Name: Akkumulation und Verteilung von fluoreszierenden Mikroplastik in den frühen Lebensstadien von Zebrafischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur visuellen Quantifizierung der Bioakkumulation von Mikroplastik in Zebrafisch-Embryonen und -Larven. Dieses Protokoll nutzt fluoreszierende Polystyrol-Partikel und Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (21777145, 22076170) und dem Programm für Changjiang-Stipendiaten und innovatives Forschungsteam in der Universität (IRT_17R97) finanziert.

Erwachsene Zebrafische stammen aus dem China Zebrafish Resource Center (Wuhan, China). Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem nationalen Leitfaden "Laboratory Animal Guideline for Ethical Review of Animal Welfare (GB/T35892-2018) durchgeführt.
1. Embryo-Sammlung
<ol><li>Halten Sie Fische in 20 L Glastanks mit zirkulierendem, mit Holzkohle gefiltertem Leitungswassersystem (pH 7,0 ± 0,2) bei konstanter Temperatur (28 ± 0,5 °C) auf einer Photoperiode von 14:10 h Hellwasser: dunkel.</li>
	<li>Füttern Sie Fisch zweimal täglich mit Artemia nauplii. Es wird empfohlen, dass das Essen mit max. 3% Fischgewicht pro Tag verabreicht wird und innerhalb von 5 min jedes Mal gegessen werden sollte14.</li>
	<li>Übertragen Sie gut entwickelte erwachsene Zebrafische (mit einer Körperlänge von 3-4 cm) in der Nacht vor der Zucht im Verhältnis von einem Männchen zu zwei Weibchen in den Laichbecken. HINWEIS: Am nächsten Morgen beginnen die Fische nach dem Beginn des Lichtzyklus zu laichen.</li>
	<li>Sammeln Sie Eier mit einer Pasteur Pipette. Spülen Sie mit 10% Hanks Lösung mehrmals, und überprüfen Sie dann auf Düngung mit einem Mikroskop. Befruchtete Eier durchlaufen die Spaltungszeit nach ca. 2 h nach der Befruchtung (hpf) und können eindeutig identifiziert werden15.</li>
	<li>Inkubieren Sie die befruchteten Embryonen in einem 500 ml Becher, der 200 ml 10% Hank-Lösung mit 1% Methylenblau zur Desinfektion bei 28 °C enthält. Überschreiten Sie nicht die Laderate von 1 Embryo/2 ml Lösung. HINWEIS: 10% Hanks Lösung besteht aus 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 und 4,2 mM NaHCO3.</li>
</ol>2. Herstellung von Mikroplastiksuspensionen
<ol><li>Sonicate die Stammlösung aus grünen fluoreszierend markierten Polystyrolperlen (10 mg/ml) mit einem Nenndurchmesser von 500 nm (Erregung/Emission: 460/500 nm) für 10 Minuten.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Lagerlösung mit 10% Hanks Lösung, um die gewünschten Expositionslösungen (0,1, 1 und 10 mg/L) zu produzieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Belichtungslösungen von Mikroplastik immer vor der Exposition vor. HINWEIS: Bei der Beurteilung der toxischen Wirkungen von Mikroplastik ist Vorsicht geboten, da das Vorhandensein von Konservierungsstoffen wie Natriumazid in den kommerziellen Partikelformulierungen für verschiedene Organismen toxisch sein kann 16. Daher sollten diese Zusatzstoffe bei den Kontrollen entfernt oder berücksichtigt werden, bevor Toxizitätsexperimente durchgeführt werden.</li>
</ol>3. Mikroplastische Exposition
<ol><li>Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 6 neu befruchtete Embryonen (4 hpf) aus und übertragen Sie dann in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte, die 5 ml Mikroplastiklösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen enthält. Schließen Sie die Kontrollgruppen ein, die die Hank-Lösung von 10 % enthalten.<ol>
<li>Verwenden Sie dreifache Brunnen (mit insgesamt 18 Embryonen) für jede Behandlung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen unter dem gleichen Licht: dunkler Zyklus und Temperatur wie Erwachsene (siehe 1.2) und beobachten Sie alle 12 Stunden. Entfernen Sie die Toten sofort.</li>
	<li>Erneuern Sie die Mikroplastiklösungen um 90% alle 24 h. Während der Expositionsphase werden die Fische nicht gefüttert. HINWEIS: Im Allgemeinen beginnt das Schlüpfen des Embryos bei 48 hpf und endet bei etwa 72 hpf.</li>
</ol>4. Bewertung der Mikroplastikverteilung
<ol><li>Wählen Sie nach der Befruchtung nach 24, 48, 72, 96 und 120 h nach der Befruchtung nach dem Zufallsprinzip die Embryonen/Larven (eine von jeder der drei Repliken) aus und spülen Sie mit 10% Hanks Lösung aus.</li>
	<li>Die Larven in eine Petrischale geben und 0,016% Tricain zur Anästhesie aussetzen.<ol>
<li>Bereiten Sie die Stammlösung von Tricain vor: 4 mg Tricainpulver werden in 100 ml doppelt destilliertem Wasser gelöst und den pH-Wert mit Tris-HCl (pH 9.0) auf 7,0 eingestellt. Bewahren Sie die Lagerlösung im Gefrierschrank auf.</li>
		<li>Bereiten Sie die Arbeitslösung vor. Verdünnen Sie die Stammlösung auf die gewünschte Konzentration (0,016%) mit 10% Hank-Lösung bei Raumtemperatur14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Embryonen/Larven anordnen und auf die Beobachtung vorbereiten.</li>
	<li>Beobachten Sie die Fische mit einem Fluoreszenzmikroskop und Bild mit Bildgebungssoftware.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität bei Fischen mit ImageJ.</li>
</ol>

