Name: Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Rattenmodells der EcoHIV-Gehirninfektion für NeuroHIV-Forschung. Diese Methode ermöglicht Studien zu HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und synaptischen Veränderungen.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt (Bundesversicherungsnummer: D16-00028). Sechs erwachsene männliche F344/ N-Ratten wurden in einer kontrollierten Umgebung unter einem 12/12 Light: Dark-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tiere wurden nach Richtlinien gepflegt, die von den National Institutes of Health im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren festgelegt wurden.
1. Virusverpackung in 293 FT-Zellen
<ol><li>Die 293 FT-Zellen (5×105/ml) werden in gelatinebeschichteten 75 cm2 Kolben mit DMEM plus 10% FBS11 kultiviert. Züchten Sie Zellen bei 37 °C, um bei der Transfektion zu 50% konfluent zu sein.</li>
	<li>22,5 μL Transfektionsreagenz (z. B. Lipofectamin 3000) in 750 μL Medium (z. B. Opti-MEM) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Wirbel für 3 s verdünnen.</li>
	<li>20 μg EcoHIV-Plasmid-DNA in 750 μL Medium in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen und gut mischen.</li>
	<li>Verdünnte DNA in die Tube des verdünnten Transfektionsreagenzes geben und vorsichtig mischen. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Die Mischung wird in 10 ml vorgewärmtes DMEM-Medium in 75 cm2 Kolben geben. Inkubieren Sie die Zellen für 2 Tage bei 37 °C.</li>
	<li>Ernten und kombinieren Sie 24 ml konditioniertes Medium aus den beiden Kolben, die das verpackte Lentivirus enthalten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie alle 24 ml Konditionalmedium bei 500 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Den geklärten Überstand in ein steriles 50 ml Röhrchen geben.</li>
	<li>Kombinieren Sie 8 ml Lenti-x-Konzentrator mit 24 ml geklärten Überstand (Verhältnis 1:3). Mischen Sie durch sanfte Inversion. Mischung bei 4 °C für zwei Tage inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugenmischung bei 1.500 x g für 45 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 100 μL 100 mM PBS.</li>
	<li>Titerviruskonzentration mit einem p24 ELISA-Kit.</li>
</ol>2. EcoHIV-EGFP Virus stereotaxische Operationen
<ol><li>Anästhesieren Sie Ratten mit 3% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haare aus der Gehirnregion und sterilisieren Sie die Haut zweimal mit 70% Ethanol und einem Peeling auf Chlorhexidinbasis. Sichern Sie die Ratte in Bauchlage im stereotaxischen Apparat.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt (5-6 cm) durch die Haut entlang der Kopfhautmittellinie.</li>
	<li>Markieren Sie zwei Bohrpositionen bei 0,8 mm seitlich, 1,2 mm rostral bis bregma. Bohren Sie in jede Schädelposition ein Loch (Durchmesser 0,4 mm).</li>
	<li>Füllen Sie titerierte EcoHIV-Lentiviruslösung (1,04 × 106 TU/ml) in eine 10 μL Injektionsspritze. Befestigen Sie die Spritze am stereotaktischen Gerät.</li>
