Name: Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die CLARITY-Gewebeklärung für Whole-Mount-Netzhäute zur hochauflösenden Immunfärbung retinaler Neuronen. Diese Methode ermöglicht dreidimensionale Bildgebung subzellulärer Strukturen.

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Wir danken Bing Ye, Nathan Spix und Hao Liu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) und den Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.) unterstützt.

Die Mauspflege und alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health für Labortiere durchgeführt und von den Institutional Animal Care and Use Committees der Oakland University genehmigt (Protokoll Nr. 18071).
HINWEIS: Die Namen der Lösungen und ihre Zusammensetzungen sind in Tabelle 1aufgeführt.
1. Gewebevorbereitung
<ol><li>Euthanisieren Sie die Maus mit einer Überdosis CO2, gefolgt von zervikaler Dislokation.</li>
	<li>Die Augen mit einer gekrümmten Zette verschließen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen (Tabelle 1). Unter einem Seziermikroskop mit einer Nadel ein kleines Loch entlang der Hornhaut-Sklera-Verbindung stechen. 1 Stunde lang auf 4% Paraformaldehyd (PFA) übertragen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Dissektionsschere, um den ganzen Weg um die Hornhaut-Sklera-Verbindung zu schneiden. Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie an der Basis des Sehnervs und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Zette ab, um die Netzhaut zu isolieren.</li>
	<li>Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie flach (GCL-Seite nach unten) in einer kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen, um die Netzhaut zu stabilisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Netzhaut mit einer Zette, um die Ecke des Nitrocellulosepapiers zu halten (ohne die montierte Netzhaut zu berühren) und legen Sie sie für 1 Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% PFA.</li>
	<li>Filterpapier und Netzhaut mit PBS in einen Brunnen geben und waschen (3x für je 5 min).</li>
	<li>Auf A4P0 (Tabelle 1) umstellen und über Nacht bei 4 °C unter sanftem Rühren inkubieren.</li>
	<li>Pipette Pflanzenöl in den Brunnen, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 °C für 3 Stunden ohne Schütteln.</li>
	<li>Waschen Sie (3x für jeweils 5 min) in PBS und stellen Sie sicher, dass das gesamte Öl abgespült wurde. Verwenden Sie bei Bedarf ein Pipett, um das verbleibende Öl vor dem letzten Spülen vorsichtig von der Oberseite des Bohrplatzes zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie in 10% SDS bei 40 °C für zwei Tage unter sanftem Schütteln. Ersetzen Sie SDS am zweiten Tag durch eine frische Lösung.</li>
	<li>Filterpapier und Netzhaut mit Triton-X-100 (PBST, Tabelle 1)auf PBS übertragen und waschen (5x für je 1,5 h).</li>
	<li>Bei 4 °C in PBST mit 0,01% Natriumazid(NaN3) lagernoder direkt zur Immunfärbung übergehen.</li>
</ol>2. Immunfärbung und Brechungsindex-Matching
<ol><li>Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBST abziehen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Netzhaut in primärem Antikörper (Tabelle 2) verdünnt in Blocklösung (Tabelle 1) für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln.</li>
	<li>Waschen (5x, je 1,5 h) in PBST.</li>
	<li>Mit den entsprechenden sekundären Antikörpern (Tabelle 3) in Blockierungslösung verdünnt für 2 Tage bei 40 °C unter sanftem Schütteln inkubieren und während des restlichen Verfahrens vor Licht schützen.</li>
	<li>Waschen (5x, je 1,5 h) in 0,02 M Phosphatpuffer (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Inkubieren Sie in Sorbit-basierter Refractive Index Matching Solution (sRIMS, siehe Tabelle 1)bei 40 °C über Nacht unter sanftem Schütteln.</li>
</ol>3. Montage
<ol><li>Umreißen Sie einen 18 mm x 18 mm x 1,5 mm großen Glasdeckel mit einem feinen Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren.</li>
	<li>Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikonfett auf der Vorderseite des Schlittens zu verfolgen, wobei ein kleiner Spalt in einer Ecke für überschüssige Montagelösung bleibt.</li>
	<li>Die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs übertragen und mit einem Feinspitzenpinsel so anordnen, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt.</li>
	<li>Pipette ca. 60 μL sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt, wobei darauf geachtet wird, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.</li>
	<li>Tragen Sie den Abdeckverschluss ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt, wodurch die Bildung von Luftblasen vermieden wird.</li>
	<li>Platzieren Sie einen Stapel von 3 Abdecklippen auf jeder Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Abdeckrutsch nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.</li>
	<li>Dias flach bei 4 °C bis zur Bildgebung aufbewahren.</li>
</ol>4. Bildgebung
<ol><li>Bildproben entweder auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (Materialverzeichnis). Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren. HINWEIS: Wenn ein invertiertes Objektivmikroskop verwendet wird, legen Sie den Objektträger kopfüber auf die Bühne und stellen Sie zunächst sicher, dass die exponierten Bereiche des Objektträgers frei von Silikonfett und Montagelösung sind.</li>
	<li>Um z-gestapelte Bilder von co-markierten Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.</li>
	<li>Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt festlegen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben.</li>
	<li>Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an.</li>
	<li>Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei sowie exportieren Sie sie als TIFF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format.</li>
</ol>5. Bildanalyse
<ol><li>Verwenden Sie die Bildanalysesoftware Ihrer Wahl (Table of Materials), um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch im 3-dimensionalen Rendering des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist. HINWEIS: Wenn die gewählte Schrittgröße ausreichend klein ist, kann auch eine 3D-Dekonvolution durchgeführt werden, um das Signal zu verbessern.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Modifikation des CLARITY-Protokolls für Ganzhaut. Wir haben das CLARITY-Protokoll vereinfacht, um eine angemessene Polymerisation zu erreichen, ohne dass eine Vakuumevakuierungs- oder Austrocknungskammer erforderlich ist, wie es in den meisten früheren Studien verwendet wird7,9,11. Der Polymerisationsprozess wird durch Sauerstoff gehemmt, so dass die Probe während des Polymerisationsschritts des Protokolls au...