<ol><li>SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+Scientific+Perspective+on+Microplastics+in+Nature+and+Society%22">A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society</a>. , SAPEA. Berlin. (2019).</li>
<li>Plastics Europe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plastics-the+facts+2019%22">Plastics-the facts 2019</a>. , Plastics Europe. Brussels. (2019).</li>
<li>Andrady, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+marine+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Pollution+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the marine environment.</a> Marine Pollution Bulletin. 62, 1596-1605 (2011).</li>
<li>Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings+of+the+International+Research+Workshop+on+the+Occurrence%2C+Effects+and+Fate+of+Microplastic+Marine+Debris%5BTitle%5D)+AND+%22National+Oceanic+and+Atmospheric+Administration+Technical+Memorandum%22%5BJournal%5D)">Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris.</a> National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).</li>
<li>Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastic+in+aquatic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microplastic in aquatic ecosystems.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56, 1720-1739 (2017).</li>
<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollutant+toxicology+with+respect+to+microalgae+and+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria.</a> Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).</li>
<li>Huang, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+microplastics+impairs+digestive+performance%2C+stimulates+immune+response+and+induces+microbiota+dysbiosis+in+the+gut+of+juvenile+guppy+%28Poecilia+reticulata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata).</a> Science of the Total Environment. 733, 138929(2020).</li>
<li>Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastic+brain%3A+neurotoxicity+of+micro-+and+nanoplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics.</a> Particle and Fibre Toxicology. 17, 24(2020).</li>
<li>Jakubowska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+exposure+to+microplastics+of+different+polymer+types+on+early+life+stages+of+sea+trout+Salmo+trutta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta.</a> Science of the Total Environment. 740, 139922(2020).</li>
<li>Qiang, L., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+polystyrene+microplastics+impairs+gonads+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio).</a> Chemosphere. 263, 128161(2021).</li>
<li>Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+molecular+damage+in+Nile+Tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+after+exposure+to+microplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics.</a> Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).</li>
<li>Burns, E. E., Boxall, A. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+the+aquatic+environment%3A+Evidence+for+or+against+adverse+impacts+and+major+knowledge+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).</li>
<li>Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplastics+in+aquatic+environments%3A+Toxicity+to+trigger+ecological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences.</a> Environmental Pollution. 261, 114089(2020).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+reio%29.+4th+ed%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+assessments+of+micro-+and+nanoplastics+can+be+confounded+by+preservatives+in+commercial+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations.</a> Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).</li>
<li>Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+survey+on+the+use+and+welfare+of+zebrafish+Danio+rerio+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Biology%22%5BJournal%5D)">International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research.</a> Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).</li>
<li>Pitt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+tissue+distribution%2C+and+toxicity+of+polystyrene+nanoparticles+in+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).</li>
<li>Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9, 1608-1618 (2013).</li>
</ol>

Der Autor erklärt keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen.

