Färbung, Visualisierung und Analyse von Fungiform-, Circumvallate- und Gaumengeschmacksknospen
11. Februar 2021
Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Gewebevorbereitung, Färbung und Analyse von ganzen Fungiform-, Zirkumvallat- und Gaumengeschmacksknospen, die konsistent ganze und intakte Geschmacksknospen (einschließlich der Nervenfasern, die sie innervieren) ergeben und die Beziehungen zwischen Strukturen innerhalb der Geschmacksknospen und der umgebenden Papille aufrechterhalten.
Dieser umfassende Dissektions- und Analyse-Workflow bietet einen neuartigen Ansatz zur Analyse der vollständigen Morphologie einzelner Geschmacksnervenlauben, der Transduktion von Zelltypzahlen und der physischen Beziehungen zwischen Zellen. Das Sammeln des gesamten Lingualepithels ermöglicht es uns, die absolute Anzahl der Zellen und das Volumen der Innervation innerhalb der gesamten Geschmacksknospe zu messen. Dieser Ansatz ist genauer als Schätzungen der Zellstruktur auf der Grundlage von Stichproben aus Abschnitten, was die technische Variabilität verringert.
Dies ist auch die erste Methode, die eine detaillierte Analyse der Geschmacksknospenzellen in Bezug auf ihre Innervation ermöglicht. Diese Methode kann untersuchungen der potenziellen Schaltkreise in der Geschmacksknospe sowie Krankheitsprozesse und Chemotherapien, die die normale Geschmacksfunktion stören, verbessern. In den meisten dieser Fälle ist unklar, welche Struktur oder Beziehung gestört ist, so dass die Aufrechterhaltung all dieser Faktoren alle Analysen innerhalb eines einzigen Präparats ermöglicht.
Der häufigste Fehler ist der Versuch, eine Schädigung des Epithels zu vermeiden, indem man nicht nahe genug an der Unterseite des Epithels seziert. Es ist unerlässlich, so viel darunter liegendes Gewebe wie möglich zu entfernen, bevor das Gewebe in der Gewebeform eingefroren wird. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass das Epithel flach im Boden der Gewebeform liegt.
Beginnen Sie mit dem Auftauen und Spülen der Zunge in 0,1 molarem Phosphatpuffer. Legen Sie dann 1/2 der vorderen Zunge, die die fungiformen Papillen enthält, unter einem Seziermikroskop auf einen Glasobjektträger. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette und eine Dissektionsschere, um den Muskel zu entfernen und das Gewebe offen zu halten, während das Lingualepithel gekrümmt ist, um eine flache Ausrichtung des Gewebes zu gewährleisten, indem Sie die Klingen der groben Dissektionsschere parallel zum Epithel halten.
Verwerfen Sie das ventrale nicht keratinisierte Epithel der Zunge, da es keine Geschmacksknospen enthält. Verwenden Sie dann eine feine Dissektionsschere für eine engere Dissektion an der Unterseite des keratinisierten Epithels. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein Stück Epithel in eine Gewebeform zu legen und sicherzustellen, dass es flach liegt.
Fügen Sie dann dem Gewebe einen Tropfen optimaler Schnitttemperaturverbindung oder OCT hinzu. Legen Sie die Gewebeform auf eine zuvor gekühlte Metallbasis unter dem Sezierfernrohr und klopfen Sie dann mit der Pinzette leicht auf das Gewebe, bis das OCT eingefroren ist, um sicherzustellen, dass das Gewebe so flach wie möglich gefriert. Sobald das OCT gefroren ist, fügen Sie schnell zusätzliches OCT hinzu und legen Sie die Form in ein Becherglas aus abgekühltem 2-Methylbutan, bis es eingefroren ist.
Montieren Sie die OCT-Form auf dem Kryostaten und schneiden Sie sie in 20-Mikron-Abschnitte. Sammeln Sie jeden Abschnitt und betrachten Sie ihn unter dem Lichtmikroskop, um seine Nähe zur Basis des Epithels zu beurteilen. Nachdem das Gewebe von der Unterseite des Epithels rasiert wurde, tauen Sie das Epithel auf und spülen Sie es zweimal in 0,1 molarem PB auf einem Shaker aus.
Schneiden Sie den harten Gaumen anterior bis zur Verbindung des weichen und harten Gaumens, trennen Sie dann den weichen Gaumen vom darunter liegenden Gewebe, stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Knochenfragmente weggeschnitten werden und entfernen Sie zusätzliche Muskel- und Bindegewebe. Halten Sie den Gaumen mit stumpfer Pinzette und entfernen Sie die restlichen Drüsen und verlieren Sie Bindegewebe, indem Sie sie vorsichtig mit einer Rasierklinge abkratzen. Ganze Geschmacksknospen und alle Geschmacksknospeninnervationen bei Phox2b-Cre TdTomato-Mäusen wurden durch Färbung des Lingualepithels mit Antikörpern für DsRed und Keratin acht markiert.