	<li>Bewegen Sie die Nadel nahe an die Oberfläche des Bohrlochs. Messen und bewegen Sie 2,5 mm in der Tiefe.</li>
	<li>1 μL Viruslösung mit einer Rate von 0,2 μL/min infundieren. Halten Sie die Nadel 5 Minuten lang im Injektionsbereich. Bewegen Sie die Nadel langsam nach oben, bis sie sich außerhalb des Rattenschädels befindet.</li>
	<li>Nähen Sie die Haut mit einem 4-0 Seidenfaden.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Schnitt einmal mit 70% Ethanol. Subkutane Injektion von Butorphenol (Dorolex, 0,1 mg/kg Körpergewicht).</li>
	<li>Die Ratte mit einem Heizkissen in eine Aufwachkammer bringen, bis sie aufwacht.</li>
</ol>3. Visualisierung von Hirnschnitten
HINWEIS: Warten Sie ein bis acht Wochen nach der EcoHIV-Virusinfusion.
<ol><li>Betäuben Sie die Ratte mit 5% Sevofluran. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort, wenn die Ratten nicht auf schädliche Reize reagieren und Reflexe fehlen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Ratte in Rückenlage in einem Abzug.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Schneiden Sie das Zwerchfell ab und öffnen Sie die Brusthöhle.</li>
	<li>Führen Sie eine 20 G × 25 mm Nadel in den linken Ventrikel ein.</li>
	<li>Öffnen Sie sofort das rechte Atrium mit einer Schere.</li>
	<li>50 ml vorgefertigtes 100 mM PBS mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perperieren.</li>
	<li>100 ml kaltes 4% Paraformaldehyd mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/min perfundieren.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Ratte, öffnen Sie die Kopfhaut und entfernen Sie das Gehirn.</li>
	<li>Postfix über Nacht mit 4% Paraformaldehyd.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gehirn auf 40 ml 30% Saccharose in 100 mM PBS in 50 ml Röhrchen, bis das Gehirn nach unten schwebt (ca. 3 Tage).</li>
	<li>Schnappen Sie das Gehirn in Methylbutanol für 2 min bei - 80 °C ein.</li>
	<li>Sichern Sie das Hirngewebe auf einer Metallplattform in einem -20 °C Kryostaten.</li>
	<li>Schneiden Sie 50 μm dicke koronale Abschnitte mit dem Kryostaten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem feinen Pinsel auf Glasobjektträger.</li>
	<li>Montageabschnitte in 0,3 mL Antifademedium und Abdeckung mit 22 mm 50 mm Deckrippen.</li>
	<li>Halten Sie die Glasobjektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur, bis sie trocken sind.</li>
	<li>Stellen Sie die anvisierten Neuronen mit einem konfokalen Mikroskop mit Z-Stack ab, der auf den Grenzen der Hirnregion und den morphologischen Merkmalen der Neuronen basiert. HINWEIS: Die verwendeten konfokalen Mikroskopeinstellungen waren: Vergrößerung von 60 X (A/1,4, Öl) und ein Z-Ebenenintervall von 0,15 μm (Lochgröße 30 μm; rückprojektierter Lochradius 167 nm) mit einer Wellenlänge von 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

