Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Diese Technik ist eine Anpassung der üblicherweise verwendeten Methoden zur Untersuchung der Monoaminfreisetzung, die die Messung der endogenen Freisetzung anstelle von vorgeladenen radioaktiv markierten Monoaminen unter mehreren pharmakologischen Bedingungen gleichzeitig ermöglicht. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie ziemlich kostengünstig ist, mehrere pharmakologische Zustände gleichzeitig untersucht werden können und wir die endogene Monoaminfreisetzung mit der Fähigkeit untersuchen können, zwischen vesikulärer und transportervermittelter Freisetzung zu unterscheiden. Um Gehirnschnitte von erwachsenen männlichen Ratten mit einer Größe von 250 bis 350 Gramm nach der Ernte vorzubereiten, legen Sie sofort den Gehirn- und eiskalten sauerstoffhaltigen Dissektionspuffer und erwerben Sie 300 Mikrometer koronale Gehirnabschnitte aus jeder Region von Interesse.

Für die weitere Sezierung der Gehirnschnitte bewegen Sie die Gewebe vorsichtig auf Glasobjektträger und verwenden Sie einen Rattenhirnatlas, um das dorsale Striatum anhand seiner dunkel gestreiften Struktur zu identifizieren und den Hippocampus anhand seiner Nähe zum Kortex und seiner einzigartigen Spiralstruktur zu identifizieren. Trennen Sie die rechte und linke Hemisphäre für ihre Verwendung als Kontroll- und Versuchsscheiben. Das dorsale Striatum kann weiter in zwei Millimeter große Stempel zerlegt werden.

Verwenden Sie dann eine Kunststoff-Transferpipette mit einer modifizierten Spitze, um die Proben in kleine Behälter zu überführen, die in sauerstoffhaltigen eiskalten Dissektionspuffer mit sauerstoffsprudelndem Sauerstoff eingetaucht sind. Um die Monoaminfreisetzung zu induzieren, übertragen Sie die Gewebeproben in jede Vertiefung einer speziell angefertigten 48-Well-Efflux-Kammer mit 0,5 bis einem Milliliter Effluxpuffer pro Vertiefung mit konstantem sanftem Blubbern und lassen Sie die Proben für 30 bis 50 Minuten bei 37 Grad Celsius zurückgewinnen. Am Ende der Gleichgewichtsperiode bewegen Sie den Gewebehalter mit Hirngewebe zu Vertiefungen, die 500 Mikroliter sauerstoffhaltigen Effluxpuffer mit oder ohne pharmakologisches Mittel enthalten, und klopfen Sie auf den Halter am Rand des Bohrlochs, um die minimale Übertragung des Puffers zwischen den Vertiefungen für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius zu verhindern.

Am Ende der Inkubation wird der Halter in einen neuen Satz von Vertiefungen mit 500 Mikrolitern Effluxpuffer mit oder ohne das interessierende Arzneimittel gebracht und die Platte für weitere 20 Minuten in den Zellkulturinkubator zurückgeführt. Während der zweiten Inkubation die Lösung aus den Vertiefungen der ersten Inkubation in Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern einer normalen Perchlor- oder Phosphorsäure auf Eis übertragen und die Röhrchen als Nummer eins markieren"Am Ende der zweiten Inkubation bewegen Sie den Gewebehalter zu leeren Vertiefungen mit der Platte auf Eis und übertragen Sie die Überstände aus der zweiten Inkubation auf neue Mikrozentrifugenröhrchen, die 50 Mikroliter eines normalen Perchlor- oder Phosphorsäure enthalten Säure auf Eis. Wenn alle Überstände übertragen wurden, fügen Sie jedem Gewebetopf einen Milliliter eiskalten Dissektionspuffer hinzu und verwenden Sie eine kleine Pinzette, um jede Gewebeprobe in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen.

Entfernen Sie den Puffer aus den Probenröhrchen und lagern Sie das Gewebe bei minus 80 Grad Celsius, dann übertragen Sie die gesammelten Inkubationslösungen zur Zentrifugation in Mikrozentrifugenfilterröhrchen und legen Sie das Filtrat bis zur HPLC-Analyse auf Eis. Stellen Sie das Potenzial des ECD und die Durchflussrate gemäß der Empfehlung des Herstellers für den Nachweis von Monoaminen ein. Laden und geeignetes Aliquot jeder Probe, einschließlich Neurotransmitter-Standards, in die HPLC für die automatische Injektion und Detektion und ermöglichen Sie es dem Gerät, die Analyse abzuschließen.

Verwenden Sie dann die HPLC-Analysesoftware, um die Chromatographendaten unter Verwendung einer Standardkurve, die aus jedem Monoamin besteht, zu erfassen und zu analysieren, um die Fläche unter der Kurve basierend auf den Richtlinien des Herstellers zu erhalten. Nach sechs Stunden Funktionsanalyse bleiben Gewebeproben lebensfähig, während Proben, die mit 1% Triton X-100 inkubiert wurden, eine signifikante Verringerung der MTT-Transformation zeigen. Eine akute 20-minütige Behandlung von Hippocampus- und präfrontalen Kortex-Hirnschnitten mit Amphetamin induziert einen signifikanten Anstieg des extrazellulären Spiegels jedes Monoamins.

Wenn die Proben mit Fluoxetin, einem selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer, vorbehandelt werden, tritt der amphetamininduzierte Anstieg des extrazellulären Serotonins im Hippocampus und im präfrontalen Kortex nicht auf, während der Anstieg der extrazellulären Dopamin- und Noradrenalinproduktion nicht beeinflusst wird. Darüber hinaus induziert eine akute 20-minütige Behandlung von dorsalen Striatumschlägen mit Amphetamin eine 35-fache Erhöhung der extrazellulären Dopaminspiegelexpression, während die dorsale Striatum-Punschbehandlung mit Kokain, einem Monoamintransporterblocker, zu einer signifikanten Hemmung des amphetamininduzierten extrazellulären Dopamins führt. Die Erhöhung der Konzentration von extrazellulärem Kaliumchlorid, um eine Membrandepolarisation hervorzurufen, reicht aus, um die exozytotische Freisetzung von Monoaminen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollbedingungen zu induzieren, und weder Fluoxetin noch Kokain die Behandlung blockieren diesen tiefen polarisationsinduzierten Anstieg.

Es ist unerlässlich, saubere Schnittabschnitte zu haben, eine präzise Lokalisierung der Stempel zu haben und während des gesamten Experiments eine konsistente Sauerstoffversorgung aufrechtzuerhalten. Die Gehirnschnitte können nach dem Experimentieren für weitere biochemische Verarbeitung und Analyse wie Western Blotting und Histologie verwendet werden.