Name: Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Lernen Sie fluoreszenzbasierte Methoden zur Messung des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen mittels Osh6p. Diese Technik ermöglicht präzise quantifizierbare Einblicke in Lipidtransferkinetik.

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Wir danken Dr. A. Cuttriss für ihr sorgfältiges Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird durch den Zuschuss der französischen Nationalen Forschungsagentur ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) und durch das CNRS finanziert.

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte vorliegen.

Die Ergebnisse dieser Assays hängen direkt von den Signalen der fluoreszierenden Lipidsensoren ab. Daher ist die Reinigung dieser Sonden, die im Verhältnis 1:1 mit NBD und ohne freie NBD-Fluorophorkontamination markiert sind, ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Es ist auch obligatorisch zu überprüfen, ob das zu untersuchende LTP ordnungsgemäß gefaltet und nicht aggregiert ist. Die Menge an LTP, die in den Extraktionsassays getestet wurde, muss gleich oder höher als die von zugänglichen PS- oder PI(4)P-Molekülen s...

Die genaue Verteilung der Lipide zwischen verschiedenen Membranen und innerhalb der Membranen eukaryotischer Zellen1,2 hat tiefgreifende biologische Implikationen. Die Entschlüsselung der Funktionsweise von LTPs ist ein wichtiges Thema in der Zellbiologie3,4,5,6, und In-vitro-Ansätze sind von großem Wert, um dieses Problem anzugehen7,8,9,10,11. Hier wird eine in vitro, fluoreszenzbasierte Strategie vorgestellt, die maßgeblich dazu beigetragen hat, dass mehrere ORP/Osh-Proteine den PS/PI(4)P-Austausch zwischen Zellmembranen12 bewirken und damit eine neue Klasse von LTPs darstellen. PS ist ein anionisches Glycerophospholipid, das 2-10% der gesamten Membranlipide in eukaryotischen Zellen ausmacht13,14,16. Es ist entlang eines Gradienten zwischen dem ER und dem PM verteilt, wo es 5-7% und bis zu 30% der Glycerophospholipide bzw.17,18,19darstellt. Darüber hinaus ist PS im Wesentlichen in der zytosolischen Packungsbeilage des PM konzentriert. Dieser Aufbau und die ungleichmäßige Aufteilung von PS im PM sind entscheidend für zelluläre Signalisierungsprozesse19. Aufgrund der negativen Ladung von PS-Molekülen ist das zytosolische Blättchen des PM viel anionischer als das zytosolische Blättchen anderer Organellen1,2,19,20. Dies ermöglicht die Rekrutierung von Signalproteinen wie myristoyliertem Alanin-reichem C-Kinase-Substrat (MARCKS)21, Sarkom (Src)22, Kirsten-Ratten-Sarkom-Viralonkogen (K-Ras)23und Ras-verwandtem C3-Botulinumtoxin-Substrat 1 (Rac1)24, die einen Abschnitt positiv geladener Aminosäuren und einen lipidischen Schwanz enthalten.
PS wird auch von der herkömmlichen Proteinkinase C stereoselektiv über eine C2-Domäne25erkannt. PS wird jedoch im ER26synthetisiert, was darauf hinweist, dass es in den PM exportiert werden muss, bevor es seine Rolle spielen kann. Es war nicht bekannt, wie dies erreicht wurde19 bis zu der Feststellung, dass in Hefe, Osh6p und Osh7p PS von der Notaufnahme auf die PM27übertragen. Diese LTPs gehören zu einer evolutionär konservierten Familie in Eukaryoten, deren Gründungsmitglied OSBP ist und die Proteine (ORPs im Menschen, Osch-Proteine in Hefe) enthält, die eine OSBP-verwandte Domäne (ORD) mit einer Tasche integrieren, um ein Lipidmolekül zu beherbergen. Osh6p und Osh7p bestehen nur aus einem ORD, dessen strukturelle Merkmale angepasst sind, um PS spezifisch zu binden und zwischen Membranen zu übertragen. Dennoch war unklar, wie diese Proteine PS richtungsweisend von der ER auf die PM übertragen. Osh6p und Osh7p können PI(4)P als alternativen Lipidliganden12einfangen. In Hefe wird PI(4)P aus Phosphatidylinositol (PI) im Golgi und im PM durch PI 4-Kinasen, Pik1p bzw. Stt4p synthetisiert. Im Gegensatz dazu gibt es kein PI(4)P in der ER-Membran, da dieses Lipid durch die Sac1p-Phosphatase zu PI hydrolysiert wird. Daher existiert sowohl an der ER/Golgi- als auch an der ER/PM-Schnittstelle ein PI(4)P-Gradient. Osh6p und Osh7p übertragen PS von der ER zum PM über PS/PI(4)P-Austauschzyklen unter Verwendung des PI(4)P-Gradienten, der zwischen diesen beiden Membranen besteht12.
Innerhalb eines Zyklus extrahiert Osh6p PS aus der ER, tauscht PS gegen PI(4)P am PM aus und überträgt PI(4)P zurück in die ER, um ein anderes PS-Molekül zu extrahieren. Osh6p/Osh7p interagieren mit Ist2p28, einem der wenigen Proteine, die die ER-Membran und das PM in unmittelbarer Nähe zueinander verbinden und bringen, um ER-PM-Kontaktstellen in Hefe29,30,31zu erzeugen . Darüber hinaus wird die Assoziation von Osh6p mit negativ geladenen Membranen schwach, sobald das Protein einen seiner Lipidliganden aufgrund einer Konformationsänderung extrahiert, die seine elektrostatischen Eigenschaften modifiziert32. Dies unterstützt Osh6p, indem es die Verweilzeit seiner Membran verkürzt und dadurch die Effizienz seiner Lipidtransferaktivität aufrechterhält. In Kombination mit der Bindung an Ist2p könnte dieser Mechanismus es Osh6p/7p ermöglichen, den Lipidaustausch an der ER/PM-Schnittstelle schnell und präzise auszuführen. In menschlichen Zellen führen ORP5- und ORP8-Proteine den PS/PI(4)P-Austausch an ER-PM-Kontaktstellen über unterschiedliche Mechanismenaus 33. Sie haben eine zentrale ORD, ähnlich Osh6p, sind aber über ein C-terminales Transmembransegment33 direkt an der ER verankert und docken über eine N-terminale Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne, die PI(4)P und PI(4,5)P233,34, 35erkennt,an den PM an. ORP5/8 verwendet PI(4)P zur Übertragung von PS, und es wurde gezeigt, dass ORP5/8 zusätzlich PM PI(4,5)P2-Pegel reguliert und vermutlich Signalwege moduliert. Im Gegenzug senkt eine Abnahme der PI(4)P- und PI(4,5)P2-Spiegel die ORP5/ORP8-Aktivität, da diese Proteine PIP-abhängig mit dem PM assoziiert werden. Eine ungewöhnlich hohe PS-Synthese, die zum Lenz-Majewski-Syndrom führt, beeinflusst die PI(4)P-Spiegel durch ORP5/836. Wenn die Aktivität beider Proteine blockiert wird, wird PS am PM weniger reichlich, was die onkogene Fähigkeit von Signalproteinen verringert37.