Gemäß der Richtlinie über den Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, wie der EU-Richtlinie 2010/63/EU, ist die Tierethik-Genehmigung für ein Experiment mit frühen Lebensstadien von Zebrafischen erst in der Phase der unabhängigen Fütterung (5 Tage nach der Befruchtung)vorgeschrieben 17. Für die Optimierung der Verwendung von Zebrafischen ist jedoch eine bewährte Tierschutzpraxis wichtig, und beispielsweise sollten die humanen Methoden der Anästhesie und Der Euthanasie...

Seit der ersten Synthese in den 1900er Jahren werden Kunststoffe in verschiedenen Bereichen weit verbreitet, was zu einem schnellen Wachstum der globalen Produktionführt 1. Im Jahr 2018 wurden weltweit rund 360 Millionen Tonnen Kunststoffe produziert2. Die Kunststoffe in der natürlichen Umgebung werden durch chemische, physikalische oder biologische Prozesse zu feinen Partikeln abgebaut3. Im Allgemeinen sind feine Kunststoffpartikel <5 mm Größe als Mikroplastik4definiert. Mikroplastik ist auch für spezifische Anwendungen entwickelt, wie Mikroperlen aus kosmetischen Produkten5. Als nahezu permanente Schadstoffe häufen sich Mikroplastik in der Umwelt und haben immer mehr Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern, politischen Entscheidungsträgern und der Öffentlichkeiterregt 1,6. Frühere Studien dokumentiert, dass Mikroplastik Nebenwirkungen bei Fischen verursachen könnte, wie Magen-Darm-Schäden7, Neurotoxizität8, endokrine Störung9, oxidativer Stress10 und DNA-Schäden11. Die Toxizität von Mikroplastik wurde jedoch bisher nicht vollständig aufgedeckt12,13.
Zebrafisch-Embryonen bieten viele experimentelle Vorteile, darunter geringe Größe, externe Befruchtung, optische Transparenz und große Kupplungen, und gilt als idealer Modellorganismus für die In-vivo-Untersuchung der Auswirkungen von Schadstoffen auf Fische in frühen Lebensstadien. Darüber hinaus werden für die Bewertung biologischer Reaktionen nur begrenzte Mengen an Prüfsubstanzen benötigt. Hier bei Zebrafischembryonen werden 5 Tage lang unterschiedlichen Konzentrationen von Mikroplastik (0,1, 1, 10 mg/L) ausgesetzt, und die Bioakkumulation und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen/Larven wird evaluiert. Dieses Ergebnis wird unser Verständnis über die Toxizität von Mikroplastik für Fische fördern, und die hier beschriebene Methode kann potenziell verallgemeinert werden, um die Ansammlung und Verteilung anderer Arten von fluoreszierenden Materialien in den frühen Lebensphasen von Zebrafischen zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Grün fluoreszierend markierte Polystyrolkügelchen</td><td>Phosphorex, USA</td><td>2103A</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

akkumulation und verteilung von fluoreszierenden mikroplastik in den frühen lebensstadien von zebrafischen

Accumulation and Distribution of Fluorescent Microplastics in the Early Life Stages of Zebrafish

