Name: Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Bildgebung systemischer Kalzium- und Glutamat-Signale bei Arabidopsis thaliana nach Verletzung. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher und zeitlicher Dynamiken pflanzlicher Stressantworten.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science (17H05007 und 18H05491) an MT, der National Science Foundation (IOS1557899 und MCB2016177) und der National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G und 80NSSC19K0126) an SG unterstützt.

1. Pflanzenmaterialaufbereitung
<ol><li>In einer 1,5 ml Mikroröhrchen sterilisieren Sie die Samen der Arabidopsis thaliana (Col-0 Accession) Pflanze, die entweder GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimiert, indem Sie mit 20% (v / v) NaClO für 3 min schütteln und dann 5 mal mit sterilem destilliertem Wasser waschen. HINWEIS: Die transgenen Linien von Arabidopsis, die GCaMP3 oder CHIB-iGluSnFR exprimieren, wurden zuvor beschrieben6.</li>
	<li>Säen Sie in einer sterilen Haube 13 oberflächensterilisierte Samen auf einer 10 cm großen quadratischen Kunststoff-Petrischale, die mit 30 ml sterilem (autoklaviertem) Murashige und Skoog (MS) Medium gefüllt ist [1x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose, 0,01% (w/v) Myoinositol, 0,05% (w/v) MES und 0,5% (w/v) Gellangummi; pH 5,7 eingestellt mit 1N KOH]. Ersetzen Sie den Deckel und wickeln Sie ihn mit chirurgischem Klebeband ein.</li>
	<li>Nach der Inkubation im Dunkeln bei 4 °C für 2 Tage die Platten horizontal bei 22 °C in eine Wachstumskammer unter Dauerlicht (90-100 μmol m-2 s-1) für ca. 2 Wochen vor Gebrauch legen. Zählen Sie nach 2 Wochen die Anzahl der Arabidopsis-Blätter von den ältesten bis zu den jüngsten44 (Abbildung 1). Wundreaktionen bewegen sich vorzugsweise vom beschädigten Blatt (n) zu Blättern mit den Nummern n ± 3 und n ± 56. HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Petrischale geöffnet, um die Wund- und Glutamateffekte unter einem Fluoreszenzmikroskop abbilden zu können. Daher sollten nachfolgende Schritte in diesem Experiment unter temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raumbedingungen durchgeführt werden. Dies liegt daran, dass Ca2+ Signale auch durch Veränderungen dieser Umgebungsbedingungen ausgelöst werden. Es ist auch bekannt, dass das blaue Licht, das während der Aufzeichnung zur Anregung der Fluoreszenz des Biosensorproteins vom Mikroskop emittiert wird, eine Erhöhung der zytosolischen Ca2+ Konzentration45 hervorrufen kann und daher die Pflanze vor Beginn des Experiments einige Minuten an die Blaulichtbestrahlung gewöhnt werden sollte.</li>
</ol>2. Chemische Zubereitung
<ol><li>L-Glutamat in einem flüssigen Wachstumsmedium [1/2x MS-Salze, 1% (w/v) Saccharose und 0,05% (w/v) MES; pH 5,1 mit 1N KOH eingestellt] auflösen, um eine 100 mM Arbeitslösung herzustellen. HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Glutamatsalzen wie Natriumglutamat, um mögliche kationenbedingte Auswirkungen auf die Ca2+ Dynamik zu verhindern.</li>
