Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Dieses Methodenvideo stellt die entscheidenden Schritte der Immunfärbungs- und Chromatin-Immunpräzipitationsprotokolle vor, die regelmäßig verwendet werden, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren. Diese Technik bietet den Forschern leistungsfähige Werkzeuge, um neuartige Proteine zu identifizieren, die an den beschädigten genomischen Locus gebunden sind, sowie ihre post-translationalen Modifikationen, die für die fein abgestimmte Regulation während der DNA-Reparatur notwendig sind. Da diese Techniken zur Untersuchung verschiedener zellulärer Prozesse eingesetzt werden können, haben sie potenzielle Relevanz, wenn eine Lasermikrostrahlung oder die kernbasierte DNA-schädigenden induzierenden Systeme verwendet werden.

In jüngster Zeit wurden mehrere leistungsstarke Werkzeuge entwickelt, um ortsspezifische DNA-Schäden zu induzieren, die verwendet werden können, um unser Verständnis der DNA-Reparatur zu erweitern. Unter Anwendung biochemischer und genetischer Ansätze sind diese Utensilien unerlässlich, um zelluläre Ereignisse aufzudecken, die mit der Rekrutierung und Montage von DNA-Reparaturkomplexen an der Stelle von DNA-Schäden verbunden sind. Darüber hinaus ermöglichen diese Techniken die Untersuchung dieser Prozesse bei Einzelzellauflösung sowohl mit festen als auch mit lebenden Zellen.

Halten Sie U2OS-Zellen in Monoschichten in DMEM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 Millimolarglutamin und der 1% antibiotisch-antimykotischen Lösung. Züchten Sie Zellen in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung bei 37 Grad, bis 80% Konfluenz erreicht ist, wobei das Medium alle zwei bis drei Tage erneuert wird. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die Zellen mit PBS.

Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung lösen. Wenn sich die Zellen lösen, stoppen Sie die Aktivität des Trypsins, indem Sie den Zellen Nährmedien hinzufügen, wodurch eine Zellsuspension erhalten wird. Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer.

Platte 20.000 Zellen pro Milliliter pro Vertiefung auf der 24-Well-Platte mit steriler 12-Millimeter-Rundabdeckung schlüpft in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung, damit die Befestigung auf der Abdeckung rutscht. Behandeln Sie die Zellen mit 10 Nanogramm pro Milliliter Neocarzinostatin oder verwenden Sie die entsprechende Methode, um Doppelstrangbrüche über endonukleusebasierte Systeme zu induzieren.

Inkubieren Sie die Zellen für ein bis acht Stunden bei 37 Grad in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-Umgebung, um der Kinetik der DNA-Reparatur zu folgen. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd PBS-Lösung für 20 Minuten bei 25 Grad. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für jeweils fünf Minuten.

Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 0,2% Triton X in PBS gelöst hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 20 Minuten. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.

Blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 5% BSA verdünnt in BSA-PBST und inkubieren Sie die Proben für mindestens 20 Minuten. Fügen Sie die richtige Menge an primärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST-Lösung verdünnt ist. Legen Sie jeden Deckzettel kopfüber auf einen Parafilm oder einen 10-Mikroliter-Tröpfchen des verdünnten Antikörpers.

Inkubieren Sie die Proben in einer Feuchtigkeitskammer für eineinhalb Stunden bei vier Grad. Legen Sie die Seitwärtsrutsche wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Fügen Sie die richtige Menge an sekundärem Antikörper hinzu, der in 1% BSA-PBST verdünnt ist.

Legen Sie jeden Deckelrutsch kopfüber auf den Parafilm über einen 10-Mikroliter-Tropfen des verdünnten Antikörpers. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einer Feuchtigkeitskammer bei vier Grad. Legen Sie die Abdecklappen wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.

Vor dem Entfernen der letzten PBS-Waschlösung die Deckelrutsche vorsichtig mit der Hälfte der Pinzette und der Nadel herausnehmen und dann kopfüber mit Tröpfchen Des Montagemediums auf die Glasträger legen. Die Chromatin-Immunpräzipitation ist eine weit verbreitete Technik, um Bindungsmuster von Proteinen an DNA zu identifizieren. Um die Belegung eines Wunschreparaturproteins um das DSB herum aufzudecken, wird ein spezifischer Antikörper verwendet, um das interessierende Protein aus dem Chromatinpräparat zusammen mit der DNA-Region, an die es gebunden ist, zu immunpräzipieren.

Darüber hinaus wurde ChIP häufig angewendet, um das Vorhandensein spezifischer post translationaler Modifikationen bei der Verwendung durch DSBs an einem bestimmten genomischen Ort abzubilden. Ungefähr 20 Millionen Zellen pro Milliliter sollten in einer 15 Zentimeter großen Schale für jede Probe kultiviert werden. Kulturmedium entfernen und die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS waschen.

Fixieren Sie die Zellen mit 1% Formaldehyd-PBS-Lösung. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler und rühren Sie 20 Minuten lang sanft. Stoppen Sie die Fixierung mit Glycin, um eine Endkonzentration von 125 Millimolar zu erreichen, und inkubieren Sie auf einem Orbiter-Shaker mit sanftem Rühren für fünf Minuten bei 25 Grad.