Als neue Art von Umweltschadstoffen ist Mikroplastik in der aquatischen Umwelt weit verbreitet und stellt eine hohe Bedrohung für Wasserorganismen dar. Die Bioakkumulation von Mikroplastik spielt eine Schlüsselrolle bei ihrer toxischen Wirkung; Als Feinstaub unterscheiden sich ihre Bioakkumulation jedoch von vielen anderen Schadstoffen. Hier wird eine praktikable Methode beschrieben, um die Ansammlung und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen oder Larven mit fluoreszierenden Mikroplastiken visuell zu bestimmen. Embryonen sind unterschiedlichen Konzentrationen (0,1, 1 und 10 mg/L) fluoreszierender Mikroplastike mit einem Durchmesser von 500 nm für 120 h ausgesetzt. In den Ergebnissen wird gezeigt, dass Mikroplastik in Zebrafischembryonen/-larven konzentrationsabhängig bioakkumulieren kann. Vor dem Schlüpfen findet sich eine starke Fluoreszenz um die embryonale Chorion; während in ZebrafischLarven, der Dottersack, Perikard, und Magen-Darm-Trakt sind die wichtigsten angesammelten Standorte von Mikroplastik. Die Ergebnisse zeigen die Aufnahme und Internalisierung von Mikroplastik in Zebrafischen in frühen Lebensstadien, was die Grundlage für ein besseres Verständnis der Auswirkungen von Mikroplastik auf Wassertiere bieten wird.

Die Verteilung und Akkumulation fluoreszierender Mikroplastikisten ist in Abbildung 1 und Tabelle 1dargestellt. In der nicht exponierten Gruppe (Kontrolle) wird keine sichtbare Fluoreszenz beobachtet. Nach der Exposition gegenüber unterschiedlichen Konzentrationen von Mikroplastik (24 hpf) findet sich jedoch eine Ansammlung von Fluoreszenz, die die Chorion umgibt. Grüne Fluoreszenz wird auch in Larven nachgewiesen, und die Fluoreszenzspiegel scheinen in einer konzentrations-...

Zebrafischembryonen/Larven entwickeln sich extern und sind optisch transparent. Die Bioakkumulation von Mikroplastik in Fischen im frühen Lebensstadium wird leicht mit fluoreszierend gekennzeichneten Mikroperlen beurteilt.

Akkumulation und Verteilung von fluoreszierenden Mikroplastik in den frühen Lebensstadien von Zebrafischen

As a new type of environmental pollutant, microplastic has been widely found in the aquatic environment and poses a high threat to aquatic organisms. The ...