</ol>3. Mikroskopeinstellung und Durchführung von Echtzeit-Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie das motorisierte Fluoreszenz-Stereomikroskop ein, das mit einem 1x Objektiv (NA = 0,156) und einer sCMOS-Kamera(Abbildung 2)ausgestattet ist, und konfigurieren Sie die Geräteeinstellungen so, dass es mit einem 470/40 nm Anregungslicht bestrahlt und ein Emissionslicht durch einen 535/50 nm Filter erhält. HINWEIS: Jedes GFP-empfindliche Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden, um GCaMP3- und iGluSnFR-Signale in Echtzeit zu detektieren, aber ein Objektiv mit geringem Stromverbrauch und eine hochempfindliche Kamera mit einem breiten sCMOS-Chip werden empfohlen, um Signale von der gesamten Anlage zu erfassen. Das Low-Power-Objektiv ermöglicht die Abbildung der Reaktion einer gesamten Arabidopsis-Anlage und die Verwendung einer hochempfindlichen Kamera ermöglicht die schnelle Datenerfassung, die erforderlich ist, um den schnellen Zeitverlauf der wundauslösenden Ca2+ Welle zu erfassen. Für das in dieser Studie verwendete Fluoreszenzmikroskop betragen die maximalen Werte des Sichtfeldes und der zeitlichen Auflösung 3 cm x 3 cm bzw. 30 Bilder pro Sekunde (fps).</li>
	<li>Entfernen Sie den Deckel und stellen Sie die Schüssel unter die Objektivlinse.</li>
	<li>Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal der Pflanze und warten Sie dann ca. 30 Min im Dunkeln, bis die Pflanzen an die neuen Umweltbedingungen angepasst sind. Dieser Anpassungsschritt ist erforderlich, da Feuchtigkeitsänderungen [Ca2+]zytenerhöhungen in Pflanzen hervorrufen, die alle wundbedingten Ereignisse stören können.</li>
	<li>Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die gesamte Pflanze im Sichtfeld zu sehen. Im aktuellen Protokoll wurde eine 0,63-fache Vergrößerung verwendet.</li>
	<li>Bevor Sie mit der Echtzeit-Bildgebung beginnen, richten Sie die Erfassungsparameter ein, um die Fluoreszenzsignale mit einer Mikroskop-Bildgebungssoftware zu erkennen. Die Einstellungen für die Bildgebung im aktuellen Protokoll sind: Belichtungs- und Intervallzeiten auf 1,8 s bzw. 2 s (d. h. 0,5 fps) eingestellt. Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 11 min ein.</li>
	<li>Bild für 5 Minuten vor Beginn des Experiments, um die Pflanze an die Blaulichtbestrahlung des Mikroskops zu gewöhnen, und starten Sie dann die Aufnahme, indem Sie auf Jetzt ausführenoder den entsprechenden Befehl in der verwendeten Mikroskopsoftware verwenden. Um die durchschnittliche Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen, zeichnen Sie mindestens 10 Frames (d. h. mindestens 20 s im aktuellen Protokoll) auf, bevor Sie gewickelt oder Glutamat auftragen (siehe Abschnitt 4).<ol>
<li>Zur Echtzeit-Bildgebung von wundinduzierten [Ca2+]Zyt- und [Glu]Apo-Veränderungen schneiden Sie den Blattstiel oder den mittleren Bereich des Blattes L1 mit einer Schere ab (Abbildung 3 und Abbildung 4).</li>
		<li>Für die Echtzeit-Bildgebung von Glutamat-ausgelösten [Ca2+]Zytveränderungen schneiden Sie den Rand (ca. 1 mm von der Spitze entfernt) von Blatt 1 über die Hauptvene mit einer Schere. Nach mindestens 20 Minuten Erholungsphase 10 μL 100 mM Glutamat auf die Schnittfläche des Blattes auftragen (Abbildung 5). HINWEIS: Dieses Vorschneiden war notwendig, um Glutamat den Zugang zum Blattapoplasten zu ermöglichen, um Reaktionen auszulösen. Darüber hinaus erwies sich das Auftragen eines Tropfens destilliertem Wasser auf die Schnittoberfläche des Blattes L1 als kritisch, um zu verhindern, dass die Proben während der Erholung vor dem Auftragen von Glutamat austrocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem Sie die 11-minütige Aufzeichnung abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten.</li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Für die Analyse der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf definieren Sie einen Bereich von Interesse (ROI) an der Stelle, an der die Fluoreszenzintensität analysiert werden soll (Abbildung 6 und Abbildung 7). Definieren Sie für die Geschwindigkeitsberechnung der Ca2+ Welle 2 ROIs (ROI1 und ROI2) für die Analyse. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Zeitmessung | definieren | Kreis. Messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, indem Sie auf Anmerkungen und | Länge | Einfache Linie (Abbildung 6).</li>