Umgekehrt scheint die ORP5-Überexpression die Invasion von Krebszellen und metastatische Prozesse zu fördern38. So können Veränderungen der ORP5/8-Aktivität das zelluläre Verhalten durch Veränderungen der Lipid-Homöostase stark verändern. Darüber hinaus besetzen ORP5 und ORP8 ER-Mitochondrien-Kontaktstellen und erhalten einige mitochondriale Funktionen, möglicherweise durch die Versorgung mit PS39. Darüber hinaus lokalisiert ORP5 auf ER-Lipid-Tröpfchenkontaktstellen, um PS an Lipidtröpfchen per PS/PI(4)P-Austausch40zu liefern. Die hierin beschriebene Strategie zur Messung (i) der PS- und PI(4)P-Extraktion aus Liposomen und (ii) des PS- und PI(4)P-Transports zwischen Liposomen wurde entwickelt, um die PS/PI(4)P-Austauschaktivität von Osh6p/Osh7p12,32 zu ermitteln und zu analysieren, und von anderen Gruppen zur Analyse der Aktivität von ORP5/ORP835 und anderen LTPs10verwendet. ( 41) DER PRÄSIDENT. - Nach der 41 Es basiert auf der Verwendung eines Fluoreszenzplattenlesers, eines Standard-L-Format-Spektrofluorometers und zweier Fluoreszenzsensoren, NBD-C2Lact und NBD-PHFAPP, die PS bzw. PI(4)P detektieren können.
NBD-C2Lact entspricht der C2-Domäne des Glykoproteins Lactadherin, das überarbeitet wurde, um ein einzigartiges lösungsmittelexponiertes Cystein in der Nähe der vermuteten PS-Bindungsstelle aufzunehmen; ein polaritätsempfindliches NBD-Fluorophor (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) ist kovalent mit diesem Rückstand verknüpft (Abbildung 1A)12. Genauer gesagt wurde die C2-Domäne von Lactadherin (Bos taurus, UniProt: Q95114, Rückstände 270-427) in einen pGEX-4T3-Vektor geklont, der in Fusion mit Glutathion-S-Transferase (GST) in Escherichia coliexprimiert wird. DieC2-Lact-Sequenz wurde dann mutiert, um zwei lösungsmittelzugängliche Cysteinreste (C270, C427) durch Alaninreste zu ersetzen und einen Cysteinrest in eine Region nahe der mutmaßlichen PS-Bindungsstelle (H352C-Mutation) einzuführen, die anschließend mit N,N'-Dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)ethylendiamin (IANBD)12 markiert werden kann. Zwischen dem GST-Protein und dem N-Terminus der C2-Domäne befindet sich eine Spaltstelle für Thrombin. Ein großer Vorteil ist, dass diese Domäne PS selektiv in einer Ca2+-unabhängigen Weise im Gegensatz zu anderen bekannten C2-Domänen oder Anhang in A542erkennt. NBD-PHFAPP wird aus der PH-Domäne des humanen Vierphosphatadapterproteins 1 (FAPP1) abgeleitet, das überarbeitet wurde, um ein einzelnes lösungsmittelexponiertes Cystein zu enthalten, das mit einer NBD-Gruppe in der Nähe der PI(4)P-Bindungsstelle markiert werden kann (Abbildung 1A)43. Die Nukleotidsequenz der PH-Domäne des humanen FAPP-Proteins (UniProt: Q9HB20, Segment [1-100]) wurde in einen pGEX-4T3-Vektor geklont, der zusammen mit einem GST-Tag exprimiert wird. DiePH-FAPP-Sequenz wurde modifiziert, um einen einzigartigen Cysteinrest in die membranbindende Grenzfläche des Proteins43einzufügen. Darüber hinaus wurde ein Linker mit neun Rückständen zwischen der Thrombinspaltungsstelle und dem N-Terminus der PH-Domäne eingeführt, um den Zugang zur Protease zu gewährleisten.
Um die PS-Extraktion aus Liposomen zu messen, wird NBD-C2Lact mit Liposomen aus Phosphatidylcholin (PC) gemischt, die Spuren von PS enthalten. Aufgrund seiner Affinität zu PS bindet dieses Konstrukt an die Liposomen, und das NBD-Fluorophor erfährt eine Polaritätsänderung, wenn es mit der hydrophoben Umgebung der Membran in Kontakt kommt, was eine Blauverschiebung und eine Erhöhung der Fluoreszenz hervorruft. Wenn PS fast vollständig durch eine stöchiometrische Menge an LTP extrahiert wird, assoziiert sich die Sonde nicht mit Liposomen und das NBD-Signal ist niedriger (Abbildung 1B)32. Dieser Signalunterschied wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein LTP(z. B. Osh6p) PS extrahiert. Eine ähnliche Strategie wird mit NBD-PHFAPP verwendet, um die PI(4)P-Extraktion zu messen (Abbildung 1B), wie zuvor12,32beschrieben. Zwei FRET-basierte Assays wurden entwickelt, um (i) den PS-Transport von LA- zuL-B-Liposomen, die die ER-Membran bzw. das PM nachahmen, und (ii) den PI(4)P-Transport in umgekehrter Richtung zu messen. Diese Assays werden unter den gleichen Bedingungen(d. h. gleiche Puffer-, Temperatur- und Lipidkonzentration) durchgeführt, um den PS/PI(4)P-Austausch zumessen. Zur Messung des PS-Transports wird NBD-C2Lact mitL-A-Liposomen gemischt, die aus PC bestehen und mit 5 mol% PS und 2 mol% eines fluoreszierenden Rhodamin-markierten Phosphatidylethanolamins (Rhod-PE)- und L B-Liposomen mit 5 mol% PI(4)P dotiert. 
Zum Zeitpunkt Null löscht FRET mit Rhod-PE die NBD-Fluoreszenz ab. Wird PS von LA zu LB Liposomen transportiert(z.B. bei Der Injektion von Osh6p), kommt es durch die Translokation von NBD-C2Lact Molekülen von LA zu LB Liposomen zu einem schnellen Dequenching (Abbildung 1C). Angesichts der Menge an zugänglichem PS bleibt NBD-C2Lact im Laufe des Experiments im Wesentlichen in einem membrangebundenen Zustand12. Somit korreliert die Intensität des NBD-Signals direkt mit der Verteilung von NBD-C2Lact zwischen LA und LB Liposomen und kann leicht normalisiert werden, um zu bestimmen, wie viel PS übertragen wird. Um den Transfer von PI(4)P in die entgegengesetzte Richtung zu messen, wird NBD-PHFAPP mit LA und LB Liposomen gemischt; Da es nur anL-B-Liposomen bindet, die PI(4)P enthalten, aber nicht an Rhod-PE, ist seine Fluoreszenz hoch. Wenn PI(4)P aufL-A-Liposomen übertragen wird, transloziert es sich in diese Liposomen, und das Signal nimmt aufgrund von FRET mit Rhod-PE ab (Abbildung 1C). Das Signal wird normalisiert, um zu bestimmen, wie viel PI(4)P übertragen wird43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-Cystein &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Bereiten Sie eine 10 mM L-Cystein-Stammlösung in Wasser vor. Aliquots werden bei -20 &deg gelagert; C</td></tr><tr><td>2 mL Braunes Fläschchen, PTFE/Rub Lnr, für die Lagerung von Lipiden in CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen mit 4 mm Durchmesser</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA-Reiniger</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 mit einem MWCO von 3 und 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie eine 50 mg/ml-Stammlösung mit gefiltertem und sterilisiertem Wasser vor und lagern Sie sie bei -20 & °C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Gold Kompetente Zellen</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/ml)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Lösen Sie 1 mg C16:0/C16:0-PI(4)P Pulver in 250 &; Mikro; L von MeOH und 250 &micro; L von CHCl3. Vervollständigen Sie dann mit CHCl3 auf 1 mL. Die Lösung muss klar werden.