Name: Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Lernen Sie CRISPR/CasRx-basiertes RNA-Targeting in Drosophila melanogaster für ubiquitäre und gewebespezifische Transkriptreduktion. Diese Methode ermöglicht effiziente, programmierbare Genfunktionsanalysen in vivo.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Finanzierung durch einen DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047) und NIH-Auszeichnungen (R21RAI149161A, DP2AI152071) an O.S.A. unterstützt.

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Mit drei verschiedenen Anwendungsdesigns des CasRx-Systems demonstrierte diese Arbeit in vivoprogrammierbares RNA-Targeting in Fliegen. Die verschiedenen Strategien sind auf unterschiedliche Projektanforderungen ausgerichtet, z. B. endogenes versus exogenes Gen-Targeting und allgegenwärtiges versus gewebespezifisches RNA-Targeting. Die Wirkungen des RNA-Targetings umfassten zielgenspezifische phänotypische Veränderungen, die Reduzierung des Ziel-RNA-Transkripts und gelegentliche Letalitätsphänotypen, die mit einer hohen Expression des CasRx-Proteins und der Kollateralaktivität assoziiert sind. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass das CasRx-System in der Lage ist, die RNA-Transkriptreduktion auf organismischer Ebene programmierbar und effizient zu reduzieren.
Einer der Schlüsselfaktoren für ein erfolgreiches Customizing des CasRx-Systems ist das Design von gRNAs. Insbesondere ist der folgende Rat zu beachten: Die Zielsequenz ist etwa 30 Nukleotide lang, die Länge der Poly-U-Dehnungen in der Zielsequenz beträgt 4 Basenpaare oder weniger, der GC-Gehalt der Zielsequenz liegt im Bereich von 30% - 70%, die Zielsequenz wird nicht vorhergesagt, um starke RNA-Haarnadelstrukturen zu bilden, und die Zielsequenz enthält eine minimale vorhergesagte sekundäre oder tertiäre RNA-Struktur5.
Neben den gRNA-Designs ist auch der Schritt der Fliegengenetik in jedem Protokoll entscheidend für eine erfolgreiche Implementierung. Das Vorhandensein oder Fehlen der definierten Phänotypen, die von den Eltern in den Nachkommen weitergegeben werden, ist wichtig für die Identifizierung und Quantifizierung von Phänotypen, die durch das CasRx-System in den transheterozygoten Nachkommen induziert werden. Auch das parallele Einrichten von Kontrollkreuzen mit den dCasRx-Fliegen ist hilfreich, um unspezifische Phänotypen in den transheterozygoten Nachkommen auszuschließen.
Es ist erwähnenswert, dass diese Ergebnisse ein Toxizitätsproblem aufdeckten, das durch die allgegenwärtige Expression von CasRx- und dCasRx-Protein im Flug eingeführt wurde, eine Einschränkung des CasRx-Systems. Die allgegenwärtige Expression von CasRx oder dCasRx unter dem Ubiq-Promotor allein, ohne gRNAs, war mit nichttrivialen Fitnesskosten verbunden, da weder Ubiq-CasRx- noch Ubiq-dCasRx-Fliegen als homozygote Linien etabliert werden konnten. Im Gegenteil, UASt-CasRx- und UASt-dCasRx-Fliegen können als gesunde homozygote Bestände etabliert werden, obwohl sie aufgrund des Designs des Kreuzschemas als doppelt ausgewogene Bestände gehalten wurden, eine Tatsache, die die Existenz einer Toxizität unterstützt, die durch die allgegenwärtige CasRx-Proteinexpression induziert wird. Ein weiterer unterstützender Beweis ist, dass in Kontrollexperimenten mit dCasRx, das katalytisch inaktiv ist, die Prozentsätze der Fliegen, die sowohl dCasRx- als auch gRNA-Konstrukte aus der Gesamtzahl der Fliegen in der F1-Generation tragen, durchweg niedriger als 50% waren, das Verhältnis, das basierend auf der Mendelschen Genetik erwartet wurde, wenn keine dCasRx-assoziierte Toxizität vorhanden war. Dies deutete darauf hin, dass die ubiquitäre Expression von dCasRx zusammen mit gRNAs eine Toxizität in der Fliege induziert, was zu einem geringeren Vererbungsverhältnis als erwartet führt. Die Vererbungsverhältnisse von transheterozygoten UASt-dCasRx-, gRNA-, GAL4-Fliegen folgten der Mendelschen Genetik, was wiederum auf die Toxizität hindeutet, die spezifisch durch die ubiquitäre Expression von CasRx- und dCasRx-Proteinen induziert wird. Die Toxizität im CRISPR/Cas-System ist nicht neu. Es hat sich gezeigt, dass hohe Mengen an Cas9-Protein in mehreren Organismen toxisch sind, einschließlich Fliegen29,30,31,32. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat ein maßgeschneidertes GAL4 / UAS-System entwickelt, das die Menge an Cas9-Protein, die in Fliegen exprimiert wird, abstimmen kann, indem ein offener Leserahmen unterschiedlicher Länge zwischen der UAS-Sequenz und der Cas9-Sequenz im UAS-Cas9-Konstrukt hinzugefügt wird33. Daher lohnt es sich, Wege zu erkunden, um die CasRx-induzierte Toxizität durch Abstimmung des CasRx-Proteinexpressionsniveaus zu reduzieren.