Akkumulation und Verteilung von fluoreszierenden Mikroplastik in den frühen Lebensstadien von Zebrafischen. Einleitung. Die Bioakkumulation von Mikroplastik spielt eine Schlüsselrolle bei ihrer toxischen Wirkung. Als Feinstaub unterscheiden sich ihre Bioakkumulationen jedoch von vielen anderen Schadstoffen.Hier wird eine praktikable Methode beschrieben, um die Ansammlung und Verteilung von Mikroplastik in Zebrafischembryonen oder Larven mit fluoreszierenden Mikroplastiken visuell zu bestimmen. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem nationalen Leitfaden für Labortiere zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes durchgeführt. Eine, Embryo-Sammlung.Erwachsene Zebrafische stammen aus dem China Zebrafish Resource Center. Fische werden in 20-Liter-Glastanks mit umlaufendem, mit Holzkohle gefiltertem Leitungswassersystem bei konstanter Temperatur, nämlich 28 Grad Celsius, auf einer Photoperiode von 14 und 10 Stunden, hell: dunkel gehalten. Fische werden zweimal täglich mit Artemia nauplii gefüttert.Es wird empfohlen, dass das Essen mit einem Fischgewicht von maximal 3 % pro Tag verabreicht wird und jedes Mal innerhalb von fünf Minuten gegessen werden sollte. Gut entwickelte erwachsene Zebrafische werden in der Nacht vor der Zucht im Verhältnis von einem Männchen zu zwei Weibchen in den Laichbecken gebracht. Am nächsten Morgen beginnen die Fische nach dem Beginn des Lichtzyklus zu laichen.Die Eier werden mit einer Pasteurpipette gesammelt, mehrmals mit 10%Hanks Lösung gespült und dann mit einem Mikroskop auf Befruchtung überprüft. Befruchtete Eier durchlaufen die Spaltungszeit nach etwa zwei Stunden nach der Befruchtung und können eindeutig identifiziert werden. Die befruchteten Embryonen werden in einem 500-Milliliter-Becher mit 200-Milliliter 10%Hank-Lösung mit 1%Methylenblau zur Desinfektion bei 28 Grad Celsius inkubiert.Die Laderate beträgt nicht mehr als einen Embryo in jeder 2-Milliliter-Lösung. Zweitens, Herstellung von Mikroplastiksuspensionen. Die Stammlösung aus grünen fluoreszierend markierten Polystyrolperlen mit einem Nenndurchmesser von 500 Nanometern wird 10 Minuten lang beschallt.Verdünnen Sie die Lagerlösung mit 10%Hanks Lösung, um die gewünschten Belichtungslösungen zu produzieren, nämlich 0,1, 1 und 10 Milligramm pro Liter. Die Belichtungslösungen von Mikroplastik werden vor der Exposition immer frisch zubereitet. Drei Mikroplastik-Exposition.Sechs neu befruchtete Embryonen werden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und dann in jeden Brunnen von sechs Brunnenplatten mit fünf Milliliter mikroplastischen Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen übertragen. Die Kontrollgruppen, die die Lösung von 10% Hank enthalten, sind enthalten. Für jede Behandlung werden dreifache Brunnen mit insgesamt 18 Embryonen verwendet.Die Embryonen werden unter dem gleichen hell-dunklen Zyklus und der gleichen Temperatur wie Erwachsene inkubiert und alle 12 Stunden beobachtet. Die Toten werden sofort entfernt. Die Mikroplastiklösungen werden alle 24 Stunden zu 90% erneuert.Während der Expositionsphase werden die Fische nicht gefüttert. Im Allgemeinen beginnt das Schlüpfen des Embryos bei 48 Stunden nach der Befruchtung und endet bei etwa 72 Stunden nach der Befruchtung. Viertens, Bewertung der Mikroplastikverteilung.Bei der 24-48-72-96-und 120-stündigen Nachbefruchtung werden die Embryonen und Larven, jeweils einer aus den drei Repliken, nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit 10%Hanks Lösung ausgerinnt. Die Embryonen und Larven werden angeordnet und zur Beobachtung vorbereitet. Zuvor werden die Larven in eine Petrischale überführt und 0,016% Tricain zur Anästhesie ausgesetzt.Die Fische werden mit dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet und mit Bildgebungssoftware abgebildet. Die Fluoreszenzintensität bei Fischen wird mit ImageJ NIH weiter quantifiziert. Repräsentative Ergebnisse.In den Ergebnissen zeigt sich, dass Mikroplastik in Zebrafischembryonen und Larven konzentrationsabhängig bioakkumuliert werden kann. Vor dem Schlüpfen findet sich eine starke Fluoreszenz um die embryonale Chorion; während bei Zebrafischlarven der Dottersack, das Perikard und der Magen-Darm-Trakt die hauptakkumulierten Stellen von Mikroplastik sind. Diskussion. Dieses Ergebnis wird unser Verständnis über die Toxizität von Mikroplastik für Fische fördern, und die hier beschriebene Methode kann potenziell verallgemeinert werden, um die Ansammlung und Verteilung anderer Arten von fluoreszierenden Materialien in den frühen Lebensphasen von Zebrafischen zu bestimmen.Da die Chorion als wirksame Barriere gegen die Partikel mit großer Größe wirkt, kann der Dechorionierungsprozess vor der Exposition erforderlich sein. Jedoch, der Embryo mit Chorion intakt wird eher empfohlen, um die Ökotoxizität von Schadstoffen zu bewerten, wenn der Zustand der Exposition in der realen Welt zu bewerten. Das Verhalten von Mikroplastik in der Lösung ist auch für die Bioverfügbarkeit entscheidend.Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Mikroplastik sollten über die Expositionsdauer nachverfolgt werden.

accumulation-distribution-fluorescent-microplastics-early-life-stages

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Wir stellen eine neuartige Methode zur Mikroschlundsondierung von Zebrafischlarven unter Verwendung standardmäßiger Mikroinjektions- und Stereomikroskopieausrüstung für Embryonen vor. Wir zeigen, dass die Mikroschlundsondierung eine sichere und effiziente Technik ist, die dazu dient, kontrollierte Mengen unterschiedlichster Substanzen gezielt in das intestinale Lumen von Zebrafischlarven abzugeben.