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist vielleicht der zugänglichste Teil des zentralen Nervensystems (ZNS) und dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Entwicklung, Struktur und Funktion des Gehirns. Fünf Klassen von Neuronen in der Netzhaut sind in drei Kernschichten verteilt, die durch zwei plexiforme Schichten getrennt sind. Die äußere Kernschicht (ONL) besteht aus klassischen Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen), die Licht in elektrische Signale umwandeln. Elektrische Signale werden von Neuronen in der inneren Kernschicht (INL), einschließlich bipolarer, horizontaler und amakriner Zellen, verarbeitet und dann an retinale Ganglienzellen (RGCs) in der Ganglienzellschicht (GCL) übertragen. RGCs sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut, wobei die Axone auf das Gehirn projizieren, um zur bildbildenden und nicht bildbildenden visuellen Funktion beizutragen. Darüber hinaus versorgen drei Arten von Gliazellen (Müllerzellen, Astroglia und Mikroglia) Neuronen mit Nährstoffen und schützen Neuronen vor schädlichen Veränderungen in ihrer extrazellulären Umgebung.
Eine spezialisierte Subpopulation von amakrinen Zellen produziert und setzt Dopamin frei, einen wichtigen Neuromodulator im ZNS, der die neuronalen Schaltkreise der Netzhaut während der Lichtanpassung neu konfiguriert1,2. Dopaminerge Amakrinzellen (DACs) haben eine einzigartige Eigenschaft morphologischer Profile. Ihre Somata befinden sich im proximalen INL mit Dendriten, die sich im distalsten Teil der inneren plexiformen Schicht (IPL) verzweigen. Axonähnliche Prozesse von DACs sind unmyeliniert, dünn und lang, spärlich verzweigt und tragen Krampfadern (die Stellen der Dopaminfreisetzung). Sie bilden einen dichten Plexus mit Dendriten im IPL, einschließlich ringförmiger Strukturen um die Somata von AII-Amakrinzellen. Die Axone verlaufen auch durch das INL in Richtung OPL und bilden einen Zentrifugalweg über die Netzhaut3. Wir haben gezeigt, dass DAC-Prozesse Rezeptoren als Reaktion auf die Freisetzung von Glutamat aus präsynaptischen Neuronen, einschließlich bipolarer Zellen und intrinsisch lichtempfindlicher retinaler Ganglienzellen (ipRGCs)exprimieren 4,5,6. Es ist jedoch unklar, ob Glutamatrezeptoren auf die Axone, Dendriten oder beides exprimieren, da sie in vertikalen Netzhautabschnitten abgeschnitten sind und nicht voneinander unterschieden werden können5,6. Die Immunfärbung muss in ganzgedeckten Netzhäuten durchgeführt werden, um eine dreidimensionale Verzweigung von DACs und das Vorhandensein von Glutamatrezeptoren auf subzellulären Kompartimenten aufzudecken. Obwohl die Netzhaut relativ transparent ist, beträgt die Dicke einer Maus-Netzhaut etwa 200 μm, was das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe begrenzt und die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung aufgrund der Gewebelichtstreuung reduziert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir die immunstaining-kompatible Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY) angepasst, die kürzlich für dicke Hirnschnitte entwickelt wurde, um die Netzhaut der Maus ganz zu montieren7.
Die CLARITY-Methode wurde ursprünglich vom Deisseroth-Labor zur Immunfärbung und Bildgebung dicker Hirnproben entwickelt7. Es verwendet ein starkes Reinigungsmittel, Natriumdodecylsulfat (SDS) und Elektrophorese, um die Lipidkomponenten (die Gewebelichtstreuung verursachen) zu entfernen und die Proteine und Nukleinsäuren an Ort und Stelle zu lassen. Die entfernten Lipide werden durch ein transparentes Gerüst aus Hydrogelmonomeren wie Acrylamid ersetzt, um die verbleibende Proteinstruktur zu unterstützen. Das gereinigte Gewebe kann immunhistochemisch markiert und mit deutlich erhöhter Lichteindringtiefe durch das Gewebe (bis zu mehreren Millimeter unter der Gewebeoberfläche) abgebildet werden. Seitdem wurde die CLARITY-Methode von mehreren Forschungsgruppen 8 ,9,10optimiert und vereinfacht. Ein modifiziertes CLARITY-Protokoll verwendet eine passive Clearing-Technik, um die möglichen Gewebeschäden zu vermeiden, die durch Elektrophorese zur Beseitigung des gesamten Gehirns und anderer intakter Organe verursacht werden11. Diese Methode wurde jedoch noch nicht auf ganz montierte Netzhäute angewendet. Hier haben wir die passive CLARITY-Technik für Ganzkörper-Netzhäute angepasst, um sie für die Immunhistochemie und Bildgebung transparenter zu machen. Wir fanden heraus, dass ein Großteil der getesteten Netzhautproteine während dieses Prozesses für die Immunhistochemie erhalten blieb. Mit der Brechungsindex-Matching-Lösung konnten wir Netzhautneuronen über die etwa 200 μm Dicke von der ONL bis zur GCL in ganz montierten Netzhäuten abbilden.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>Hydrogel-Monomer</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td>Blockierungsmittel</td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Scanning konfokal Mikroskop</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bakteriostatisches Konservierungsmittel</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>Blockierungsmittel</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Entfettungsmittel</td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>Pufferkomponente</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Tensid</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Tensid</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>Thermischer Initiator</td></tr></tbody></table>