Abgesehen von der Toxizität, die durch die ubiquitäre Expression von CasRx- und dCasRx-Proteinen induziert wird, zeigten die Ergebnisse auch eine Letalität im Zusammenhang mit den unspezifischen kollateralen Off-Target-Effekten des CasRx-Systems, ein Merkmal vieler CRISPR-Systeme1,2,7,34. In einigen der CasRx- und nicht-essentiellen Gen-gRNA-exprimierenden Doppel- oder Dreifach-Transheterozygot-Fliegen, zum Beispiel beim Targeting von Notch, haben die transheterozygoten CasRx-Fliegen im Vergleich zu den transheterozgyen dCasRx-Fliegen eine signifikant niedrigere Überlebensrate. In der RNA-seq-Analyse dieser CasRx- und gRNA-exprimierenden transheterozygoten Fliegen wurde sowohl die Reduktion der Ziel-Gentranskript-Spiegel als auch die Reduktion von Nicht-Ziel-Gentranskripten beobachtet. Diese Kollateraleffekte waren CasRx-abhängig und zielabhängig, da sie nur bei transheterozygoten Fliegen beobachtet wurden, die sowohl das CasRx-Protein als auch die gRNA exprimierten. Es ist erwähnenswert, dass eines der Zielgene, weiß, nur eine begrenzte, nicht statistisch signifikante Reduktion der Transkripte zeigte, wenn das weiße Gen von CasRx angegriffen wurde, was im Gegensatz zum klaren Pigmentreduktionsphänotyp stand. Es wird angenommen, dass dies auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, dass 1) der Zeitpunkt der RNA-seq-Probenentnahme nicht gut auf den Zeitpunkt abgestimmt war, zu dem das weiße Gen während der frühen Entwicklung seine maximale Expression erreicht, und 2) die lokalisierte Expression des weißen Gens in den Augen es schwierig macht, die relevanten Gewebe während der frühen Entwicklungsphase zu sammeln, wenn nur die Ganzkörperprobenentnahme möglich ist. Um die Kollateralaktivität im CasRx-System zu reduzieren, sind zukünftige Studien erforderlich, um die Mechanismen, die dem Off-Target-Phänomensystem auf organismischer Ebene zugrunde liegen, vollständig zu verstehen.
Interessanterweise schien eine kürzlich durchgeführte Studie35 , in der RNA-Targeting-Cas13-Werkzeuge in Fliegen beschrieben wurden, die allgemeine Toxizität im Zusammenhang mit der CasRx-Expression aus mehreren möglichen Gründen zu verbessern. Erstens kodierten die Autoren die Cas13-Transgene neu, um die Expression in Drosophila zu optimieren, und verwendeten einen schwächer exprimierenden Promotor (Actin 5C) im Vergleich zu dem in der vorliegenden Studie verwendeten Ubiquitin-Promotor, was wahrscheinlich zu niedrigeren Cas13-Expressionsraten und damit zu einer geringeren Toxizität führte. Tatsächlich wird dies durch die Beobachtungen gestützt, dass die UASt-gesteuerte CasRx- und dCasRx-Expression an sich nicht toxisch war, da diese Studie (und die Autoren in 35) keine offensichtliche Letalität bei UASt-CasRx-Fliegen beobachteten. Darüber hinaus kodierten diese Autoren ihre gRNAs anders als in dieser Studie, was ihre Expression beeinflusst und die Toxizität des Systems in transheterozygoten Cas13/gRNA-Fliegen reduziert haben könnte. Zum Beispiel wurden in ihrer Studie zwei gRNAs mit dem U6: 3-Promotor exprimiert und von tRNAs flankiert, um die gRNA-Verarbeitung bei der tRNA-Reifung zu ermöglichen, ohne CasRx35 zu benötigen. Umgekehrt wurden die gRNAs in dieser Studie als Arrays kodiert, die auf bis zu 4 Stellen pro Gen abzielen und die endogene Cas13-Array-Struktur in Bakterien nachahmen, die das Cas13-Enzym benötigt, um jede gRNA zu verarbeiten. Diese unterschiedlichen Ansätze könnten zu Unterschieden in der gRNA-Expression und anderen Faktoren geführt haben, die inhärente Auswirkungen auf die Toxizität des gesamten Systems haben können. Schließlich zielten Huynh et al. auf andere Gene ab als die in der vorliegenden Studie angesprochenen, was zu Unterschieden in der Target-Cas/gRNA-Interaktion und der Kollateralaktivität führt und Auswirkungen auf die beobachtete Letalität haben kann. Diese Unterschiede in der beobachteten Toxizität rechtfertigen weitere Untersuchungen, um Wege zu finden, wie die Gesamtsysteme verbessert werden können.
Insgesamt ist diese Studie die erste Demonstration eines funktionellen, genetisch kodierten programmierbaren RNA-Targeting-Cas-Systems in D. melanogaster, obwohl eine weitere Optimierung des CasRx-Systems (im Einklang mit dem, was berichtet wird35) erforderlich sein wird, um die Off-Target-assoziierte Letalität weiter zu reduzieren und die Wirksamkeit der CasRx-On-Target-Spaltung zu erhöhen. RNA-Targeting mit Cas-Enzymen ist ein sich schnell entwickelndes Feld mit vielen potenziellen Anwendungen, die von der Insektenvektorkontrolle bis hin zu therapeutischen Anwendungen reichen1,2,3,4,5,6,7, und dieses Protokoll bietet ein Starterpaket für alle, die daran interessiert sind, ihr erstes CasRx-System in Fliegen zu entwerfen, während es mit der Anpassung und weiteren Optimierung des Systems kompatibel ist. Die hier vorgestellten Beispiele zeigen eine Reihe von Ergebnissen, die bei der Implementierung dieses Systems in vivo auftreten können, und können als Benchmarks für andere Benutzer bei der Bewertung der Leistung des CasRx-Systems in ihren Anwendungen dienen.