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/ml)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/ml)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Bereiten Sie 10 mM CaCl2 Stammlösung in Wasser vor.</td></tr><tr><td>Cell Disruptor</td><td>Constant Dynamics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Vollständiger EDTA-freier Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>deionisiertes (Milli-Q) Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid (DMF), wasserfrei, >99% rein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Rekombinant, RNAsefrei, in Pulverform</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>1 M DTT Stammlösung in Milli-Q Wasser herstellen. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C.</td></tr><tr><td>Econo-Pac Chromatographie-Säulen (1,5 & 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor Ti45 und Ti45</td><td>Röhrchen Beckman</td><td>Spinnen der Batzeriallysate</td><td></td></tr><tr><td>Glasspritzen (10, 25 und 50 & Mikro) L) für das Fluoreszenzexperiment</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasspritzen (25 , 100, 250, 500 und 1000 &micro; L) zur Handhabung von Lipid-Stammlösungen</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN Typ3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion Sepharose 4B Kügelchen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin (99% rein)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hämolyse-Röhrchen mit Kappe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, >99 % rein</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra NAP 10 Entsalzungssäule</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Bereiten Sie 1 M IPTG-Stammlösung in Milli-Qwater vor. Bereiten Sie 1 ml Aliquote vor und lagern Sie sie bei -20 °C.</td></tr><tr><td>K-Acetat</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Bouillonmedium ohne Glukose</td><td></td><td></td><td>Zubereitet mit Milli-Q-Wasser und autoklaviert.</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (MeOH) &ge; 99,8%</td><td>VWR</td><td>20847,24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Bereiten Sie eine 2 M MgCl2 Lösung vor. Filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,45 &μ; m Filter.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroplatte 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder mit zwei 1 mL gasdichten Hamilton</td><td>Spritzen Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Monochromator-basierter Fluoreszenzplatten-Reader</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimethyl-N-(Iodacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylendiamin) (IANBD Amide)</td><td>Molekulare Sonden</td><td></td><td>Lösen Sie 25 mg IANBD in 2,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und bereiten Sie 25 Aliquot von 100 & Mikro vor; L in 1,5 mL Schraubverschluss-Röhrchen. Schrauben Sie die Kappe nicht vollständig auf. Entfernen Sie dann DMSO in einem Gefriertrockner, um 1 mg trockenes IANBD pro Tube zu erhalten. Die Röhrchen werden verschlossen und bei -20 Grad gelagert; C im Dunkeln.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklaviert und bei 4 °C gelagert.</td></tr><tr><td>Birnenförmige Glaskolben (25 mL, 14/23, Duran-Glas)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plasmid</td><td></td><td></td><td>Auf Anfrage in unserem Labor</td></tr><tr><td>erhältlich pGEX-PHFAPP Plasmid</td><td></td><td></td><td>Auf Anfrage in unserem Labor erhältlich</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) &ge; 98,5 % (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Bereiten Sie eine 200 mM PMSF-Stammlösung in Isopropanol</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Filtern (19 mm Durchmesser) mit einer Porengröße von 0,2 & Mikro m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Chromatographiesäule (mit einem Bettvolumen von 0-2 mL und einem 10 mL Reservoir)</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Vorfilter (10 mm Durchmesser).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Konstruktion der 3D-Modelle der Proteine (Abbildung 1A)</td></tr><tr><td>Quarzküvette für UV/sichtbare Fluoreszenz (Mindestvolumen von 600 &μ; L)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quarzküvetten</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge&nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Büchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (1,5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleiner magnetischer PFTE-Rührstab (5 &; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss (0,5, 1 und 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO orange</td><td></td><td></td><td>Fluoreszenzfärbung zum Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE Gel</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THROMBIN, AUS MENSCHLICHEM PLASMA</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Lösen Sie 20 Einheiten in 1 mL Milli-Q-Wasser auf und bereiten Sie 25 & micro; L Aliquots in 0,5 mL Eppendorf Röhrchen. Dann einfrieren und bei -80 °C lagern.</td></tr><tr><td>Tris, ultrareines</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/sichtbares Absorptionsspektrophotometer</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/sichtbares Spektrofluorometer mit temperaturgesteuertem Küvettenhalter und Rührvorrichtung</td><td>Jasco oder Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 oder Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 Säule gepackt mit Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluoreszenzbasierte messungen des phosphatidylserin/phosphatidylinositol-4-phosphat-austauschs zwischen membranen