In diesem Protokoll haben wir ein EcoHIV-induziertes HIV-Infektionsmodell bei Ratten etabliert. Insbesondere beschrieben wir eine bilaterale stereotaktische Injektion von EcoHIV in den Kortex, die 7 Tage nach der Injektion erfolgreich eine aktive HIV-Infektion im Rattengehirn induzierte. Darüber hinaus zeigen wir, dass ecoHIV-Infektionen bei Ratten ein gutes biologisches System sein könnten, um Schlüsselaspekte von HAND zu untersuchen. Acht Wochen nach der EcoHIV-Infektion zeigten Ratten signifikante neurokognitive Beein...

Biologische Systeme haben unser Verständnis von HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) und ihren zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen verbessert2. Die Bestimmung, welches biologische System für eine bestimmte Studie am besten geeignet ist, hängt oft von der Frage des Interesses ab2. Die Begrenzung der Bandbreite der Wirtstiermodelle stellt Studien zur Entwicklung der HIV-1-Krankheit in Den mittelpunkt. Um die HIV-1-Virusreplikation und Pathogenese zu untersuchen, erstellten Potash et al.3 ein Mausmodell der aktiven HIV-1-Infektion, das die kodierende Region des HIV-Oberflächenhüllenglykoproteins gp120 durch ökotropes MLV gp80 ersetzte, was zu einer erfolgreichen Virusreplikation bei Mäusen führte4. Nach Injektionen von Schwanzvenen bei chimären HIV-Mäusen (EcoHIV) wurden viele Merkmale beobachtet, die denen von HIV-1-seropositiven Personen ähneln (z. B. infizierte Lymphozyten und Makrophagen, die auf antivirale Immunantworten abzielen, und Entzündungen3,5,6).
Obwohl Mäuse und Ratten beide Mitglieder der Muridae sind, können grundlegende Artenunterschiede ihre Eignung für spezifische experimentelle Fragen beeinflussen7. Daher wäre die Ausweitung des EcoHIV-Infektionsmodells auf Ratten (häufig in Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen verwendet) bei der Untersuchung von neuroHIV von Vorteil. Zum Beispiel macht ihre größere Größe die Implantation von Jugularkathetern für Selbstverabreichungsverfahren von Medikamenten praktischer8. Techniken der Selbstverabreichung von Medikamenten bei Ratten wurden verwendet, um die Motivation bei HIV-19zu bewerten. Darüber hinaus wurden viele neurokognitive / verhaltende Aufgaben ursprünglich für Ratten entwickelt10. Hier berichten wir über die Verwendung stereotaktischer Injektionen von EcoHIV bei Ratten, um das EcoHIV-Infektionsmodell zu erweitern und eine wichtige Gelegenheit zu bieten, neue Fragen im Zusammenhang mit neuroHIV und HAND zu beantworten.

<table><tbody><tr><td>293FT Zellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotische Lösung</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75cm&sup2; Rechteckige Zellkulturflasche mit schrägem Hals und belüfteter Kappe</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM mit L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose und Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus antibakteriell, 4-0 Polyglactin 910 Naht, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Irispinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus-assoziiertes p24-ELISA-Kit</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Konzentrator</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevofluran</td><td>Merritt Veterinärbedarf</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>stereotaktische Geräte</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modell 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

ein rattenmodell der ecohiv-gehirninfektion

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Es wurde gut untersucht, dass das EcoHIV-infizierte Mausmodell bei der Untersuchung von HIV-assoziierten neurologischen Komplikationen von erheblichem Nutzen ist. Die Etablierung des EcoHIV-infizierten Rattenmodells für Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen wäre bei der Untersuchung von neuroHIV- und HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen (HAND) von Vorteil. In der vorliegenden Studie demonstrieren wir die erfolgreiche Erstellung eines Rattenmodells der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV). Zunächst wurde das lentivirale Konstrukt von EcoHIV 48 Stunden lang in kultivierten 293 FT-Zellen verpackt. Dann wurde das bedingte Medium konzentriert und titeriert. Als nächstes führten wir bilaterale stereotaktische Injektionen des EcoHIV-EGFP in F344/ N Rattenhirngewebe durch. Eine Woche nach der Infektion wurden EGFP-Fluoreszenzsignale im infizierten Hirngewebe nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass EcoHIV bei Ratten erfolgreich eine aktive HIV-Infektion induziert. Zusätzlich wurde eine Immunfärbung für den mikroglialen Zellmarker Iba1 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp waren, der EcoHIV beherbergte. Darüber hinaus zeigten EcoHIV-Ratten Veränderungen in der zeitlichen Verarbeitung, einen möglicherweise zugrunde liegenden neurobehavioralen Mechanismus von HAND sowie synaptische Dysfunktion acht Wochen nach der Infektion. Insgesamt erweitert die vorliegende Studie das EcoHIV-Modell der HIV-1-Infektion auf die Ratte und bietet ein wertvolles biologisches System, um HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn sowie HAND und damit verbundene Komorbiditäten wie Drogenmissbrauch zu untersuchen.

Das konditionierte Medium wurde aus Lentivirus von EcoHIV-EGFP-infizierten 293FT-Zellen entnommen. Als nächstes wurde es konzentriert und titeriert, dann stereotrisch in das Gehirn (kortikale Region) von F344 / N-Ratten injiziert. Sieben Tage nach der Injektion wurden Ratten geopfert und Bilder von koronalen Hirnschnitten von Bregma 5,64 mm bis Bregma -4,68 mm aufgenommen. In Abbildung 1Agibt es signifikante EcoHIV-EGFP-Signale im gesamten Gehirn, insbesondere im Kortex und im Gyrus hippocam...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein neues Rattenmodell der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV (EcoHIV) zu etablieren, das entscheidend ist, um unser Verständnis von HIV-1-Virusreservoirs im Gehirn zu verbessern und ein System zur Untersuchung von HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und damit verbundenen Komorbiditäten (dh Drogenmissbrauch) anzubieten.

Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Mit Ratten kann dieses Protokoll verwendet werden, um ein neues Modell der aktiven HIV-Infektion mit chimärem HIV zu etablieren. Bei Ratten könnte die Etablierung des EcoHIV-Infektionsmodells für Studien zu Drogenmissbrauch und neurokognitiven Störungen für die Untersuchung von Neuro-HIV und HIV-1-assoziierten neurokognitiven Störungen von Vorteil sein. Demonstrierende Vorgehensweise wird Hailong Li, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, sein.Für die Verpackung des Virus in 293 T-Zellen fünfmal 10 bis fünf 293 T-Zellen pro Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS, in jeden der beiden gelatinebeschichteten 75-Quadratzentimeter-Kolben aussäen und die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis die Kulturen eine Konfluenz von 50% erreichen. Am Tag der Transfektion 22,5 Mikroliter Transfektionsreagenz in 750 Mikroliter Medium pro Kolben in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen und die Lösung drei Sekunden lang vortexen. 20 Mikrogramm der chimären EcoHIV-Plasmid-DNA in 750 Mikroliter Medium in einem zweiten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Kolben unter gründlicher Mischung verdünnen.Kombinieren Sie die verdünnte DNA mit dem verdünnten Transfektionsreagenz unter sanftem Mischen und inkubieren Sie die resultierende Lösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie jede Virussuspension zu 10 Millilitern vorwarmem DMEM-Medium hinzu und fügen Sie jede virusergänzte Lösung in einen Kolben mit 293 T-Zellen hinzu. Nach zwei Tagen Zellkultur den Überstand aus den Kolben in einem einzigen 50-Milliliter-Konikalrohr zur Zentrifugation bündeln und den geklärten Überstand in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführen.Acht Milliliter Lenti-X-Konzentrator in den geklärten Überstand geben und mit sanfter Inversion mischen. Nach einer zweitägigen Inkubation bei vier Grad Celsius zentrifugieren Sie die Mischung und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, dann resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 100 Mikrolitern 100 Millimolar PBS und verwenden Sie ein P24 ELISA-Kit, um die Viruskonzentration zu titern. Für die EcoHIV-EGFP-Injektion rasieren Sie nach Bestätigung einer mangelnden Reaktion auf den Pedalreflex die Haare aus der Gehirnregion und sterilisieren Sie die exponierte Haut zweimal mit 70% Ethanol und einem Peeling auf Chlorhexidinbasis.Sichern Sie die Ratte in einer Bauchlage in einem stereotaxischen Apparat und machen Sie einen fünf bis sechs Zentimeter großen Schnitt durch die Haut entlang der Kopfhautmittellinie. Markieren Sie eine Bohrposition bei 0,8 Millimetern seitlich und eine 1,2 Millimeter rostrale bis bregma und bohren Sie an jeder Schädelposition ein Loch mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern. Laden Sie 1,04 mal 10 bis die sechsten Transduktionseinheiten pro Milliliter titerter EcoHIV Lentivirus-Lösung in eine 10-Mikroliter-Injektionsspritze und befestigen Sie die Spritze an der stereotaxischen Apparatur.Bewegen Sie die Nadel nahe an die Oberfläche eines Bohrlochs und führen Sie die Nadel 2,5 Milliliter in das Loch ein. Infundieren Sie einen Mikroliter Viruslösung mit einer Rate von 0,2 Mikrolitern Virus pro Minute. Wenn das gesamte Virus injiziert wurde, lassen Sie die Nadel fünf Minuten lang im