	<li>Messen Sie die Rohfluoreszenzwerte (F) in jedem ROI im Laufe der Zeit, indem Sie auf Messenklicken. Exportieren Sie Rohdaten in eine Tabellenkalkulationssoftware, um das Fluoreszenzsignal zu jedem Zeitpunkt in Zahlen umzuwandeln, indem Sie auf All to Excel | Exportieren.</li>
	<li>Bestimmen Sie den Ausgangsfluoreszenzwert, der als F0definiert ist, indem Sie den Durchschnitt von F über die ersten 10 Frames (d. h. vor der Behandlung) in den aufgezeichneten Daten berechnen.</li>
	<li>Normalisieren Sie die F-Daten (durch Berechnung von ΔF/F) mit der Gleichung ΔF/F = (F−F0)/F0, wobei ΔF die zeitabhängige Änderung der Fluoreszenz ist.</li>
	<li>Definieren Sie für die Ca2+ Wellengeschwindigkeitswellenanalyse einen signifikanten Signalanstiegspunkt über den vorstimulierten Werten als Nachweis einer Ca2+ Erhöhung in jedem ROI (t1 und t2) unter Verwendung des Kriteriums eines Anstiegs auf 2× der Standardabweichung (2x SD), die aus den F0-Daten mit statistischer Software berechnet wird. 95% der F0-Daten liegen innerhalb von 2x SD vom Mittelwert, was darauf hindeutet, dass ein Anstieg des Signals über diesem Niveau zufällig ≤5% beträgt. Berechnen Sie die Zeitdifferenz der Ca2+ Erhöhung zwischen ROI1 und ROI2 [t2- t1 Time-Lag (Δt)] und messen Sie den Abstand zwischen ROI1 und ROI2, dann bestimmen Sie die Geschwindigkeiten jeder Ca2+ Welle.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Systemische Signalisierung ist wichtig für Pflanzen, um auf lokalisierte äußere Umweltreize zu reagieren und dann ihre Homöostase auf einer ganzen Pflanzenebene zu erhalten. Obwohl sie nicht wie Tiere mit einem fortgeschrittenen Nervensystem ausgestattet sind, verwenden sie eine schnelle Kommunikation sowohl innerhalb als auch zwischen Organen, basierend auf Faktoren wie mobilen elektrischen (und möglicherweise hydraulischen) Signalen und sich ausbreitenden Wellen von ROS und Ca2 + 46<s...

Pflanzen können biotischen Belastungen, z. B. Insekten, die sich von ihnen ernähren, nicht entkommen, daher haben sie ausgeklügelte Stresssensor- und Signaltransduktionssysteme entwickelt, um Herausforderungen wie Pflanzenfresser zu erkennen und sich dann vor ihnen zu schützen1. Bei Verwundung oder Pflanzenfresserangriff initiieren Pflanzen schnelle Abwehrreaktionen, einschließlich der Ansammlung des Phytohormons Jasmonsäure (JA) nicht nur an der verwundeten Stelle, sondern auch in unbeschädigten distalen Organen2. Dieses JA löst dann sowohl Abwehrreaktionen in den direkt geschädigten Geweben aus als auch präventiv Abwehrkräfte in den unbeschädigten Teilen der Pflanze. Bei Arabidopsiswurde die durch Wunden induzierte Ansammlung von JA in distalen, intakten Blättern innerhalb weniger Minuten nach Beschädigung an anderer Stelle in der Pflanze nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ein schnelles und fernweites Signal vom verwundeten Blatt3übertragen wird. Mehrere Kandidaten, wie Ca2+,reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und elektrische Signale, wurden vorgeschlagen, um als diese Fernwundsignale in Pflanzen4,5zu dienen.