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Mehrere Mitglieder der evolutionär konservierten Oxysterol-bindenden Protein (OSBP)-verwandten Proteine (ORP) / OSBP-Homologe (Osch) Familie wurden kürzlich gefunden, um eine neuartige Lipidtransferprotein (LTP) Gruppe in Hefe und menschlichen Zellen darzustellen. Sie übertragen Phosphatidylserin (PS) aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über PS/Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI(4)P)-Austauschzyklen in die Plasmamembran (PM). Dieser Befund ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie PS, das für Signalprozesse entscheidend ist, in der Zelle verteilt ist, und die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen diesem Prozess und dem Phosphoinositidstoffwechsel (PIP). Die Entwicklung neuer fluoreszenzbasierter Protokolle war entscheidend für die Entdeckung und Charakterisierung dieses neuen zellulären Mechanismus in vitro auf molekularer Ebene. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung und den Einsatz von zwei fluoreszierend markierten Lipidsensoren, NBD-C2Lact und NBD-PHFAPP, um die Fähigkeit eines Proteins zu messen, PS oder PI(4)P zu extrahieren und diese Lipide zwischen künstlichen Membranen zu übertragen. Zunächst beschreibt das Protokoll, wie hochreine Proben dieser beiden Konstrukte produziert, etikettiert und erhalten werden. Zweitens wird in diesem Artikel erläutert, wie diese Sensoren mit einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser verwendet werden können, um festzustellen, ob ein Protein PS oder PI(4)P aus Liposomen extrahieren kann, wobei Osh6p als Fallstudie verwendet wird. Schließlich zeigt dieses Protokoll, wie die Kinetik des PS/PI(4)P-Austauschs zwischen Liposomen definierter Lipidzusammensetzung genau gemessen und die Lipidtransferraten durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) mit einem Standardfluorometer bestimmt werden können.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Abbildung 1: Beschreibung der fluoreszierenden Lipidsensoren und In-vitro-Assays. (A) Dreidimensionale Modelle von NBD-C2Lact und NBD-PHFAPP basierend auf der Kristallstruktur der C2-Domäne von Rinderlactadherin (PDB-ID: 3BN648) und der NMR-Struktur der PH-Domäne des menschlichen FAPP1-P...