immunfärbung von whole-mount-netzhäuten mit der clarity tissue clearing methode

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Die Gewebehydrogel-Delipidationsmethode (CLARITY), die ursprünglich vom Deisseroth-Labor entwickelt wurde, wurde modifiziert und häufig für die Immunfärbung und Bildgebung dicker Gehirnproben verwendet. Diese fortschrittliche Technologie wurde jedoch noch nicht für ganz montierte Netzhäute verwendet. Obwohl die Netzhaut teilweise transparent ist, begrenzt ihre Dicke von etwa 200 μm (bei Mäusen) immer noch das Eindringen von Antikörpern in das tiefe Gewebe und reduziert die Lichtdurchdringung für hochauflösende Bildgebung. Hier haben wir die CLARITY-Methode für ganz montierte Maus-Netzhäute angepasst, indem wir sie mit einem Acrylamidmonomer zu einem nanoporösen Hydrogel polymerisiert und dann in Natriumdodecylsulfat räten, um den Proteinverlust zu minimieren und Gewebeschäden zu vermeiden. CLARITY-verarbeitete Netzhäute wurden mit Antikörpern für Netzhautneuronen, Gliazellen und synaptische Proteine immungefärbt, in einer Brechungsindex-Matching-Lösung montiert und abgebildet. Unsere Daten zeigen, dass CLARITY die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und Bildgebung für Netzhautneuronen und Gliazellen in der Ganzkörperpräparation verbessern kann. So wurde beispielsweise die 3D-Auflösung feiner axonartiger und dendritischer Strukturen dopaminerger Amakrinzellen durch CLARITY deutlich verbessert. Im Vergleich zu nicht verarbeiteten Ganzkörper-Netzhäuten kann CLARITY eine Immunfärbung für synaptische Proteine wie postsynaptisches Dichteprotein 95 aufdecken. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CLARITY die Netzhaut nach der Entfernung von Lipiden optisch transparenter macht und feine Strukturen von Netzhautneuronen und deren Proteinen bewahrt, die routinemäßig zur hochauflösenden Abbildung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen in der Ganzlagervorbereitung verwendet werden können.

Modifizierte CLARITY-verarbeitete Netzhäute sind optisch transparentes Gewebe. Um eine Gewebereinigungsmethode zu formulieren, die mit immunhistochemischen Anwendungen in der Netzhaut kompatibel ist und gleichzeitig eine ausreichende Entspeiung bietet und die strukturelle Integrität der zellulären Proteine beibehält, haben wir die CLARITY-Gewebereinigungsmethode an die Netzhaut von Mäusen angepasst. Wir konnten das Protokoll vereinfachen und für ganz montierte Netzhäute modifizieren (siehe Protokoll)....