Legen Sie den Teller auf Eis und waschen Sie ihn zweimal mit eiskaltem PBS. Kratzen Sie die Zellen in eiskaltem PBS ab und übertragen Sie sie in 15 Milliliter konische Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 5.000 U / min für fünf Minuten bei vier Grad.

Den Überstand vorsichtig absaugen und das Pellet in zwei Milliliter Zelllysepuffern wieder aufsaugen und 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifuge bei 5.000 U/min für fünf Minuten bei vier Grad. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in 500 bis 1.500 Mikroliter Kernlysepuffer und inkubieren Sie es 30 bis 60 Minuten auf Eis.

Das Lysat wird in ein konisches Polystyrolrohr überführen, das für die Beschallung geeignet ist. Beschallen Sie das Lysat, um die DNA auf eine durchschnittliche Fragmentgröße von 300 bis 1000 Basenpaaren zu scheren. Bereiten Sie Dynabeads für die Vorreinigungs- und Immunpräzipitationsschritte vor.

Perlen zweimal für 10 Minuten bei vier Grad mit RIPA-Puffer waschen. Verwenden Sie Dynabeads in demselben RIPA-Puffervolumen, das Sie in Schritt 3.1 aus der ursprünglichen Stammlösung entnommen haben. Vorklarieren Sie 25 bis 30 Mikrogramm Chromatin jeder Probe mit vier Mikroliter-Dynabeads durch Rotation für ein bis zwei Stunden bei vier Grad.

Die Dynabeads mit einem Magneten ausfällen und den Überstand in ein neues Eppendorf-Rohr überführen. Fügen Sie die entsprechende Menge an Antikörper zu jeder Chromatinprobe hinzu und drehen Sie sich über Nacht um vier Grad. Am nächsten Tag fügen Sie 40 Mikroliter gewaschene Dynabeads zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht, drehen Sie sie um vier Grad.

Einmal mit 300 Mikroliter niedrigem Salzpuffer für 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen. Einmal mit 300 Mikroliter hohem Salzpuffer für 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen. Einmal mit 300 Mikroliter Lithiumchloridpuffer 10 Minuten mit Drehung bei vier Grad waschen.

Zweimal mit 300 Mikroliter TE für 10 Minuten waschen, wobei die erste Wäsche bei vier Grad und die zweite Wäsche bei 25 Grad rotieren sollte. Fügen Sie den Perlen 200 Mikroliter Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie sie bei 65 Grad in einem Thermoschüttler für 15 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln. Den Überstand in ein neues Röhrchen geben und die Perlen in 200 Mikroliter Elutionspuffer erneut eluieren.

Fügen Sie 500 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase-K und ein halbes Prozent SDS hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad für zwei Stunden. Führen Sie eine Chloroformextraktion durch und übertragen Sie die obere wässrige Phase auf ein neues Eppendorf-Rohr. Fügen Sie zweieinhalb Volumina absolutes Ethanol und 0,1 Volumen drei molare Natriumacetat pH 5,2 hinzu.

Mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad inkubieren. Ethanol entfernen und Pellet an der Luft trocknen. Resuspend das Pellet in 50 Mikroliter TE. Um ihre spezielle Verteilung auf DNA zu untersuchen, sollte die Chromatin-Immunpräzipitation angewendet werden.

Ein typisches experimentelles Ergebnis von ChIP-qPCR ist in dieser Abbildung dargestellt, das die zeitliche Anreicherung von Gamma-Histon AX als Reaktion auf I-PpoI-induzierte induzierte DNA-Schäden zeigt. Im linken Teil des Bildes wird das rechtzeitig detektierte Gamma-Histon-AX-Signal auf der Bruchseite gezeigt, während im rechten Teil die Gamma-Histon-AX-Verteilung an der Kontrollgenregion dargestellt wird, bei der nachgewiesene Brüche nicht induziert wurden. Obwohl die DNA-Reparatur ein relativ neues Forschungsgebiet ist, nimmt unser Wissen mit Hilfe biochemischer und mikroskopischer Methoden rapide zu.

Nichtsdestotrotz erfordern biochemische Techniken wie ein Western Blot, Immunpräzipitation und Massenspektrometrie eine große Anzahl von Zellen. Die Reparaturprozesse der Studie stellen eine Momentaufnahme der gewünschten Zellpopulation dar. Das mikroskopische Feld wurde durch hochauflösende Techniken wie das hochauflösende Mikroskop revolutioniert, das die Visualisierung von DNA-schädigend induzierten zellulären Prozessen auf nukleosomaler Ebene sowie die genaue Kartierung der Protein-Colokalisierung ermöglicht.

Auf der anderen Seite ist die Chromatin-Immunpräzipitation ein leistungsfähiges Werkzeug, insbesondere durch die Kombination mit Sequenzierungsmethoden, um ihr genomweites Bindungsmuster eines gewünschten DNA-Reparaturproteins und Doppelstrangbrüche in einer Chromatin- oder Heterochromatin-Region zu visualisieren.