Injektionsbereich, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen, bis sie sich außerhalb des Rattenschädels befindet.Schließen Sie den Hautschnitt mit einer 4-0 Seidenfadennaht und sterilisieren Sie die Lösung mit 70% Ethanol, dann legen Sie die Ratte in eine Erholungskammer mit einem Heizkissen mit Überwachung bis zur Liege. Ein bis acht Wochen nach der Virusinfusion, nachdem eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt wurde, fixieren Sie die Ratte in Rückenlage in einem Abzug und schneiden Sie die Haut entlang der thorakalen Mittellinie. Schneiden Sie die Membran ab, um die Brusthöhle zu öffnen, und führen Sie eine 20 Mal 25 Millimeter große Nadel in den linken Ventrikel ein.Öffnen Sie sofort das rechte Atrium mit einer Schere und durchtränken Sie 50 Milliliter vorgekühltes 100 Millimolar PBS bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute. Wenn das gesamte PBS geliefert wurde, mit 100 Millilitern kaltem 4% Paraformaldehyd perfundieren. Wenn das gesamte Fixiermittel abgegeben wurde, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und fixieren Sie das Gewebe über Nacht in frischem 4% Paraformaldehyd.Am nächsten Morgen legen Sie die Probe in 40 Milliliter 30% Saccharose in 100 Millimolar PBS in einem 50 Milliliter Röhrchen für etwa drei Tage, bis sich das Gehirn am Boden des Röhrchens absetzt, bevor Sie das Hirngewebe in Methylbutanol für zwei Minuten bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Verwenden Sie nach dem Einfrieren einen Minus 20 Grad Celsius Kryostaten und einen feinen Pinsel, um 50 Mikrometer dicke koronale Abschnitte zu erhalten. Wenn alle Abschnitte erhalten sind, decken Sie die Proben mit 300 Mikrolitern Anti-Fade-Medium ab und montieren Sie sie mit 22 50-Milliliter-Deckschichten.Wenn das Medium getrocknet ist, stellen Sie die Schnitte durch konfokale Mikroskopie ab. Sieben Tage nach der Lentivirus-Injektion zeigen koronale Hirnschnittbilder von Ratten ein signifikantes Vorhandensein von EcoHIV-EGFP-Signalen im gesamten Hirngewebe, insbesondere im Kortex und im Gyrus hippocampus dentatus. Die duale Markierung mit Iba1- und EcoHIV-EGFP-Sonden liefert starke Beweise dafür, dass Mikroglia der vorherrschende Zelltyp sind, der die EcoHIV-Expression im Gehirn beherbergt.Acht Wochen nach der Infektion zeigen EcoHIV-injizierte Tiere eine relative Unempfindlichkeit gegenüber der Manipulation des Interstimulusintervalls, was durch eine relativ flachere Intervallfunktion im Vergleich zu Salzkontrollen belegt wird. Darüber hinaus zeigen EcoHIV-injizierte Ratten tiefgreifende Veränderungen in ihrer dendritischen Wirbelsäulenmorphologie, was durch eine erhöhte relative Häufigkeit kürzerer dendritischer Stacheln mit erhöhten Kopf- und Halsdurchmessern im Vergleich zu Kontrolltieren belegt wird. Die Konzentration und Titration des Konditionsmediums vor der stereotaxischen Injektion ist entscheidend, um die konsistenten und reproduzierbaren Ergebnisse über Experimente hinweg sicherzustellen.Diese spezifische regionale stereotaxische Injektion von EcoHIV sorgt für eine effiziente HIV-Infektion im Gehirn und erzeugt bei Ratten zeitliche Verarbeitungsdefizite. Die Verwendung stereotaxischer HIV-Injektionen bei Ratten zur Erweiterung des EcoHIV-Infektionsmodells bietet eine wichtige Gelegenheit, neue Fragen im Zusammenhang mit Neuro-HIV zu beantworten.