Ca2+ ist eines der vielseitigsten und allgegenwärtigsten zweiten Botenstoffe in eukaryotischen Organismen. Bei Pflanzen verursachen Raupenkauen und mechanische Verwundungen einen drastischen Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration ([Ca2+]Zyt) sowohl im verwundeten Blatt als auch in ungewickelten entfernten Blättern6,7. Dieses systemische Ca2+-Signal wird von intrazellulärenCa2+-Sensorproteinenempfangen, die zur Aktivierung nachgeschalteter Abwehrsignalwege, einschließlich ja-Biosynthese8,9führen. Trotz zahlreicher solcher Berichte, die die Bedeutung von Ca2+-Signalen für pflanzliche Wundreaktionen unterstützen, sind Informationen über die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften von Ca2+-Signalen, die durch Verwundung induziert werden, begrenzt.
Die Echtzeitbildgebung mit genetisch kodierten Ca2+-Indikatoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Überwachung und Quantifizierung der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Ca2+-Signalen. Bis heute wurden Versionen solcher Sensoren entwickelt, die die Visualisierung von Ca2+ Signalen auf der Ebene einer einzelnen Zelle, zu Geweben, Organen und sogar ganzen Pflanzen ermöglichen10. Der erste genetisch kodierte Biosensor für Ca2+, der in Pflanzen verwendet wurde, war das biolumineszierende Protein Aequorin, das aus der Qualle Aequorea victoria11gewonnen wurde. Obwohl dieses chemiluminineszierende Protein verwendet wurde, um Ca2+ Veränderungen als Reaktion auf verschiedene Spannungen in Pflanzen12,13,14,15,16,17,18zu erkennen, ist es aufgrund des extrem niedrigen Lumineszenzsignals, das es erzeugt, nicht gut für die Echtzeitbildgebung geeignet. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Ca2+ Indikatoren, wie die Gelben Kameleons, wurden auch erfolgreich verwendet, um die Dynamik einer Reihe von Ca2+ Signalereignissen in Pflanzen19,20,21,22,23,24zu untersuchen. Diese Sensoren sind mit bildgebenden Ansätzen kompatibel und bestehen am häufigsten aus dem Ca2+-bindenden Protein Calmodulin (CaM) und einem CaM-bindenden Peptid (M13) aus einer Myosin-Leichtkettenkinase, die alle zwischen zwei Fluorophorproteinen verschmolzen sind, im Allgemeinen einem Cyan Fluorescent Protein (CFP) und einer Yellow Fluorescent Protein Variante (YFP)10. Die Ca2+-Bindung an CaM fördert die Interaktion zwischen CaM und M13, was zu einer Konformationsänderung des Sensors führt. Diese Änderung fördert die Energieübertragung zwischen CFP und YFP, was die Fluoreszenzintensität des YFP erhöht und gleichzeitig die Fluoreszenzemission der CFP verringert. Die Überwachung dieser Verschiebung von CFP- zu YFP-Fluoreszenz liefert dann ein Maß für den Anstieg des Ca2+-Niveaus. Zusätzlich zu diesen FRET-Sensoren sind einzelne fluoreszierende Protein (FP)-basierte Ca2+ Biosensoren wie GCaMP und R-GECO auch mit pflanzlichen Bildgebungsansätzen kompatibel und werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und Benutzerfreundlichkeit häufig zur Untersuchung von [Ca2+]-Zytänderungen verwendet25,26,27,28,29,30. GCaMPs enthalten ein einzelnes zirkulär permutiertes (cp) GFP, das wiederum mit CaM und dem M13-Peptid verschmolzen ist. Die Ca2+-abhängigeWechselwirkung zwischen CaM und M13 bewirkt eine Konformationsänderung im Sensor, die eine Verschiebung des Protonierungszustands des cpGFP fördert und sein fluoreszierendes Signal verstärkt. Wenn also die Ca2+-Pegel steigen, nimmt das cpGFP-Signal zu.