Seit dem Aufkommen der CRISPR-Technologien (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) liegt ein Großteil des Fokus in diesem Bereich auf der DNA-Editierung, die transformative Anwendungen in der Medizin und Biotechnologie bietet1. Eine dauerhafte Veränderung von DNA-Sequenzen ist jedoch aus ethischen Gründen nicht immer erwünscht. Vor diesem Hintergrund begannen jüngste Studien mit der Entwicklung von CRISPR-basierten Werkzeugen für das Targeting von RNA und zeigten, dass CRISPR-Technologien tatsächlich für das RNA-Targeting in einer Vielzahl von biologischen Systemen verwendet werden können2,3,4,5,6,7. In vielen dieser getesteten Systeme ist der derzeit weit verbreitete Ansatz für die Targeting-RNA und Transkriptreduktion die RNA-Interferenz (RNAi), die bei weitem nicht perfekt ist und oft eine unterschiedliche Wirksamkeit und eine hohe Off-Target-Aktivität aufweist, wenn sie in vivo verwendet wird8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Angesichts des Status dieser Technologien lohnt es sich daher, die Potenziale von CRISPR-basierten Tools für das RNA-Targeting weiter zu erforschen.
Eine bemerkenswerte aktuelle Studie berichtete, dass die Ribonuklease CasRx, ein Mitglied der Cas13d-Klasse, die Gentranskriptspiegel in der menschlichen Zellkultur effizient reduzieren kann und ein attraktives Off-Target-Profil besitzt4. Dieser Befund führte zu der Frage, ob diese neue Ribonuklease ihre Wirksamkeit und niedrige Off-Target-Rate für das RNA-Targeting auf organismischer Ebene aufrechterhalten kann. Eine kürzlich durchgeführte Studie befasste sich mit dieser Frage, indem sie zeigte, dass das CasRx-System verwendet werden kann, um eine ubiquitäre und gewebespezifische Reduktion von Gentranskripten in Drosophila melanogaster5 zu erreichen.
Um die Benutzerfreundlichkeit dieses kürzlich veröffentlichten Ansatzes zu rationalisieren, beschreibt dieses Protokoll die Methoden aus dieser jüngsten Arbeit, die aus drei Hauptteilen besteht: 1) allgegenwärtiges In-vivo-RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System; 2) ubiquitäre in vivo exogene RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System; und 3) gewebespezifisches In-vivo-RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System.
Guide RNAs (gRNA), die auf verschiedene Zielgene unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors abzielen, wurden entworfen und Fliegenlinien erzeugt, die diese gRNA-haltigen Konstrukte exprimieren. CasRx-Konstrukte, die entweder unter der Kontrolle eines ubiquitären Promotors oder eines UFSt-Promotors (Conditional Upstream Activation Sequence) stehen, der durch den GAL4-Transkriptionsfaktor aktivierbar ist, wurden ebenfalls entworfen und Flylines erzeugt, die diese CasRx-haltigen Konstrukte beherbergen. Katalytisch inaktive CasRx-Konstrukte, dCasRx, wurden als Negativkontrollen konzipiert und verwendet. Das ubiquitäre RNA-Targeting in Fliegen wird durch Kreuzung von gRNA-exprimierenden Fliegenlinien mit ubiquitär CasRx-exprimierenden Fliegenlinien erreicht. Die Nachkommen, die sowohl das gRNA-Konstrukt exprimieren, das auf ein bestimmtes Gentranskript abzielt, als auch das CasRx-Protein haben eine allgegenwärtige Reduktion der zielgerichteten Gentranskripte. Ein gewebespezifisches RNA-Targeting in Fliegen wird erreicht, indem zunächst gRNA-exprimierende Fliegen mit UASt-CasRx-exprimierenden Fliegen kreuzen und transheterozygote Fliegen erhalten werden, die sowohl gRNA- als auch UASt-CasRx-Konstrukte tragen. Solche Fliegen wiederum werden mit gewebespezifischen GAL4-exprimierenden Fliegen gekreuzt, was zur Erzeugung einer gewebespezifischen CasRx-Expression und eines RNA-Targetings bei Fliegen führt.