Das Geschmacksknospenvolumen wurde gemessen und ergab keine Korrelationen zwischen Geschmacksknospenvolumina und Innervationsvolumina in den Fungiform- oder Zirkumvallat-Messregionen. Die Verabreichung einer niedrigen Dosis Tamoxifen in TrkB CreER TdTomato-Mäusen verursacht eine Genrekombination und die Markierung einer kleinen Anzahl von Neuronen. Eine ganze Geschmacksknospe, die mit geschmackstransduzierenden Zellmarkern Carboanhydrase vier und Phospholipase C beta zwei gefärbt ist, ist hier gezeigt.
Diese Geschmacksknospe hat zwei markierte Terminallauben, die gezeigt werden, wenn die Geschmacksknospe nach der Rekonstruktion der Fasern entfernt wurde. Die Verwendung von zellpixelbasierter Bildgebungssoftware zur Bestimmung der engsten Nähe zwischen Nervenfasern und geschmackstransuzierenden Zellen ergab, dass von 19 geschmackstransduzierenden Zellen der blaue terminale Dorn innerhalb von 200 Nanometern der hellblauen Carboanhydrase vier plus Zelle lag. Der terminale Dorn, der mit der grünen Spur verbunden ist, ist in Magenta dargestellt und befindet sich innerhalb von 200 Nanometern sowohl von der hell- als auch von der dunkelblauen Carboanhydrase vier plus Zellen.
Die Färbung von Fungiform-Geschmacksknospen mit Keratin eight und 5-Ethynyl-2'deoxyuridin oder EdU zeigte, dass EdU-markierte Zellen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Geschmacksknospen vorhanden waren. Die magentafarbenen und violetten Kerne werden außerhalb der Keratingrenze plus Grenze der Geschmacksknospe beobachtet. Die gelben, türkisfarbenen und blauen Zellen befanden sich in der Geschmacksknospe.
Beim Versuch dieses Protokolls sind die Schritte zur Gewebedissektion und zum Einfrieren von entscheidender Bedeutung. Diesen Gewebedissektionsmethoden kann eine Färbung für eine Vielzahl von Zellen und Strukturen folgen, um die Beziehungen sowohl innerhalb der Geschmacksknospe als auch außerhalb der Geschmacksknospe, aber innerhalb der Papille zu analysieren. Dies ist die erste Analyse ganzer Geschmackslauben innerhalb der Geschmacksknospe sowie ihrer Beziehungen zu geschmackstransuzierenden Zellen.
Die Konservierung und Färbung für mehrere dieser Elemente in einem einzigen Präparat erweitert sowohl die Möglichkeiten der Analyse als auch verfeinert die möglichen Messungen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Methode zur Ganzpräparat-Dissektion und Analyse von Geschmacksknospen vor, insbesondere von pilzförmigen, wallförmigen und Gaumengeschmacksknospen, wobei deren Strukturen und Innervationen erhalten bleiben. Die Technik ermöglicht präzise Messungen der Zellanzahlen und Innervationsvolumina und verbessert so das Verständnis der Schaltkreise der Geschmacksknospen sowie der Auswirkungen von Krankheiten auf die Geschmacksfunktion.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Systembiologie
Hintergrund
- Die Analyse ganzer Geschmacksknospen liefert Einblicke in ihre Morphologie und funktionelle Verschaltung.
- Bestehende Methoden leiden häufig unter hoher Variabilität aufgrund der Probenahme.
- Das Verständnis der Geschmacksfunktion ist entscheidend für die Forschung zu Geschmacksstörungen.
- Diese Studie zielt darauf ab, die vollständige Struktur der Geschmacksknospen in Bezug auf ihre Innervation zu definieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Dissektion und Analyse intakter Geschmacksknospen.
- Untersuchung der Beziehungen zwischen Geschmacksknospenzellen und ihren versorgenden Nervenfasern.
- Aufzeigen der Bedeutung dieser Forschung für das Verständnis der Schaltkreise, die an der Geschmackswahrnehmung beteiligt sind.
Verwendete Methoden
- Diese Studie verwendet eine Ganzpräparat-Dissektionstechnik für Geschmacksknospen aus der Zunge.
- Das biologische Modell umfasst Geschmacksknospen von Phox2b-Cre TdTomato- und TrkB CreER TdTomato-Mäusen.
- In dieser Studie kamen keine Multiomics-Workflows zum Einsatz.
- Kritische Schritte beinhalten eine sorgfältige Dissektion und die richtige Einfrierung des Gewebes.
- Anschließend wurden die Proben mithilfe von Färbetechniken analysiert, um verschiedene Zelltypen sichtbar zu machen.