Microgavage der Zebrafischlarven

Quelle: Zhang, X., et al. Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung von Zebrafischembryonen, die mit Staphylococcus aureus injiziert wurden, was eine Quantifizierung des Infektionsverlaufs und der bakteriellen Verteilung ermöglicht, um den Einfluss von Biomaterial-Mikrosphären auf Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo zu bewerten.

 Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Der Zebrafisch ist ein beliebtes Tool zur chronischen Nierenerkrankung (CKD) zu modellieren. Allerdings macht ihre geringe Größe es unmöglich, die Nierenfunktion zu bewerten mit traditionellen Methoden. Wir beschreiben einen Fluoreszenzfarbstoff Nieren-Clearance-Test 1, die quantitative Analyse von Zebrafisch Nierenfunktion bei CKD ermöglicht.

Bewertung der Zebrafisch Nierenfunktion unter Verwendung einer fluoreszierenden Räumungs Assay

Der Zebrafisch ist ein hervorragendes Modellsystem für genetische und Entwicklungsstudien. Die Bead-Implantation ist eine wertvolle Gewebemanipulationstechnik, die verwendet werden kann, um Entwicklungsmechanismen zu untersuchen, indem Veränderungen in der lokalen zellulären Umgebung eingeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Implantation von Mikrokügelchen im Zebrafischembryo durchgeführt wird.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

Zebrafische entwickeln sich zu einem wertvollen Modell für die Verarbeitung von Nahrungslipiden und Stoffwechselkrankheiten. Beschrieben werden Protokolle von lipidreichem Larvenfutter, Live-Imaging von fluoreszierenden Lipidanaloga in der Nahrung und die Quantifizierung der Nahrungsaufnahme. Diese Techniken können auf eine Vielzahl von Screening-, Bildgebungs- und hypothesengesteuerten Untersuchungstechniken angewendet werden.

High-fat Feeding Paradigm für Larval Zebrabärbling: Füttern, Live-Imaging und Quantifizierung der Nahrungsaufnahme

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Transitzeit von eindringmittel beschrifteten Nahrung durch den Darm Larven Zebrafisch auf hohen Durchsatz Weise messen.

Hochdurchsatz-Messung der Darm Transitzeit mit Larven Zebrafisch

Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Verwendung von Zebrafischembryonen Tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis von östrogene Wirkungen. Das Protokoll behandelt die Vermehrung der Fische und die Behandlung von Embryonen und betont den Nachweis, die Dokumentation und die Bewertung von fluoreszierenden Signalen, die durch endokrine Störverbindungen (EDC) induziert werden.

Verwenden von Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafisch-Embryonen, um die östrogene Wirkung von endokrinen störenden Verbindungen zu testen

Ein detailliertes experimentelles Protokoll wird in diesem Beitrag zur Bewertung der neurobehavioralen Toxizität von Umweltschadstoffen unter Verwendung eines Zebrafischlarvenmodells vorgestellt, einschließlich des Expositionsprozesses und Tests für neurobehaviorale Indikatoren.

Untersuchung neurobehavioraler Auswirkungen von Umweltschadstoffen auf Zebrafischlarven

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Dieses Protokoll beschreibt ein Wirkstoffscreening-Verfahren bei Zebrafischlarven 3-7 Tage nach der Befruchtung, gefolgt von einer morphologischen Beurteilung.

Screening kleiner Moleküle und Toxizitätstests an Zebrafischlarven im Frühstadium

Erfahren Sie eine Methode zur visuellen Quantifizierung der Bioakkumulation von Mikroplastik in Zebrafisch-Embryonen und -Larven. Dieses Protokoll nutzt fluoreszierende Polystyrol-Partikel und Fluoreszenzmikroskopie.

Akkumulation und Verteilung von fluoreszierenden Mikroplastik in den frühen Lebensstadien von Zebrafischen

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