Die programmierbare Natur des CasRx-Systems bietet die Möglichkeit der Anpassung und Optimierung, um eine hohe Wirksamkeit und eine geringe Off-Target-Aktivität für das In-vivo-RNA-Targeting zu erreichen. Mögliche Anwendungen von CRISPR-basiertem RNA-Targeting sind zahlreich, einschließlich des Ersatzes von RNAi im Labor und des Beitrags zur Insektenvektorkontrolle in freier Wildbahn. Von letzterem ist einer der globalen unerfüllten Bedürfnisse die Entwicklung effizienter Werkzeuge zur Bekämpfung von Infektionen von RNA-Viren, die über Moskitos übertragen werden. Viele RNA-Viren wie Dengue-, Zika- und Chikungunya-Virus werden über Moskitos übertragen, was die menschliche Gesundheit beeinträchtigt und zur Mortalität beiträgt. Es wurden viele Vorschläge für die Entwicklung von Mückenpopulationen mit Virusresistenz zur Krankheitsprävention gemacht; Keine aktuelle Technologie ist jedoch in der Lage, Moskitos gleichzeitig gegen alle signifikanten RNA-Viren resistent zu machen18,19,20,21,22,23. RNA-targeting-Cas-Systeme können einen Ausgangspunkt für eine solche Technologie bieten, indem sie eine programmierbare Plattform für das Targeting aller durch Mücken übertragenen RNA-Viren ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>100% Traubensaft</td><td>Welch Foods Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Aktive Trockenhefe (908 g)</td><td>Red Star Yeast Company, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DMC4500 Farbkamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC4500</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-GMR fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>29967</td><td></td></tr><tr><td>GAL4-y fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>44373</td><td></td></tr><tr><td>Glomax 20/20 Luminometer</td><td>Promega</td><td>E5331</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq2500 Sequenzer</td><td>Illumina, Inc.</td><td>HiSeq2500</td><td></td></tr><tr><td>M165FC Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M165FC</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop OneC UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>NDONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>E7770</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 112686</td><td>Addgen</td><td>112686</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 112688</td><td>Addgen</td><td>112688</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132416</td><td>Addgen</td><td>132416</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132417</td><td>Addgen</td><td>132417</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132419</td><td>Addgen</td><td>132419</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132420</td><td>Addgen</td><td>132420</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132421</td><td>Addgen</td><td>132421</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132422</td><td>Addgen</td><td>132422</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132425</td><td>Addgene</td><td>132425</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 132426</td><td>Addgene</td><td>132426</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 133304</td><td>Addgene</td><td>133304</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid # 164586</td><td>Addgene</td><td>164586</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid #132418</td><td>Addgene</td><td>132418</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid pJFRC81</td><td>Addgene</td><td>36432</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen NotI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen PacI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen PstI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0140L</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen SwaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0604L</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen XbaI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0145L</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit für Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-Fluc fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84125</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84986</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-N fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84122</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-w fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>U6-3:4-gRNA-y</td><td>fliegt Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84123</td><td></td></tr><tr><td>UASt-CasRx fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84121</td><td></td></tr><tr><td>UASt-dCasRx fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84120</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-CasRx fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84118</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-dCasRx fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84119</td><td></td></tr><tr><td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla fliegt</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>84127</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>D4007</td><td></td></tr></tbody></table>

ubiquitäres und gewebespezifisches rna-targeting in drosophila melanogaster mittels crispr/casrx

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, ein Mitglied der RNA-Targeting-Cas13-Familie, ist eine vielversprechende neue Ergänzung der CRISPR/Cas-Technologien in der effizienten Reduktion von Gentranskripten mit einem attraktiven Off-Target-Profil sowohl auf zellulärer als auch auf organismischer Ebene. Kürzlich wurde berichtet, dass das CRISPR/CasRx-System verwendet werden kann, um eine ubiquitäre und gewebespezifische Reduktion von Gentranskripten in Drosophila melanogaster zu erreichen. Dieses Papier beschreibt die Methoden aus der jüngsten Arbeit, bestehend aus drei Teilen: 1) ubiquitäres in vivo endogenes RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System; 2) ubiquitäre in vivo exogene RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System; und 3) gewebespezifisches in vivo RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System. Zu den beobachteten Wirkungen des RNA-Targetings gehören gezielte genspezifische phänotypische Veränderungen, eine gezielte RNA-Transkriptreduktion und gelegentliche Letalitätsphänotypen, die mit einer hohen Expression des CasRx-Proteins und der Kollateralaktivität assoziiert sind. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass das CasRx-System in der Lage ist, die RNA-Transkriptreduktion auf organismischer Ebene programmierbar und effizient zu reduzieren, was zeigt, dass in vivo Transkriptom-Targeting und Engineering machbar ist und die Grundlage für zukünftige in vivo CRISPR-basierte RNA-Targeting-Technologien legt.