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der feinen Morphologie von Netzhautneuronen und kann Einblicke in die zellulären und subzellulären morphologischen Veränderungen geben, die in Krankheitszuständen auftreten. Diese Methode verbessert die optische Transparenz der Netzhaut erheblich und ermöglicht hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung, Schaltkreisverdrahtung und feine subzelluläre Strukturen von Netzhautneuronen in der Hormonnetzhautvorbereitung. Die Mausaugen mit einer gekrümmten Zette auffüllen und in eine kleine Petrischale mit 0,1 M PBS überführen.Stechen Sie ein kleines Loch entlang der Hornhautsklera-Verbindung mit der Nadel unter dem Dissektionsmikroskop und übertragen Sie dann das Auge für eine Stunde in 4% Power-Formaldehyd. Übertragen Sie das Auge zurück auf eine Schüssel mit PBS. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine Dissektionsschere, um den gesamten Weg um die Hornhautübergang herum zu schneiden.Hornhaut und Linse entfernen. Schneiden Sie es dann an der Basis des Sehnervs ab und schälen Sie die Sklera vorsichtig mit einer Ziffe ab, um die Netzhaut zu isolieren. Machen Sie vier kleine Schnitte gleichmäßig um die Netzhaut und verwenden Sie eine feine Spitzenbürste, die in PBS getaucht ist, um sie mit flacher GCL-Seite in der kleeartigen Form auf einen kleinen quadratischen Schnitt aus Nitrocellulose-Filterpapier zu legen.Nehmen Sie die Ecke des Nitrocellulosepapiers mit einer Handzette auf und legen Sie sie für eine Stunde in eine 48-Well-Platte mit 4% Power-Formaldehyd, dann das Filterpapier und die Netzhaut in eine Vertiefung mit PBS geben und dreimal für jeweils fünf Minuten waschen. A4P0-Lösung auf Eis auftauen. Anschließend die Netzhaut in die A4P0-Lösung überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren inkubieren.Fügen Sie Pflanzenöl in den Brunnen hinzu, um die A4P0-Lösung vollständig abzudecken. Inkubieren Sie in einem Wasserbad bei 40 Grad Celsius für drei Stunden ohne Schütteln. Dann dreimal in PBS für fünf Minuten pro Waschgang waschen.Inkubieren Sie die Netzhaut in 10% Natriumdodecylsulfat bei 40 Grad Celsius für zwei Tage mit sanftem Schütteln, dann übertragen Sie das Filterpapier und die Netzhaut mit Triton X-100 auf PBS und waschen Sie fünfmal für 90 Minuten pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche die Netzhaut bei vier Grad Celsius in PBS-T mit 0,01% Natriumazid lagern oder direkt zur Immunfärbung übergehen. Entfernen Sie die Netzhaut vom Filterpapier, indem Sie sie vorsichtig mit einem feinen Spitzenpinsel in PBS-T abziehen.Inkubiert in primärem Antikörper, verdünnt in Blocklösung für zwei Tage bei 40 Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Nach der Inkubation fünfmal für 90 Minuten in PBS-T waschen. Inkubieren Sie die Netzhaut mit geeigneten sekundären Antikörpern, die in Blocklösung verdünnt sind, zwei Tage lang bei 40 Grad Celsius unter sanftem Schütteln.Schützen Sie die Proben während des restlichen Verfahrens vor Licht. Waschen Sie die Netzhaut fünfmal für 90 Minuten in 0,02 M Phosphatpuffer. Schließlich wird die Netzhaut in Sorbitol-basierter Brechungsindex-Matching-Lösung bei 40 Grad Celsius über Nacht mit sanftem Schütteln inkubiert.Umreißen Sie einen Glasabdeckungsschlupf mit einem feinen Spitzen-Permanentmarker, um eine quadratische Grenze auf der Rückseite eines Glasmikroskopobjektträgers zu markieren. Drehen Sie den Schieber um und verwenden Sie eine Spritze, um die Grenze mit einer dünnen Linie silikone Fett auf der Vorderseite des Objektträgers zu verfolgen. Lassen Sie einen kleinen Spalt in einer Ecke, damit überschüssige Montagelösung entweichen kann.Übertragen Sie die Netzhaut in die Mitte des begrenzten Bereichs und positionieren Sie sie mit einem feinen Spitzenpinsel so, dass sie flach mit der Photorezeptorseite gegen den Glasträger liegt. Pipette etwa 60 Mikroliter sRIMS, so dass es die abgeflachte Netzhaut bedeckt und sich bis zu einer Ecke des Gehäuses erstreckt. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut flach und an Ort und Stelle bleibt.Tragen Sie den Deckelschlupf ab der Ecke mit dem sRIMS auf und senken Sie ihn langsam ab, bis er das Fett auf allen Seiten berührt. Legen Sie einen Stapel von drei Deckelzetteln auf jede Seite der montierten Netzhaut als Abstandhalter. Verwenden Sie die lange Kante eines anderen Schlittens, um den Deckelzettel nach unten zu drücken, so dass die Halterung flach und gleichmäßig ist.Lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius bis zur Bildgebung. Beginnen Sie, indem Sie den Objektträger auf den Mikroskopstand legen und die Probe lokalisieren. Um Z-gestapelte Bilder von Proben zu erhalten, konzentrieren Sie sich zunächst auf das Signal in jedem Kanal einzeln und stellen Sie die Belichtungszeit bzw. Scangeschwindigkeit für Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope ein.Legen Sie den Bereich für den Z-Stapel fest, indem Sie entweder die Fokusebene oben und unten im gewünschten Bereich manuell einstellen oder indem Sie den Mittelpunkt einstellen und dann einen Bereich um den Mittelpunkt angeben. Passen Sie die Schrittgröße oder die Anzahl der Slices wie gewünscht an. Erfassen Sie das Bild und speichern Sie die Originaldatei.Dann als TIF-Datei oder ein anderes gewünschtes Format exportiert. Verwenden Sie die Bildanalyse, eine Software Ihrer Wahl, um die Helligkeit und den Kontrast in jedem Kanal anzupassen, bis sowohl in den Einzelbildern als auch in der dreidimensionalen Wiedergabe des Z-Stacks eine optimale Klarheit erreicht ist. Bei der Verarbeitung mit dem modifizierten CLARITY-Protokoll wurde eine vollständige optische Transparenz über die gesamte Dicke der Netzhaut im Vergleich zu nicht verarbeiteten Kontroll-Netzhäuten beobachtet.Z-gestapelte Bilder für Arrestin-markierte Kegel in ONL, TH-markierte DACs in INL und RBPMS-markierte RGCs in GCL werden hier gezeigt. Die relative Position von Neuronen über die gesamte Dicke der Netzhaut wurde im Overlay-Bild beobachtet. TH-Färbung und CLARITY verarbeitete ganze Mount Netzhaut wurde mit Bildern aus der Standardvorbereitung verglichen.Dendriten und axonähnliche Prozesse von DACs wurden in einer klar verarbeiteten Netzhaut deutlicher aufgedeckt als in einer Standard-Netzhaut. Axonartige Prozesse von DACs zeigten im Vergleich zu einer Standard-Netzhaut vollständige ringartige Strukturen in einer klaren Netzhaut. Ringförmige Strukturen der CLARITY-Netzhaut, die mit Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, waren fast identisch mit denen, die mit konfokaler Mikroskopie beobachtet wurden.Die axonartigen Prozesse liefen auch in Richtung der äußeren Netzhaut. Die Immunfärbung gegen GluA2 und PSD-95 zeigte eine ausgeprägte Punktion, die einzelne GluA2-haltige AMPA-Rezeptoren bzw. mutmaßliche postsynaptische Stellen aufdeckte. Ein Overlay-Bild zeigte einige Punkte bei DAC-Prozessen.Die Punkte der mutmaßlichen Kollokalisierung wurden in XZ-, YZ- und XY-Ebenen dargestellt und TH-Kolokalisierung sowohl mit GluA2 als auch mit PSD-95 klar co-lokalisiert. Es ist wichtig, dass die Netzhaut während des Hydrogelpolymerisationsprozesses flach bleibt, damit die gereinigte Netzhaut für den Montage- und Bildgebungsprozess flach liegen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Die Kombination aus Antikörperkennzeichnung, optischer Lichtreinigung und fortschrittlicher Lichtmikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Analyse kompletter Strukturen oder Organe. Hier wird eine einfache Methode beschrieben, um die Immunkennzeichnung dicker Nierenscheiben, die optische Reinigung mit Ethyl-Cinnamat und die konfokale Bildgebung zu kombinieren, die die Visualisierung und Quantifizierung dreidimensionaler Nierenstrukturen ermöglicht.