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Die postnatale Rattenmodell für hypoxisch-ischämischen Hirn-Trauma ist ein gut etabliertes Modell der menschlichen Neugeborenen hypoxisch ischämischen Enzephalopathie (HIE). In diesem Artikel beschreiben wir das Modell der HIE in postnatalen Rattenjungen.

Die hypoxische ischämischen Enzephalopathie Model of Perinatal Ischämie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion chimärer HIV-Viren in die Hirnrinde einer Ratte, wo sich die Virus-RNA in das Wirtsgenom integriert, repliziert und ausbreitet, um eine aktive HIV-Infektion im experimentellen Modell zu etablieren.

Etablierung einer aktiven HIV-Infektion im Rattenmodell

Die Frühgeborenen-Enzephalopathie umfasst die Anomalien des Zentralnervensystems, die mit Verletzungen durch Frühgeburten verbunden sind. Dieser Bericht beschreibt ein klinisch relevantes Rattenmodell der in utero transienten systemischen Hypoxie-Ischämie und der intraamniotischen Lipopolysaccharid-Verabreichung (LPS), das die Chorioamnionitis nachahmt, und den damit verbundenen Einfluss von infektiösen Reizen und Plazenta-Unterperfusion auf die ZNS-Entwicklung.

Modellierung Enzephalopathie praematurorum Mit Prenatal Hypoxie-Ischämie mit Intra-Frucht Lipopolysaccharide bei Ratten

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Reproduktion einer weit verbreiteten Demyelinisierung der grauen Substanz beider kortikaler Hemisphären bei erwachsenen männlichen Dunklen Agouti-Ratten. Die Methode umfasst die intrazerebrale Implantation eines Katheters, die subklinische Immunisierung gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die intrazerebrale Injektion einer entzündungsfördernden Zytokinmischung durch den implantierten Katheter.

Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, induziert durch eine intrazerebrale Injektion von entzündungsfördernden Zytokinen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Schaffung eines immunkompetenten ICR (Institute of Cancer Research) murinen Modells der Infektion des zentralen Nervensystems vor, um die Entwicklung der Neuropathie anzuzeigen. Die Überwachung akuter viraler Enzephalit-Erkrankungen durch identische Krankheitswerte könnte durchgeführt werden, um die dengue-Virus-induzierte Neuropathie in vivo zu zeigen.

Ein murines Modell der Dengue-Virus-induzierten akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit

Der Zweck dieser Studie ist es, ein Tiermodell für die Forschung in der Erholung und Fortsetzung der Gehirn-Ischämie zu etablieren und zu validieren, indem Hirninfarkt und sensorimotorische Funktion nach mittlerer ZerebrierungSverschluss/Reperfusion (MCAO/R) nach 1-90 getestet werden. Tage in Ratten.

Ein präklinisches Modell zur Beurteilung der Gehirnerholung nach akutem Schlaganfall bei Ratten

Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Der posthämorrhagische Hydrozephalus der Frühgeburt (PHHP) kann bei neugeborenen Ratten durch Kombination von Chorioamnionitis und intraventrikulärer Blutung modelliert werden. Die Kombination dieser pränatalen und postnatalen Ereignisse rekapituliert genau die klinischen Merkmale von PHHP, einschließlich Makrozephalie, Ventrikulomegalie und erhöhtem Hirndruck, über die gesamte Lebensspanne.

Modellierung des posthämorrhagischen Hydrozephalus der Frühgeburt bei Ratten

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Kombination einer EcoHIV-Infektion mit Tmem119-EGFP-Mäusen ein wertvolles biologisches System für die Untersuchung von Mikrogliaveränderungen und viralen Reservoirs in Nagetiermodellen für HIV-assoziierte neurokognitive Störungen darstellt.

Identifizierung von EcoHIV-infizierten Zellen in Mikroglia-manipulierten transgenen Mäusen

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Induktion eines einzigartigen Rattenmodells der bipolaren Störung vorgestellt, das sowohl manieartiges als auch depressives Verhalten erfasst.

Entwicklung eines Rattenmodells für die bipolare Störung

Erfahren Sie die Entwicklung eines Rattenmodells der EcoHIV-Gehirninfektion für NeuroHIV-Forschung. Diese Methode ermöglicht Studien zu HIV-assoziierten neurokognitiven Störungen und synaptischen Veränderungen.

Ein Rattenmodell der EcoHIV-Gehirninfektion

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