Ubiquitäres In-vivo-RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System Die F1-Transheterozygot-Fliegen, die sowohl die Ubiq-CasRx- als auch die gRNA-Konstrukte (die sowohl auf endogene als auch auf exogene Gene abzielen) exprimieren, zeigten ausgeprägte Phänotypen im Vergleich zu den Kontrollfliegen, die die Ubiq-dCasRx- und gRNA-Konstrukte exprimieren (Abbildung 2 und Abbildung 4). Insbesondere haben die transheterozygoten CasRx-Fliegen im Vergleich zu den transheterozgyen dCasRx-Fliegen eine signifikant niedrigere Überlebensrate, was auf eine Toxizität des Ubiq-CasRx-Systems hinweist (Abbildung 2A und Abbildung 4A). Es ist erwähnenswert, dass sowohl transheterozygote CasRx- als auch dCasRx-Fliegen eine Vererbungsrate von weniger als 50% aufweisen, was das erwartete Verhältnis basierend auf der Mendelschen Genetik ist. Von den drei Zielgenen ist das Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ fliegt und Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ Fliegen sind nicht lebensfähig (0% Vererbung) und wuchsen nicht über das zweite Larvenstadium hinaus (Abbildung 2A-2B). Die überlebende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ Fliegen, deren Vererbung 12,9% betrug, zeigten einen ausgeprägten vollständig durchdringenden Weißäugigen Phänotyp (Abbildung 2B). Zusätzlich zu den beobachtbaren Merkmalen, die mit CasRx assoziiert sind, konnten wir eine signifikante Reduktion der Zielgentranskripte für 3 Zielgene bestätigen: Notch, Gelb und GFP (Abbildung 2E-2G). Eine Reduktion der weißen Gentranskripte wurde bei Ubiq-CasRx/+-, U6-gRNAw/+-Fliegen im Vergleich zu den Kontrollfliegen Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+ beobachtet, obwohl die Reduktion statistisch nicht signifikant war (Abbildung 2E - 2F). Hinweise auf eine durch CasRx induzierte Off-Target-Aktivität wurden beim Vergleich der differentiell exprimierten Transkripte zwischen Proben von CasRx-exprimierenden Fliegen und Proben von dCasRx-exprimierenden Fliegen gefunden (Abbildung 2E, 2G). Die Anzahl der Nicht-Ziel-Transkripte, die signifikant unterschiedlich ausgedrückt werden, ist wie folgt: weiß, 253 (1,4% der gesamten Transkripte); Kerbe, 300 (1,7%); gelb, 41 (0,23%); GFP, 5.880 (33%) (Abbildung2G). Von den insgesamt 17.779 verschiedenen Transkripten wurden 6 Nichtzieltranskripte in allen 4 Gruppen von Stichproben signifikant unterschiedlich exprimiert. Eines der 6 identifizierten Transkripte war Gadd45, ein Gen, das an apoptose und zellulärem Stillstand bei Fliegen beteiligt ist, was die Möglichkeit erhöht, dass die enzymatische Wirkung von CasRx entweder direkt zelluläre Apoptose auslösen oder indirekt eine Fehlexpression anderer Gene auslösen kann, was wiederum zu Apoptose führt. Schließlich ist es erwähnenswert, dass die Fliegen Ubiq-CasRx und Ubiq-dCasRx nicht als homozygote Bestände etabliert wurden, vermutlich aufgrund der Toxizität, die durch eine hohe ubiquitäre Expression verliehen wird. Infolgedessen wurden heterozygote Ubiq-CasRx/CyO- und Ubiq-dCasRx/CyO-Fliegen für die Kreuzung mit homozygoten gRNA-Fliegenlinien verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Zwei-Komponenten-Ubiq-CasRx-System in der Lage ist, ein ubiquitäres RNA-Targeting sowohl für endogene als auch für exogene Ziele zu erreichen, was zu beobachtbaren Phänotypen und Transkriptreduktion führt. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass CasRx-vermitteltes RNA-Targeting Toxizität in vivo einführen kann.
Allgegenwärtiges in vivo exogenes RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System Die Ergebnisse des zweistufigen Kreuzes zeigten, dass trotz der exogenen Natur des Zielgens (d. h. Fluc) die Exprimierung aller drei Transgene in F2-Dreifachtransheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) zu einer Letalität von 100% im Vergleich zu Kontrollkreuzungen mit Ubiq-dCasRx führte, bei denen bei den F2-Dreifach-Transheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) keine Letalität beobachtet wurde (Abbildung 3B-C ). Genauer gesagt führte nur die Kombination aller drei Transgene (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) zu einer 100%igen Letalität (Abbildung 3B und D), während (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) und (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) Genotypen waren lebensfähig und es fehlten Phänotypen, deren Vererbungsraten den erwarteten Mendelschen Übertragungsraten entsprachen, was darauf hindeutet, dass die Verfügbarkeit der Zielsequenz (d.h. Glühwürmchen-Luciferase) in Kombination mit Ubiq-CasRx/+ und dem gRNAFluc zu den beobachteten Letalitätsphänotypen führte, die vermutlich auf die Kollateralaktivität von Cas13-Enzymen zurückzuführen sind2,8 . Darüber hinaus gibt es keine unterscheidbaren Phänotypen oder dramatischen Einfluss auf die Vererbung in F1-Transheterozygoten (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ oder Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) wurden im Vergleich zu Ubiq-dCasRx-Kontrollen (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ oder Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Abbildung 3B), was darauf hindeutet, dass ein katalytisch aktives Enzym essentiell ist, um die beobachteten Letalitätsphänotypen zu erhalten. Darüber hinaus zeigten die Fluc- und Rluc-Expressionsniveaus bei Fliegen aller lebensfähigen Genotypen keine signifikante Reduktion der Fluc-Expression in den Ubiq-dCasRx-Dreifachtransheterozygoten (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) im Vergleich zu dualen Luciferase-Reporterkontrollen. Dies deutet darauf hin, dass die Fluc-Proteinexpressionsniveaus durch dCasRx-Targeting nicht reduziert wurden (Abbildung 3D). Zusammengenommen zeigt der gemeinsame Letalitätsphänotyp in den beiden verschiedenen CasRx-vermittelten ubiquitären RNA-Targeting-Experimenten, dass CasRx-vermitteltes RNA-Targeting bei ubiquitärer Verwendung auf Geweben für den Organismus toxisch sein kann.