Um die Dynamik von Ca2+ Signalen zu untersuchen, die als Reaktion auf mechanische Verwundung oder Pflanzenfresserfütterung erzeugt werden, haben wir transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen verwendet, die eine GCaMP-Variante, GCaMP3, und ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop6exprimieren. Dieser Ansatz hat es geschafft, die schnelle Übertragung eines Ca 2+-Fernsignals von der Wundstelle aufeinem Blatt auf die gesamte Pflanze zu visualisieren. So wurde sofort ein Anstieg des[Ca2+]Zyts an der Wundstelle festgestellt, aber dieses Ca2+ Signal wurde dann innerhalb weniger Minuten nach der Verwundung durch das Gefäß durch die benachbarten Blätter verbreitet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Übertragung dieses schnellen systemischen Wundsignals in Arabidopsis-Pflanzen mit Mutationen in zwei Glutamatrezeptor-ähnlichen Genen, Glutamatrezeptor-like (GLR), GLR3.3 und GLR3.66, aufgehoben wird. Die GLRs scheinen als aminosäuregesteuerte Ca2+ Kanäle zu fungieren, die an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Wundantwort3,Pollenröhrenwachstum31,Wurzelentwicklung32,Kältereaktion33und angeborene Immunität34. Trotz dieser gut verstandenen, breiten physiologischen Funktion der GLRs sind Informationen über ihre funktionellen Eigenschaften, wie ihre Ligandenspezifität, Ionenselektivität und subzelluläre Lokalisation, begrenzt35. Neuere Studien berichteten jedoch, dass GLR3.3 und GLR3.6 im Phloem bzw. Xylem lokalisiert sind. Pflanzliche GLRs haben Ähnlichkeiten mit ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs)36 bei Säugetieren, die durch Aminosäuren wie Glutamat, Glycin und D-Serin im Nervensystem von Säugetieren aktiviert werden37. Tatsächlich haben wir gezeigt, dass die Anwendung von 100 mM Glutamat, aber nicht anderer Aminosäuren, an der Wundstelle ein schnelles, fernförmiges Ca2+ Signal in Arabidopsisinduziert, was darauf hindeutet, dass extrazelluläres Glutamat wahrscheinlich als Wundsignal in Pflanzen wirkt6. Diese Reaktion wird in der glr3.3/glr3.6-Mutante aufgehoben, was darauf hindeutet, dass Glutamat durch einen oder beide dieser rezeptorähnlichen Kanäle wirken könnte, und tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass AtGLR3.6 durch diese Glutamatspiegel38eingezäunt wird.
In Pflanzen wurde Glutamat neben seiner Rolle als strukturelle Aminosäure auch als wichtiger Entwicklungsregulator vorgeschlagen39; seine räumliche und zeitliche Dynamik ist jedoch wenig verstanden. Genau wie für Ca2+wurden mehrere genetisch kodierte Indikatoren für Glutamat entwickelt, um die Dynamik dieser Aminosäure in lebenden Zellen zu überwachen40,41. iGluSnFR ist ein GFP-basierter Single-FP-Glutamat-Biosensor, der aus cpGFP und einem Glutamat-bindenden Protein (GltI) aus Escherichia coli42,43besteht. Die Konformationsänderung von iGluSnFR, die durch Glutamatbindung an GltI induziert wird, führt zu einer verstärkten GFP-Fluoreszenzemission. Um zu untersuchen, ob extrazelluläres Glutamat als Signalmolekül in der pflanzlichen Wundantwort wirkt, haben wir die iGluSnFR-Sequenz mit der grundlegenden Chitinase-Signalpeptidsekretionssequenz (CHIB-iGluSnFR) verbunden, um diesen Biosensor im apoplastischen Raum zu lokalisieren6. Dieser Ansatz ermöglichte die Abbildung von Veränderungen der apoplastischen Glutamatkonzentration ([Glu]apo) mit transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die diesen Sensor exprimieren. Wir haben einen schnellen Anstieg des iGluSnFR-Signals an der Wundstelle festgestellt. Diese Daten unterstützen die Idee, dass Glutamat bei der Verwundung aus den beschädigten Zellen / Geweben in den Apoplast austritt und als Schadenssignal wirkt, das die GLRs aktiviert und zum Fernsignal Ca2+ in Pflanzen6führt.
