%igen Essigsäurepuffer, um Salze drei Stunden lang bei vier Grad Celsius zu entfernen, wobei der Puffer mindestens sechsmal ausgetauscht wird. Aliquot und lipolysiert Protein und wird auf unbestimmte Zeit bei minus 80 Grad gelagert.
Lösen Sie die Aliquoten der Histonproteinpellets H2A, H2B, H3 und H4 auf, so dass für das Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern ein separater Bestand jedes Histonproteins in Guanidiniumhydrochlorid-Puffer vorhanden ist. Berechnen Sie die Konzentration jedes Histonproteins, indem Sie die Absorptionsmittel bei 280 Nanometern messen. Wenn die Extinktion für ein Protein größer als eins ist, verdünnen Sie es mit Guanidiniumhydrochlorid-Puffer, um eine genauere Konzentration zu erhalten.
Kombinieren Sie H2A mit H2B und H3 mit H4-Proteinen in einem molaren Verhältnis von eins zu eins und verdünnen Sie es auf eine Gesamtproteinkonzentration von vier Mikrogramm pro Mikroliter. Dialysieren Sie nacheinander bei vier Grad Celsius gegen zwei molare TE-Puffer über Nacht, einen molaren TE-Puffer für zwei Stunden und 0,5 molare TE-Puffer für fünf Stunden. Wenn Sie fertig sind, zentrifugieren Sie bei 16.800 x g bei vier Grad Celsius, um den Niederschlag zu entfernen.
Berechnen Sie die Konzentration von Histon-Dimeren und -Tetrameren, indem Sie die Extinktion bei 280 Nanometern messen. Mischen Sie die Dimere und Tetramere in einem molaren Verhältnis von eins zu eins und stellen Sie die Natriumchloridkonzentration auf 2M ein. Passen Sie 601 DNA an einen zweimolaren TE-Puffer an, indem Sie 100X TE-Puffer und festes Natriumchlorid verwenden.
Geben Sie die Lösung in einem molaren Verhältnis von 0,85, 2,9 zu eins zum Histon-Oktamer. Übertragen Sie das DNA-Histon-Gemisch in einen Dialysebeutel und geben Sie es auf etwa 200 Milliliter zwei molare TE-Puffer unter sehr sanftem Rühren bei vier Grad Celsius. Richten Sie die Peristaltikpumpe so ein, dass sie langsam salzfreien TE-Puffer eintropft.
Wenn sich das Volumen ungefähr verdoppelt hat, gießen Sie die Hälfte des Volumens aus. Tun Sie dies mindestens viermal, was je nach Startlautstärke vier bis acht Stunden dauern kann. Nachdem die Salzkonzentration auf 150 Millimolar reduziert wurde, dialysieren Sie über Nacht gegen einen 20 Millimolar TE-Puffer.
Entfernen Sie Ausfällungen durch Zentrifugation und messen Sie die Konzentration der Nukleosomen mit einem Plattenleser. Fügen Sie his-TEV-Protease hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, um alle Histidin-Tags zu entfernen. Entfernen Sie dann die Histidin-Tag-Verunreinigungen aus der Nukleosomenlösung mit einem Nickel-NTA-Harz-Abzieher.
Eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius inkubieren, um das Nukleosom zu positionieren und die Probe zu homogenisieren. Lagern Sie Nukleosomen kurzfristig bei vier Grad Celsius. Für die Langzeitlagerung dialysieren Sie die Nukleosomen gegen den Lagerpuffer und lagern sie bei minus 80 Grad Celsius.
Einige der acetylierten Tetramere wiesen eine geringere Ausbeute auf als andere, wie durch die Ausführung eines 12%igen SDS-PAGE-Gels beurteilt wurde. Je näher an der Kernregion, desto geringer ist die beobachtete Ausbeute. Dies war höchstwahrscheinlich auf die Acetylierung zurückzuführen, die die Oktameranordnung störte.
Nach dem Assemblieren von Oktameren mit der 601-DNA-Sequenz kann das Nukleosom mit einem 5%1X TBE-nativen PAGE-Gel beurteilt werden, gefolgt von einer Färbung mit Ethidiumbromid. Vor der thermischen Positionierung sind die beobachteten Nukleosomenbanden sehr breit und können Streifen bilden. Halten Sie die Proteine bei der Durchführung dieses Protokolls immer auf Eis.
Es ist entscheidend, die assemblierten Dimere, Tetramere und Nukleosomen zu erhalten. Dieses Verfahren hat es den Forschern ermöglicht, die Acetyllysin-Stellen speziell in Mononukleosomen zu installieren, was die Tür zur Untersuchung posttranslationaler Modifikationen im Chromatinkontext öffnet. Es kann leicht angepasst werden, um eine beliebige Anzahl von nicht-kanonischen Aminosäuren zu installieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein robustes Protokoll für die ortsspezifische Einbindung von Nε-Acetyl-Lysin (AcK) in Histon H3 unter Verwendung der Pyrrolysin-tRNS-Synthetase aus Methanosarcina mazei (MmAcKRS1) und ihrer zugehörigen tRNS in Escherichia coli beschrieben. Die Methode ermöglicht die Herstellung acetylierter Histone, die anschließend zu rekonstituierten Mononukleosomen zusammengebaut werden. Diese modifizierten Nukleosomen stellen wertvolle Werkzeuge für biochemische Assays, Bindungsstudien und strukturelle Analysen dar und fördern die Forschung zu epigenetischen Mechanismen und Proteininteraktionen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Epigenetik
- Proteinengineering
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Die Histonacetylierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation, die an der Chromatinregulation und Genexpression beteiligt ist.
- Die standortspezifische Einbindung von Acetyl-Lysin in Histone ist mit herkömmlichen biochemischen Methoden schwierig.