Gewebespezifisches in vivo RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System Die hohe Toxizität, die in ubiquitären RNA-Targeting-Experimenten beobachtet wurde, veranlasste uns, das gewebespezifische RNA-Targeting mit einem dreikomponentigen CasRx-Systemdesign zu untersuchen, das im Methodenabschnitt beschrieben wird. In der Tat wurde der Grad der beobachteten Toxizität reduziert, wenn die Gesamtex-CasRx-Expression unter Verwendung des UASt-Promotors im Vergleich zu der des Ubiq-Promotors gesenkt wurde, dies wird durch drei Aspekte veranschaulicht: 1) die UASt-CasRx- und UASt-dCasRx-Linien wurden als homozygote Linien beibehalten, obwohl auf der Grundlage des zweistufigen Kreuzschemas doppelt ausbalancierte UASt-CasRx- und UASt-dCasRx-Linien zur Durchführung der Kreuze verwendet wurden, 2) alle dreifach transheterozygoten Vererbungsraten der F2-Generation dCasRx entsprachen der erwarteten Mendelschen Vererbungsrate von 25%, und 3) der CasRx-Dreifachtransheterozygot-Letalitätsphänotyp der F2-Generation war moderat reduziert. Im White-Targeting-Experiment wurden von den 25% Mendelschen Vererbungsraten, die in den F2-Dreifachtransheterozygoten erwartet wurden, nur 0,57% lebensfähige erwachsene Fliegen (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4) beobachtet, die alle schwere augenspezifische Pigmentierungs- und Morphologiephänotypen aufwiesen (Abbildung 4A und 4B). Für das White-Targeting-Kreuz war die CasRx-exprimierende dreifache transheterozygote F2-Vererbungsrate signifikant niedriger als die der dCasRx-exprimierenden dreifachen transheterozygoten Kontrollgruppe (27,6%) (Abbildung 4A). Im Notch-Targeting-Experiment waren CasRx-exprimierende dreifache Tranheterozygous, die alle drei Transgene trugen, zu 100% tödlich, während die Vererbungsrate der dCasRx-Kontrolle 29,3% betrug (Abbildung 4A). Im Gelb-Targeting-Experiment zeigten F2 Triple Transheterozygous CasRx-exprimierend, gRNAy und y-GAL4 eine marginale Chitinpigmentreduktion als kleine Flecken gelber Kutikula am Brustkorb und Abdomen mit einer Vererbungsrate von 2,67%, viel niedriger als die der dCasRx-Kontrollgruppe (25,2%) (Abbildung 4A ). Alle dCasRx-Kontroll-Dreifach-Transheterozygot-Fliegen wiesen keine offensichtlichen Phänotypen wie die CasRx-exprimierenden Fliegen auf, was darauf hindeutet, dass die katalytische Aktivität von CasRx zu den beobachteten Phänotypen beitrug. Die niedrige Vererbungsrate in der CasRx-Dreifachtransheterozygot-Gruppe deutete darauf hin, dass im CasRx-RNA-Targeting zwei Toxizitätsquellen existieren: Eine ist mit einer hohen Expression von CasRx verbunden, deren Toxizität durch restriktive CasRx-Expression reduziert wurde, die andere ist mit der Kollateralaktivität verbunden. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass das CasRx-System durch die Nutzung des klassischen Gal4/UASt-Systems ein gewebespezifisches in vivo RNA-Targeting erreichen und in der Zwischenzeit die Toxizität reduzieren kann. Toxizitäts- und gelegentliche Letalitätsphänotypen wurden jedoch im Vergleich zu den allgegenwärtigen Ansätzen immer noch bei einem niedrigeren Schweregrad beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Kollateralspaltungsaktivität mit der Toxizität verbunden ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über das RNA-Targeting mit einem Cas13D-System. (A) Schematische Darstellung des einstufigen genetischen Kreuzes im ubiquitären in vivo RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System. (B) Schematische Darstellung einer zweistufigen genetischen Kreuzung in der ubiquitären in vivo exogenen RNA, die unter Verwendung des Drei-Komponenten-CasRx-Systems abzielt. (C) Schematische Darstellung einer zweistufigen genetischen Kreuzung in der gewebespezifischen in vivo RNA, die mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System zielt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Abbildung 2: Ubiquitous in vivo RNA targeting using a two-component CasRx system (reprinted5). (A) Total inheritance percentages of transheterozygous flies inheriting Ubiq-CasRx (or Ubiq-dCasRx) and gRNAs. Die blaue Schattierung im Box-Plot zeigt die Penetranz des Phänotyps an. (B) Phänotypen von transheterozygoten Fliegen. Pfeile zeigen Gewebenekrose im Auge an. Schwarz-weiße Fliege, die mit ''X'' markiert ist, steht für Letalität. (C) Gesamtvererbungsprozentsätze von transheterozygoten Fliegen bidirektionaler Kreuzungen zwischen Ubiq-CasRx (oder Ubiq-dCasRx) und gRNAGFP-OpIE2-GFP-Fliegen. M, mütterliches Erbe von CasRx; P, väterliches Erbe von CasRx. (D) F1-Larven-Nachkommen im väterlichen Kreuz. (E) Maximale a posteriori-Schätzungen der Transkripte für die logarithmische Faltenänderung. DESeq2-Pipeline wurde verwendet. (F) Transkripte pro Million (TPM), die mit CasRx oder dCasRx angestrebt werden. (G) CasRx-abhängiger differenziell ausgedrückter Transkriptprozentsatz von Transkripten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Abbildung 3: Ubiquitäres in vivo exogenes RNA-Targeting unter Verwendung eines Drei-Komponenten-CasRx-Systems. (A) Schemata der zweistufigen genetischen Kreuzung. (B) Gesamtvererbungsprozentsätze