Hier beschreiben wir ein pflanzenweites Echtzeit-Bildgebungsverfahren mit genetisch kodierten Biosensoren zur Überwachung und Analyse der Dynamik von Fernsignalen von Ca2+ und extrazellulärem Glutamat als Reaktion auf Diebstwunden6. Die Verfügbarkeit von Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und transgenen Pflanzen, die genetisch kodierte Biosensoren exprimieren, bietet einen leistungsstarken, aber leicht zu implementierenden Ansatz zur Erkennung schnell übertragener Fernsignale wie Ca2+ Wellen.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis exprimierende GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis exprimierende CHIB-iGluSnFR</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Gelöst in einem flüssigen Wachstumsmedium [1/2x MS-Salze, 1 % (w/v) Saccharose und 0,05 % (w/v) MES; pH 5,1 eingestellt mit 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige und Skoog (MS) Medium</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>Zusammensetzung: 1x MS-Salze, 1 % (w/v) Saccharose, 0,01 % (w/v) Myoinositol, 0,05 % (w/v) MES und 0,5 % (w/v) Gellangummi; pH 5,7 eingestellt mit 1N KOH.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR-Analyse</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Objektiv (P2-SHR PLAN APO)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS Kamera (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale aus Kunststoff</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

weitfeld-echtzeit-bildgebung lokaler und systemischer wundsignale bei arabidopsis

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Pflanzen reagieren auf mechanische Belastungen wie Verwundung und Pflanzenfresser, indem sie Abwehrreaktionen sowohl in den beschädigten als auch in den distalen unbeschädigten Teilen hervorrufen. Bei der Verwundung eines Blattes tritt an der Wundstelle ein Anstieg der zytosolischen Calciumionenkonzentration (Ca2+ Signal) auf. Dieses Signal wird schnell an unbeschädigte Blätter übertragen, wo Abwehrreaktionen aktiviert werden. Unsere jüngste Forschung ergab, dass Glutamat, das aus den verwundeten Zellen des Blattes in den Apoplasten um sie herum austritt, als Wundsignal dient. Dieses Glutamat aktiviert Glutamatrezeptor-ähnliche Ca2+ durchlässige Kanäle, was dann zu einer Fernausbreitung des Ca2+ Signals in der gesamten Pflanze führt. Die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften dieser Ereignisse können mit Echtzeit-Bildgebung lebender Pflanzen erfasst werden, die genetisch kodierte fluoreszierende Biosensoren exprimieren. Hier stellen wir eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode vor, um die Dynamik sowohl der Ca2+ Signale als auch Veränderungen des apoplastischen Glutamats, die als Reaktion auf Wunden auftreten, zu überwachen. Dieser Ansatz verwendet ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop und transgene Arabidopsis-Pflanzen, die Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Ca2+ und Glutamat-Biosensoren exprimieren. Darüber hinaus stellen wir Methoden vor, um eine wundinduzierte, glutamatgesteuerte schnelle und ferngesteuerte Ca2+ Signalausbreitung leicht hervorzulösen. Dieses Protokoll kann auch auf Studien zu anderen Pflanzenstress angewendet werden, um zu untersuchen, wie die systemische Signalübertragung von Pflanzen an ihren Signal- und Reaktionsnetzwerken beteiligt sein könnte.