- Das MmAcKRS1/tRNAPyl-System ermöglicht die genetische Kodierung von AcK an definierten Stellen in Proteinen, die in E. coli exprimiert werden.
- Modifizierte Mononukleosomen sind entscheidend für die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen und epigenetischen Regulationsmechanismen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die ortsspezifische Ein incorporation von AcK in Histon H3 bereitstellen.
- Acetylierte Histone in rekonstituierten Mononukleosomen zusammenbauen.
- Die Herstellung modifizierter Nukleosomen für nachgeschaltete biochemische und strukturelle Untersuchungen ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Ko-Transformation von E. coli mit Plasmiden, die für markiertes Histon H3 sowie pEVOL-AcKRS1/tRNAPyl kodieren.
- Induktion der Proteinexpression mittels IPTG, Arabinose und Zugabe von AcK.
- Isolierung und Reinigung acetylierter Histonproteine über die Aufbereitung von Einschlusskörperchen, Denaturierung und Nickelnitrilotriessigsäure-Affinitätschromatographie.
- Assembly von Histonoktameren und Rekonstitution von Mononukleosomen unter Verwendung der 601-DNA-Sequenz und schrittweiser Dialyse.
- Überprüfung der Nukleosomenassembly mittels nativer PAGE und Proteinquantifizierung.
Hauptergebnisse
- Eine effiziente Einbindung von AcK an spezifischen Stellen in das Histon H3 wurde erreicht.
- Acetylierte Histone wurden erfolgreich gereinigt und in Mononukleosomen zusammengebaut.
- Die Ausbeute acetylierter Tetramere variierte je nach Modifikationsstelle, wobei niedrigere Ausbeuten bei Modifikationen nahe am Histonkern beobachtet wurden.
- Rekonstituierte Nukleosomen wurden mittels nativer PAGE überprüft und können für die Langzeitlagerung verwendet werden.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht die ortsspezifische Einbindung von Acetyl-Lysin in Histone zur Erzeugung modifizierter Mononukleosomen.
- Die Methode ist vielseitig einsetzbar und kann an die Einbindung anderer nichtkanonischer Aminosäuren angepasst werden.
- Diese modifizierten Nukleosomen sind wertvoll für die Untersuchung epigenetischer Mechanismen und Proteinwechselwirkungen im chromatinassoziierten Kontext.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die ortsspezifische Lysinacetylierung von Histonen mittels Erweiterung des genetischen Codes in Escherichia coli ermöglicht eine präzise Untersuchung epigenetischer Modifikationen in einem kontrollierten Chromatinumfeld. Diese Fähigkeit unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung und schafft Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, insbesondere bei der Zielvalidierung und Aufklärung von Signalwegen. Die Methode bietet eine skalierbare Plattform zur Herstellung modifizierter Nukleosomen und wirkt sich damit direkt auf Portfolioentscheidungen in der epigenetikorientierten Forschung und Entwicklung aus.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Histon-Modifikationsstellen im Nukleosomkontext.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem die Auswirkungen spezifischer Acetylierungsereignisse isoliert werden.
- Erleichtert hypothesengetriebene Untersuchungen der chromatinvermittelten Genregulation.
- Bietet eine Plattform zur Untersuchung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen, die für epigenetische Zielstrukturen relevant sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erzeugt validierte, ortsspezifisch modifizierte Nukleosomen für biochemische und Bindungsassays in nachgeschalteten Anwendungen.
- Ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von Nukleosom-Substraten für Hochdurchsatz-Screenings mit hohem Informationsgehalt.
- Ermöglicht quantitative Auswertungen in Struktur-Funktions- und Interaktionsassays.
- Standardisiert Assay-Eingaben für den vergleichenden Wirkstoffvergleich.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt in-vitro-Chromatinmodelle mit krankheitsrelevanten epigenetischen Zuständen in Übereinstimmung.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung epigenetischer Mechanismen.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung epigenetischer Modulatoren, indem vorhersagende in-vitro-Systeme bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in den Entdeckungsprozess integriert, der sich von frühen mechanistischen Studien bis hin zur Leitsubstanzidentifizierung und präklinischen Validierung für epigenetische Zielstrukturen erstreckt.
- Entdeckungsbiochemie: Stellt ein robustes System zur Untersuchung der funktionellen Konsequenzen der standortspezifischen Histonacetylierung bereit.
- Screening: Bietet standardisierte, modifizierte Nukleosomen für die reproduzierbare Entwicklung von Assays und Screening-Workflows.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung der Nukleosomenzusammensetzung und des Modifikationszustands für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit krankheitsrelevanten Chromatinzusammenhängen und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine modulare Plattform, die an andere Einbauten von nichtkanonischen Aminosäuren angepasst werden kann, um vielfältige Anforderungen der Proteinengineering-Forschung zu erfüllen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und verringert mechanistische Unschärfen in der epigenetischen Forschung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Herstellung modifizierter Nukleosomen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Projektfortführung oder -abbruch und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste mechanistische Studien früh im Entwicklungsprozess ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung epigenetischer Targets und Programme.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in molekularer Klonierung, Proteinexpression und Chromatin-Biochemie.
- Benötigt Zugang zu analytischer Infrastruktur zur Proteinreinigung und Validierung der Nukleosomenzusammensetzung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über Teamgrenzen hinweg, um Reproduzierbarkeit bei der Assay-Entwicklung und -Durchführung zu gewährleisten.
- Kann bei entsprechender Weiterentwicklung des Systems auf verschiedene Histon-Stellen und nichtkanonische Aminosäuren angepasst werden.
- Ertragsminderungen können bei Modifikationen in der Nähe des Histon-Kerns auftreten, was die Skalierbarkeit für bestimmte Stellen beeinträchtigen kann.