für alle Genotypen, die in der F2-Generation entstehen. Die Vererbung aller drei Transgene (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc und gRNAFLuc) in F2-Nachkommen ergab eine 100%ige Letalität und war im Vergleich zur Ubiq-dCasRx-Dreifach-Transheterozygotes-Kontrollgruppe signifikant niedriger (p = 0,001, t-Test). (C) Das Tragen von Ubiq-CasRx/gRNAFluc allein oder Ubiq-CasRx und Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc allein führte nicht zu schwerer Letalität, und die Vererbungsverhältnisse zwischen Ubiq-CasRx und Ubiq-dCasRx-Transheterozygoten unterschieden sich nicht signifikant (p = 0,41 bzw. p = 0,51, t-Test). (D) Luziferase-Verhältnis von normalisierenden Fluc-Messwerten zu Rluc-Messwerten. Dreifache transheterozygote Fliegen, die Ubiq-CasRx exprimieren, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc waren embryonal letal, was durch eine Fliege mit einem "X" dargestellt wurde, und infolgedessen wurde die Luciferase-Expression nicht gemessen. Fluc/Rluc-Verhältnis von Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb-Transheterozygoten war signifikant niedriger als das der anderen Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-exprimierenden Gruppen (p = 1,2e-06 oder niedriger, t-Test). Die Ergebnisse aus der gRNAFLuc-only-Gruppe waren signifikant niedriger als die aller anderen Gruppen (p = 1,2e-06 oder niedriger, t-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Abbildung 4: Gewebespezifisches in vivo RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System (nachgedruckt5). (A) Gesamtvererbungsprozentsatz von dreifach transheterozygoten Fliegen, die drei Transgene (UASt-CasRx oder UASt-dCasRx, gRNAs und Gal4-Treiber) tragen. (B) Phänotypen der dreifach transheterozygoten Fliegen. Der weiße Pfeil zeigt eine Chitinpigmentreduktion im Thorax an. Schwarz-weiße Fliege, die mit ''X'' markiert ist, steht für Letalität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bauen</td>
			<td>Beschreibung</td>
			<td>Fibel</td>
			<td>Primer-Sequenz (5' bis 3')</td>
			<td>PCR-Vorlage</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E</td>
			<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L</td>
			<td rowspan="2">UASt-Projektträger</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">UASt-Projektträger</td>
			<td>1041.C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041.C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043</td>
			<td rowspan="2">U6:3 Veranstalter</td>
			<td>1043.C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Addgen-Plasmid #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043.C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B</td>
			<td rowspan="2">Ubiq-Projektträger</td>
			<td>Nr. 1052B. C1</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Addgenplasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nr. 1052B. C2</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Addgenplasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Umgekehrter Ubiq-Promoter</td>
			<td>908A3</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA AGBGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG</td>
			<td rowspan="2">Addgenplasmid #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der molekularen Konstrukte und Primer, die in dieser Studie verwendet wurden. Diese Liste enthält alle Konstrukte (sowohl die ID als auch die Beschreibung) und die jedem Konstrukt zugeordneten Primer (sowohl die ID als auch die Sequenzen (5' bis 3')) und die verwendeten Vorlagen.

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung des RNA-Targeting-Enzyms Cas13D (RfxCas13D) in Fliegen.

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Wie unser Protokoll zeigt, können CRISPR CasRx-Technologien verwendet werden, um ubiquitäre und gewebespezifische Reduktionen von Gentranskripten bei Fruchtfliegen zu erreichen. Unsere Technik bietet ein Starterpaket für alle, die daran interessiert sind, CRISPR-basierte Gentranskriptreduktion in Fruchtfliegen zu verwenden und gleichzeitig mit weiterer Anpassung und Optimierung kompatibel zu sein. Um ein allgegenwärtiges In-vivo-RNA-Targeting mit einem Zwei-Komponenten-CasRx-System einzurichten, sammeln Sie 10 jungfräuliche erwachsene weibliche Fliegen aus der homozygoten gRNA-Linie von Interesse und fünf erwachsene männliche Fliegen aus dem ausgewogenen heterozygoten Ubiq CasRx CurlyO.Legen Sie die Elternfliegen in eine Durchstechflasche, die mit 100 Mikrogramm Trockenhefepulver ergänzt wird, und ziehen Sie die Fläschchen 48 Stunden bei 26 Grad Celsius auf. Beobachten Sie die Fläschchen jeden Tag, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus dem Schamhaar der F1-Generation hervorgegangen sind, und betäuben Sie jeden Erwachsenen 10 Sekunden lang mit Kohlendioxid. Sobald die Fliegen unbeweglich werden, leeren Sie das Fläschchen auf ein Fliegenpolster, das mit dem Kohlendioxidtank mit kontinuierlichem Kohlendioxid verbunden ist, und verwenden Sie eine Farbkamera, die mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop verbunden ist, um die Phänotypen der Fliegen zu bewerten und abzubilden.Zählen