Die Signalausbreitung von [Ca2+]cyt und [Glu]apo als Reaktion auf Wunden ist in Abbildung 3, Abbildung 4, Movie S1und Movie S2dargestellt. Das Schneiden des Blattstiels 1 in Pflanzen, die GCaMP3 (bei 0 s) exprimierten, führte zu einem signifikanten Anstieg des [Ca2+]Zyts, der schnell lokal durch das Gefäß (bei 40 s) induziert wurde (<strong c...

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebung der Aktivität des systemischen Signalsystems der Pflanze durch Überwachung der Dynamik des Kalziums und des apoplastischen Glutamats als Reaktion auf Wunden. Diese anlagenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode bietet ein robustes Werkzeug, um die Dynamik der schnellen und fernen Signale in Pflanzen zu verstehen, und kombiniert eine hohe räumliche zeitliche Auflösung und Benutzerfreundlichkeit. Dieses Protokoll bietet das Potenzial, einen neuen Einblick in die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften des Systems Calciumsignalisierung sowohl bei biotischen als auch bei abiotischen Stressreaktionen bei anderen Pflanzenarten zu geben.Takuya Uemura, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Einschalten des motorisierten fluoreszierenden Stereomikroskops, das mit einem 1X-Objektiv und einer sCMOS-Kamera ausgestattet ist. Konfigurieren Sie die Geräteeinstellungen für die Bestrahlung mit Anregungslicht mit einer Zentrierung auf 470 Nanometern, die mit einem Filter ausgewählt wird, der Licht zwischen 450 und 490 Nanometern durchlässt.Erfassen Sie Emissionslicht mit einem Filter, der zwischen 510 und 560 Nanometer überträgt. Entfernen Sie den Deckel aus der Schüssel, in der sich die Pflanze befindet, und legen Sie ihn unter die Objektivlinse. Überprüfen Sie das fluoreszierende Signal der Pflanze.Warten Sie dann ca. 30 Minuten im Dunkeln, bis die Pflanzen an die neuen Umweltbedingungen angepasst sind. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die gesamte Pflanze im Sichtfeld zu sehen. Stellen Sie dann die Erfassungsparameter ein, um die fluoreszierenden Signale mit der Bildgebungssoftware des Mikroskops zu erkennen.Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 11 Minuten ein. Bild für fünf Minuten vor Beginn des Experiments, um die Pflanze an die Blaulichtbestrahlung vom Mikroskop zu gewöhnen, und beginnen Sie dann mit der Aufnahme. Um die durchschnittliche Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen, zeichnen Sie mindestens 10 Frames vor der Verwundung oder Glutamatanwendung auf.Für die Echtzeit-Bildgebung von wundinduzierten zytosolischen Kalziumionen und apoplastischen Glutamatkonzentrationsänderungen schneiden Sie den Blattstiel oder den mittleren Bereich des Blattes L1 mit einer Schere. Für die Echtzeit-Bildgebung von Glutamat ausgelösten zytosolischen Kalziumveränderungen schneiden Sie etwa einen Millimeter von der Blattspitze L1 über die Hauptvene mit einer Schere. Nach mindestens 20 Minuten 10 Mikroliter 100 Millimolarglutamat auf die Schnittfläche des Blattes auftragen.Für die Analyse der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf definieren Sie einen interessierenden Bereich an der Stelle, an der die Fluoreszenzintensität analysiert werden soll. Definieren Sie zwei ROIs für die Geschwindigkeitsberechnung der Kalziumwelle. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Zeitmessung, definieren und kreisen.Messen Sie den Abstand zwischen den beiden Bereichen, indem Sie auf Anmerkungen und Messung, Länge und einfache Linie klicken. Messen Sie die Rohblütenwerte in jedem ROI im Laufe der Zeit, indem Sie auf Messen klicken, und exportieren Sie dann die Rohdaten in eine Tabellenkalkulationssoftware, um das fluoreszierende Signal zu jedem Zeitpunkt in Zahlen umzuwandeln. Bestimmen Sie den Ausgangsfluoreszenzwert, der als F-Null angegeben wird, indem Sie das durchschnittliche F über die ersten 10 Frames in den aufgezeichneten Daten berechnen und dann die F-Daten wie im Textmanuskript beschrieben normalisieren.Definieren Sie für die Calciumgeschwindigkeitswellenanalyse einen signifikanten Signalanstiegspunkt über den vorstimulierten Werten, der den Nachweis eines Kalziumanstiegs in jedem ROI darstellt. Berechnen Sie die Zeitdifferenz im Kalziumanstieg zwischen den beiden ROIs und den Abstand zwischen ihnen, um die Geschwindigkeiten einer Kalziumwelle zu bestimmen. Die Ausbreitung einer wundauslösenden Veränderung der Konzentrationen des zytosolischen Calciumions und des apoplastischen Glutamats wird hier gezeigt.Das Schneiden des Blattstiels eines Blattes in Pflanzen, die GCaMP-3 exprimieren, führte zu einem signifikanten Anstieg des Kalziums. Es wurde lokal induziert und verbreitete sich dann im gesamten Gefäß. Das Signal wurde innerhalb weniger Minuten schnell auf benachbarte Blätter übertragen.Beim Schneiden eines Blattes und von Pflanzen, die einen einfachen Chitinase I-Leimschnüffler exprimieren, wurde ein schneller apoplastischer Glutamatanstieg in der Schnittregion beobachtet. Innerhalb weniger Minuten breitete sich das Signal auch durch das Gefäß aus. Für die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumsignalausbreitung, die durch die Anwendung von Glutamat ausgelöst wird, wurde der Rand eines Blattes in Pflanzen, die CCaMP-3 exprimieren, geschnitten.Dies führte zu einem lokalen Anstieg der zytosolischen Kalziumionenkonzentration, aber das Signal verschwand innerhalb weniger Minuten. Nach etwa 10 Minuten wurde Glutamat auf die Schnittfläche aufgetragen, was zu einem schnellen lokalen Anstieg der Konzentration von zytosolischem Kalzium und dann zur Ausbreitung dieses Signals auf distale Blätter führte. Um die Veränderungen innerhalb einer festen Kalziumkonzentration zu messen, die durch Wunden im systemischen Blatt induziert werden, wurde die zeitliche Verlaufsänderung der GCaMP-3-Signalintensität in zwei interessanten Regionen gemessen.Änderungen der Apoplastischen Glutamatkonzentration als Reaktion auf mechanische Schäden wurden ebenso gemessen. Die Glutamatsignatur zeigte etwa 100 Sekunden nach der Verwundung einen einzigen Peak. Dieses Experiment sollte unter temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, da sie durch Änderungen dieser Umgebungsbedingungen erhöht werden.Dieses Protokoll bietet das Potenzial, Einblicke in die molekularen Mechanismen zu geben, die der Fernsignalisierung zugrunde liegen, indem Mutanten verwendet werden, die die defekten und mutmaßlichen Elemente des Laborsignalsystems sind.

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Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für die Analyse von Kalziumsignale in Pflanzen durch die Fütterung von hemipteran Insekten wie Blattläuse generiert. Arabidopsis Thaliana verwandelt mit der GFP-Kalzium-Biosensor GCaMP3 erlauben die Echtzeit- in-Vivo Bildgebung von Kalzium Dynamik mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

In Echtzeit In Vivo Aufnahme von Arabidopsis Kalziumsignale während der Fütterung mit einer fluoreszierenden Biosensor Insekt

Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Erfahren Sie die Echtzeit-Bildgebung systemischer Kalzium- und Glutamat-Signale bei Arabidopsis thaliana nach Verletzung. Diese Methode ermöglicht die Analyse räumlicher und zeitlicher Dynamiken pflanzlicher Stressantworten.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

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