Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Unser Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und zuverlässige Methode, um direkte primäre intestinale Epithelmonoschichten auf verschiedenen Oberflächen mit minimalen Trümmern zu erzeugen. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind der geringe Medienverbrauch und die geringe Wartung der Zellkultur. Es ist eine schnelle Methode, um Funktionstests und schnelle nachgelagerte Anwendungen durchzuführen.

Dieses Protokoll wird Einblicke in die Untersuchung der Wundreparatur, der Permeabilitätsbarriere und der transepithelialen Migration verschiedener Zelltypen geben. Dieses Modell kann auch bei der Wirt-Pathogen-Interaktion, bei der Schädigung des Epithels und bei der Wirkstoffforschung nützlich sein. Fügen Sie zunächst 200 Mikroliter Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte und eines Kammerschlittens hinzu.

Beides in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden vorbebrüten. 0,4 Mikrometer Zellmembraneinsätze mit 200 Mikrolitern Kollagenlösung beschichten. Inkubieren Sie die Platte mit den Membraneinsätzen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten und geben Sie sie dann für zwei Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Desinfizieren Sie eine eingeschläferte Maus mit 70% Ethanol und sezieren Sie dann den Dickdarm vom Rektum bis zum Blinddarm mit Hilfe von Schere und Zette. Spülen Sie den Kot vorsichtig mit eiskaltem PBS in einer 10-Milliliter-Spritze aus, die mit einem 20-Gauge-Ernährungsröhrchen ausgestattet ist. Entfernen Sie den proximalen Dickdarm und schieben Sie den distalen Dickdarm vorsichtig auf die 20-Gauge-Ernährungssonde.

Binden Sie den Dickdarm am Ende des Rohres mit 4-0 Seidennähtfaden. Kehren Sie den Dickdarm von innen nach außen über das gebundene Ende und binden Sie das andere Ende mit einem Faden, dann schneiden Sie den Dickdarm unterhalb der Spitze der Ernährungssonde mit einer chirurgischen Schere. Öffnen Sie vorsichtig das ungebundene Ende des invertierten Dickdarms mit dem Kolben auf die Spitze einer 1,25-Milliliter-Wiederholungsspritze.

Schieben Sie das ungebundene Ende des umgekehrten Dickdarms auf die Spritze und binden Sie es fest mit einem Faden. Führen Sie den Kolben in die Spritze ein und blasen Sie den Dickdarm auf, bis er turgent aussieht und keine sichtbaren Falten hat. Legen Sie die aufgeblasene Darmwurst in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern Zellrückgewinnungslösung für 20 Minuten auf Eis.

Blasen Sie den Dickdarm einmal alle fünf Minuten auf und entleeren Sie sie. Binden Sie den aufgeblasenen Dickdarm unterhalb der Spitze der Wiederholungsspritze mit einem 4-0 Seidennähtfaden ab. Schneiden Sie die Darmwurst von der Wiederholungsspritze ab und legen Sie sie 40 Minuten lang in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern 50 Millimolar-EDTA.

Drehen Sie das Rohr bei vier Grad Celsius. Ersetzen Sie die EDTA-Lösung durch fünf Milliliter Shake-Puffer und schütteln Sie die Wurst manuell in vertikaler Position für zwei Minuten. Dekantieren Sie die Schüttellösung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und wiederholen Sie den Schüttelschritt, bis insgesamt 10 Milliliter Krypten und Schüttelpuffer gesammelt sind.

Zählen Sie die Anzahl der Krypten in 20 Mikrolitern der Suspension unter einem Mikroskop und verdünnen Sie die Probe, um die Konzentration von fünf Krypten pro Mikroliter zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Kryptenprobe bei 400 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. In der Zwischenzeit die 48-Well-Platten- und Membraneinsätze aus dem Inkubator entfernen und in die Biosicherheitswerkbank legen.

Saugen Sie die Beschichtungslösung mit einer P200-Pipette an und lassen Sie die Platte mit dem Deckel leicht versetzt, bis die Zellen bereit sind, plattiert zu werden. Nach der Zentrifugation der Kryptensuspension den Schüttelpuffer entfernen und das intakte Pellet in drei Milliliter LWRN-Komplettmedien wieder auffüllen. Fügen Sie 200 Mikroliter Krypten zu jeder Vertiefung der vorbeschichteten 48-Well-Platte und des Kammerschlittens hinzu und inkubieren Sie beide in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag saugen Sie die Medien an und fügen Sie frische Medien hinzu. Im Allgemeinen konfluieren die Zellen in 24 bis 48 Stunden. Für Zellkulturmembraneinsätze fügen Sie 200 Mikroliter Krypten an der Oberseite der Einsätze und 600 Mikroliter kompletter LWRN-Medien an der Unterseite hinzu.

Am nächsten Tag das Medium absaugen und frisches Medium nur in die obere Kammer geben. Inkubieren Sie die Platte in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Messen Sie jeden Tag den transepithelialen elektrischen Widerstand mit einem epithelialen Volt / Ohm-Meter.

Nach der Isolierung der Krypten von einem murinen Dickdarm und der Überprüfung der Konzentration wurde die Kryptensuspension auf fünf Krypten pro Mikroliter konzentriert. 48-Well-Plattenbrunnen wurden einem Kratzwunde-Assay unterzogen, als sie den Zellkonfluenz erreichten. Nach 24 Stunden wurde eine Wundreparatur beobachtet, die darauf hindeutet, dass die Kultur gesund und lebensfähig war.

Höhere Stufenwerte wurden erreicht, wenn Medien von LWRN auf Differenzierungsmedien umgestellt wurden. Auch eine Abnahme der ISC-Marker und eine Zunahme der Differenzierungsmarker wurden beobachtet, was darauf hindeutet, dass die differenzierten Monoschichten erfolgreich erzeugt wurden. Darüber hinaus wurde das Auftreten von Subtypen differenzierter Epithelzellen, die unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet wurden, durch Immunfluoreszenz gezeigt.

Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig sicherzustellen, dass der Dickdarm zu keinem Zeitpunkt während der Vorbereitung gerissen wird und aufgeblasen bleibt, um Krypten in extrem sauberer Vorbereitung freizusetzen. Sobald sich die Monoschichten der 2D-Darmepithelzellen bilden, können wir Immunfluoreszenz-, Kratzwunde- und Permeabilitätstests und andere nachgelagerte Anwendungen durchführen. Dies wird Wissen über Wundheilung, Migration verschiedener Zelltypen und Epithelreparatur- und Schadensstudien liefern.