Sie dann die Anzahl der Nachkommen mit verschiedenen Phänotypen entsprechend der fluoreszierenden Signalexpression. Basierend auf der Mendelschen Genetik wird erwartet, dass 50% der Nachkommen die Ziel-RNA exprimieren. Beachten Sie, dass die Toxizität des Ubiq CasRx-Systems das Verhältnis der zielgerichteten RNA, die Nachkommen exprimiert, auf weniger als 50% reduzieren kann. Um ein allgegenwärtiges in vivo exogenes RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-System einzurichten, sammeln Sie acht bis 10 virgin adulte weibliche Fliegen aus einer dualen Luciferase-Exprimationslinie und vier bis fünf erwachsene männliche Fliegen aus dem ausgewogenen heterozygoten Ubiq CasRx Curly plus TM6. STB-Linie, die gleichzeitig weiße Augen, lockige Flügel und ds rote Fluoreszenz aufweist.Legen Sie den elterlichen Schritt eins cross-by in eine Durchstechflasche, die mit 100 Mikrogramm Trockenhefepulver ergänzt wird, und ziehen Sie dieses Kreuz für 48 Stunden bei 26 Grad Celsius auf. Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle Elternfliegen aus jeder Durchstechflasche und bringen Sie die Fläschchen für mindestens 14 Tage in den 26 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Im Laufe von 14 Tagen, wie bereits erwähnt, sammeln Sie acht bis 10 weibliche Jungfrauen aus der homozygoten Glühwürmchen-Luciferase, die dreimal auf die gRNA-Linie abzielt.Beobachten Sie jeden Tag die Schritt-eins-Durchstechflaschen, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus den Puppen hervorgegangen sind, die mit Kohlendioxid betäubt werden, um die Sammlung von vier bis fünf männlichen Fliegen zu ermöglichen, die sowohl den Ubiq CasRx als auch den dualen Luciferase-Reporter als verfügbar ausdrücken. Legen Sie die Fliegen in eine neue Durchstechflasche mit 10 Virgin-Weibchen aus der Fruchtfliegen-Luciferase,die auf die gRNA-Linie abzielt, und platzieren Sie diese Schritt-zwei-Kreuze bei 26 Grad Celsius für 48 Stunden. Sammeln Sie weitere fünf einen Tag alte Männchen, die sowohl den Ubiq CasRx als auch den Dual-Luciferase-Reporter aus dem Schritt-eins-Kreuzfläschchen ausdrücken, und inkubieren Sie die Fliegen für zwei bis vier Tage allein bei 26 Grad Celsius, bevor Sie sie in eine 1,5-Milliliter-Zentrifuge für minus 80 Grad Celsius übertragen.Entfernen Sie am Ende der Inkubation alle elterlichen Fläschchen von jedem der beiden Kreuzfläschchen der Stufe zwei. Und geben Sie die Fläschchen für mindestens 20 Tage in den 26 Grad Celsius heißen Inkubator zurück. Beobachten Sie jeden Tag die Schritt-Zwei-Kreuzfläschchen, um zu sehen, ob neue erwachsene Nachkommen aus dem Schambein hervorgegangen sind, betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid, sobald sie verfügbar sind, und bewerten und bilden Sie ihre Phänotypen ab, wie gezeigt.Die Mendelsche Genetik legt nahe, dass, wenn alle Fliegen lebensfähig sind, 25% der Nachkommen die Ziel-RNA exprimieren sollten. Um einen Luciferase-Assay durchzuführen, erzeugen Sie die dreifach trans heterozygoten Fliegen sowie die Kontrollfliegen wie demonstriert. Sammeln Sie die männlichen Fliegen bei der Geburt und altern Sie sie bis zum Alter von drei Tagen.Übertragen Sie die drei Tage alten Fliegen in 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen und lysieren Sie sie mit einem Puffer im Luciferase-Lysepuffer aus einem handelsüblichen Luciferase-Assay-Kit. Verwenden Sie dann fünf Mikroliter lysiertes Gewebe aus jeder Probe und jedem Luminometer, um sowohl die Fruchtfliegen als auch die Luciferase-Aktivität gemäß den Standard-Luciferase-Assay-Protokollen zu messen. F1, trans heterozygotes CasRx, haben signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu trans heterozygoten dCasRx-Fliegen.Die U6 gRNA Y heterozygoten Fliegen bestätigen die Toxizität des Ubiq CasRx-Systems der drei Zielgene und sind nicht lebensfähig und wachsen nicht über das zweite Larvenstadium hinaus. Die überlebenden Ubq CasRx und U6 gRNA W heterozygoten Fliegen zeigen einen ausgeprägten vollständig durchdringenden Phänotyp mit großen Augen. Darüber hinaus wird auch eine signifikante Reduktion der Zielgentranskripte für drei Zielgene beobachtet.Hinweise auf eine durch CasRx induzierte Off-Target-Aktivität werden auch beobachtet, wenn differentiell exprimierte Transkripte zwischen Proben von CasRx-exprimierenden Fliegen und Proben von dCasRx-exprimierenden Fliegen verglichen werden. Im Zwei-Stufen-Kreuz führt nur die Kombination aller drei Trans-Gene zu einer 100%igen Letalität. Wenn gewebespezifisches RNA-Targeting mit einem Drei-Komponenten-CasRx-Systemdesign verwendet wird, wird das Toxizitätsniveau reduziert, wenn die Gesamtex-CasRx-Expression mit dem UAST-Promotor im Vergleich zu der des Ubiq-Promotors gesenkt wird.Es ist wichtig, den genetischen Prozess mit Fliegen des richtigen Geschlechts und korrekter Phänotypen richtig einzurichten.

ubiquitous-tissue-specific-rna-targeting-drosophila-melanogaster

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

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Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

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