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Diese Methode verwendet Fluoreszenz, um zu bestimmen, ob ein Proteintransfer auf biologisch wichtige Liqiden zwischen synthetischen Membranen und damit zur Verteilung dieser Lipide in eukaryotischen Zellen beiträgt. Diese Technik ermöglicht die Extraktion und den Transport eines natürlichen Lipids durch ein Protein, es benötigt und Fluoreszenzzellen und Liposomen, die einfach herzustellen sind. Diese Methode kann verwendet und modifiziert werden, um Einblicke in die Zellbiologie durch Proteine hinter der Verteilung einiger essentieller Lipide zwischen Organ und Membranen zu erhalten.Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um zu erklären, wie Echtzeitmessungen des Lipidtransfers durch Fluoreszenz durchgeführt werden können. So wird das Verfahren auch Maud Magdeleine, eine Ingenieurin für mein Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Zubereitung eines frischen gefilterten und entgasten HEPES-Kaliumacetatpuffers, der mit einem millimolaren Magnesiumchlorid ergänzt wird, um einen HKM-Puffer zu bilden.Bereiten Sie dann Liposomen nur aus PC vor oder zusätzlich mit zwei molaren Prozent PS oder PI(4)P dotiert. Legen Sie nun den Kolben auf einen Rotationsverdampfer, um das Lipid unte