Optische Seimierung und Bildgebung von immunomarkiertem Nierengewebe

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Dieses Protokoll kombiniert optisches Clearing und Immunmarkierung für die konfokale Bildgebung des gesamten Volumens von Netzhautorganoiden in der gesamten Halterung. Es bewahrt die 3D-Struktur und ermöglicht eine detaillierte Visualisierung wichtiger neuronaler Signalwege und verbessert die Untersuchung der Netzhautreifung, der räumlichen Organisation und ihrer potenziellen Anwendungen in der Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin.

Visualisierung von retinalen Organoiden mit zellulärer Auflösung

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Immunzytochemische Identifizierung der peripheren sensorischen Nervenfasern Subtypen (und Detektion von Protein-Expression darin) sind der Schlüssel zum Verständnis der molekularen Mechanismen, die periphere Empfindung. Hier beschreiben wir Methoden für die Herstellung von peripheren / viszeralen Gewebeproben, wie Haut-und Gliederschmerzen Knochen, für spezifische Immunfärbung der peripheren sensorischen Nervenfasern.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Lernen Sie die CLARITY-Gewebeklärung für Whole-Mount-Netzhäute zur hochauflösenden Immunfärbung retinaler Neuronen. Diese Methode ermöglicht dreidimensionale Bildgebung subzellulärer Strukturen.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

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