Hauptergebnisse
- Die Technik bewahrte die Geschmacksknospen erfolgreich intakt und färbte sie an, wodurch ihre zelluläre Architektur sichtbar wurde.
- Die Messungen zeigten keine Korrelationen zwischen den Volumina der Geschmacksknospen und den Volumina der Innervation.
- Bildgebungen auf Basis von Zellpixeln zeigten eine räumliche Nähe zwischen Nervenfasern und geschmackstransduzierenden Zellen.
- Die EdU-Markierung wies auf Zellproliferation innerhalb und außerhalb der Grenze der Geschmacksknospe hin.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt ein innovatives Protokoll zur Analyse von Geschmacksknospen vor, das zukünftige Forschungsarbeiten unterstützen kann.
- Obwohl keine Multiomik-Analyse durchgeführt wurde, tragen die Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der Funktion von Geschmacksknospen bei.
- Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung zellulärer Beziehungen, was für die Erforschung von Geschmacksstörungen von großem Wert ist.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels Ganzpräparat-Analyse von Geschmacksknospen ist eine präzise Quantifizierung zellulärer und innervatorischer Parameter möglich, wodurch die technische Variabilität, die bei schnittbasierten Ansätzen inhärent ist, verringert wird. Diese Methode unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung in der Neurowissenschaft und sensorischen Biologie, indem sie die räumlichen Beziehungen zwischen transduzierenden Zellen und Nervenfasern erhält. Sie bietet eine reproduzierbare Plattform zur Beurteilung der chemosensorischen Funktion in Krankheitsmodellen und Studien zu therapeutischen Interventionen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Geschmackstransduktionswegen durch absolute Zellzählung und räumliche Abbildung von Nervenendigungen.
- Operativer Wert: Verringert Bias und Variabilität, indem die intakte Geschmacksknospenarchitektur für eine reproduzierbare Analyse erhalten bleibt.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Zielkonfidenz, indem molekulare Marker in situ mit funktionellen Innervationsmustern verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Ergebnisse wie Geschmacksknospen-Volumen, Innervationsvolumen und Zellzahlen der sensorischen Zellen zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Ermöglicht hochpräzise Bildgebungsabläufe, die mit multiplex Färbungen und automatisierter Bildanalyse kompatibel sind.
- Assay-Eignung: Bietet ein skalierbares System zur Untersuchung von Substanzen, die die Integrität der Geschmacksknospen oder die neuronale Vernetzung beeinflussen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Analyse von krankheits- oder therapiebedingten Störungen in der Beziehung zwischen Geschmacksknospen und Nerven unter Verwendung genetisch markierter Modelle.
- Operativer Wert: Unterstützt Längsschnittstudien, indem wiederholte Färbungen und Abbildungen von Ganzpräparaten aus demselben Gewebe ermöglicht werden.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung, indem die native Gewebearchitektur erhalten bleibt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe, indem sie die Überprüfung von Hypothesen zu Mechanismen der Geschmackswahrnehmung und neuronaler Vernetzung ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die funktionelle Validierung von geschmackstransduzierenden Zelltypen durch räumliche Ko-Lokalisationsanalyse.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte, die für das Screening von Substanzen in der Chemosensorikforschung unerlässlich sind.
- Analytik: Setzt zellbasierte Bildgebung ein, um subzelluläre Abstände zwischen Nervenfasern und Geschmacksrezeptoren zu messen und datengestützte Vergleiche zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Erhält die strukturelle Integrität zur Untersuchung von Geschmacksstörungen in Modellen von Chemotherapie, Alterung oder genetischen Erkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein standardisiertes Protokoll zur Gewebepräparation, das auf mehrere Geschmacksregionen und Mausmodelle anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Stichprobenartefakte eliminiert und eine direkte Beobachtung der Wechselwirkungen zwischen Zellen und Nerven ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Dissektions-, Einfrier- und Färbeprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen in der Entwicklung sensorischer Wirkstoffe, indem mechanistische Einblicke in die Zielstrukturen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Auswirkungen auf die Struktur der Geschmacksknospen und deren Innervation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischer Dissektion und Gewebemanipulation, um die Integrität des Epithels zu bewahren.
- Hängt von der Schnittführung am Kryostaten und der Infrastruktur für die Einbettung in OCT-Material ab, um eine korrekte Gewebeorientierung und -einfrierung zu gewährleisten.
- Setzt eine Standardisierung zwischen den Teams voraus, um konsistente Protokolle für das Aufbringen und Färben von Geweben sicherzustellen.
- Muss die Variabilität der Geschmacksknospendichte und -größe in den Bereichen der Pilz-, Blätter- und Gaumengeschmacksknospen berücksichtigen.
- Ist durch den Bedarf an spezialisierten Bildgebungs- und Analysetools begrenzt, um Nervenarborisierungen zu rekonstruieren und die subzelluläre Nähe zu quantifizieren.