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Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Dieses Protokoll stellt eine Fluoreszenzbildgebungsmethode vor, die eine Klasse von pH-empfindlichen Lipidfluorophoren verwendet, um den Lipidmembrantransport während der Zellexozytose und des Endozytosezyklus zu überwachen.

Messung des Membranlipidumsatzes mit dem pH-empfindlichen Fluoreszenz-Lipid-Analogon ND6

Dieses Protokoll beschreibt, wie die TIRF-Mikroskopie verwendet werden kann, um einzelne Ionenkanäle zu verfolgen und ihre Aktivität in geträgerten Lipidmembranen zu bestimmen, wodurch das Zusammenspiel zwischen lateraler Membranbewegung und Kanalfunktion definiert wird. Es beschreibt, wie die Membranen vorbereitet, die Daten aufgezeichnet und die Ergebnisse analysiert werden.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Wir beschreiben ein Verfahren zur Verwendung von Cyclodextrin, um den Austausch zwischen Lipiden der Plasmamembran und exogenen Lipiden zu vermitteln. Diese Technik kann mit Experimenten kombiniert werden, in denen Transmembranproteine untersucht werden, die sich in Lipid-Raft-ähnlichen Umgebungen anders verhalten als in nicht-Raft-ähnlichen Umgebungen.

Lipidaustausch-Assay in lebenden Zellen

Lernen Sie fluoreszenzbasierte Methoden zur Messung des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen mittels Osh6p. Diese Technik ermöglicht präzise quantifizierbare Einblicke in Lipidtransferkinetik.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

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