Name: Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Verwendung des E1A-Minigen-Tools zur Analyse globaler mRNA-Spleißänderungen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Forschern die Bewertung von Proteinfunktionen in der alternativen Spleißregulation nach Chemotherapie.

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Wir danken Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, durch Grant Temático 2017/03489-1 an JK und Stipendium an FLB 2018/05350-3) und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) für die Finanzierung dieser Forschung. Wir danken Dr. Adrian Krainer für die Bereitstellung des pMTE1A-Plasmids und Zerler und Kollegen für ihre Arbeit im E1A-Klonen. Wir danken auch Prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti und Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller, die uns die Nutzung ihrer Laborräume und -geräte ermöglichen.

1. Beschichtungszellen
HINWEIS: In diesem beschriebenen Protokoll wurden HEK293 stabile Zelllinien, die zuvor für eine stabile induzierbare Expression von Nek4 erzeugtwurden, 21verwendet, jedoch ist das gleiche Protokoll für viele andere Zelllinien geeignet, wie HEK29322,HeLa23,24,25,26,U-2 OS27,COS728,SH-SY5Y29. Das Expressionsmuster von Minigen-E1A-Isoformen unter basalen Bedingungen variiert zwischen diesen Zellen und sollte für jede Bedingung charakterisiert werden. Dieses Protokoll ist nicht auf stabile Zelllinien beschränkt. Der gebräuchlichste Ansatz bei der Bewertung von Kandidatenproteinen ist die vorübergehende Co-Transfektion der Erhöhung seiner Menge mit einer festen Menge des Minigens. Das gleiche Protokoll eignet sich für Knockout-Zellen.
<ol><li>Plattenzellen unter Berücksichtigung von Fahrzeug-, nicht-transfizierten und GFP-Kontrollen.</li>
	<li>Kultur-HEK293-Zellen mit stabiler Expression des interessierenden Gens in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 4,5 g/L Glucose, 4 mM L-Glutamin und halten mit 100 μg/ml Hygromycin B, auf gewebekulturbehandelten Platten bei 37 °C in 5% CO2 und einer befeuchteten Atmosphäre.</li>
	<li>Splitten Sie Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA. Platte 3 x 105 Zellen in 6-Well-Platten und inkubieren Sie sie für 24 h bei 37 °C in 5% CO2. HINWEIS: Für die Transfektion müssen die Zellen zu 70-80% konfluent sein, um den Zelltod nach der Transfektion zu verringern.</li>
</ol>2. Zelltransfektion
HINWEIS: Hier wurden 1-2 μg pMTE1A-Minigenplasmid verwendet, jedoch muss die DNA-Menge sowie der Zeitpunkt der Expression minimal gehalten werden, um Toxizität zu vermeiden. Zum Beispiel wurde eine hohe Toxizität in HeLa-Zellen nach 30 h Transfektion mit 1 μg pMTE1A-DNA beobachtet. Für die hier beschriebene Transfektion wurde ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz verwendet
<ol><li>Überprüfen Sie die Zellkonfluenz 24 h nach der Beschichtung und transfizieren Sie HEK293 stabile Zellen nur, wenn 70-80% konfluent sind.</li>
	<li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium vorsichtig mit einer Pipette, anstatt ein Vakuumpumpensystem zu verwenden. Dann fügen Sie vorsichtig 2 ml vollständiges DMEM-Medium ohne Antibiotika hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Röhrchen mit dem Transfektionspuffer (200 μL / Well) vor, fügen Sie 2 μg pMTE1A DNA, Wirbel und dann 2 μL Transfektionsreagenz hinzu. Erneut Wirbel und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.</li>
	<li>Zu HEK293 stabilen Zellen Tetracyclin (0,5 μg/ml) für die Nek4-Expressionsinduktion 6 h nach der Transfektion hinzufügen. Ein Medienwechsel ist nicht notwendig. HINWEIS: Die in diesem Abschnitt beschriebenen Volumina/Beträge beziehen sich auf eine Vertiefung. Bereiten Sie die Mischung für alle im Experiment verwendeten Vertiefungen im selben Röhrchen vor.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Vertiefung zur Transfizierung mit EGFP oder ein anderes Fluorophor, das Plasmid exprimiert, vor, um die Transfektionseffizienz abzuschätzen. Bessere Ergebnisse können mit einer Transfektionseffizienz von mindestens 40% beobachtet werden, aber zuvor wurden gute Leistungen mit geringerer Transfektionseffizienz beobachtet.</li>
	<li>Bei der Verwendung von Co-Transfektion (Interessenprotein und Minigen) halten Sie einen Brunnen mit nicht transfizierten Zellen, um Ergebnisse aus endogener mRNA zu vermeiden. Bei E1A exprimieren HEK293-Zellen bereits das E1A-Gen30.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Medikamente
HINWEIS: Der Zeitpunkt und die Konzentration der Behandlung wurden auf der Grundlage von Literaturergebnissen ausgewählt, die auf Veränderungen im alternativen Spleißen für einige Gene hinweisen.
<ol><li>Führen Sie vor Beginn des Assays eine Dosis-Wirkungs-Kurve durch, um die minimale Konzentration zur alternativen Spleißinduktion ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Paclitaxel-Stammlösung bei einer Konzentration von 5 mM in Ethanol vor. Die Endkonzentration beträgt 1 μM. Bei -20 °C halten. Verwenden Sie 0,02% Ethanol als Fahrzeugkontrolle.</li>
	<li>Eine Cisplatinlösung wird durch Verdünnen in 0,9% NaCl bei etwa 0,5 mg/ml (1,66 mM) zubereitet. Vor Licht, Wirbel schützen und im Thermalbad bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Endkonzentration beträgt 30 μM. Frisch vorbereiten oder bei 2-10 °C bis zu einem Monat lagern. HINWEIS: Alle Medikamente müssen vor lichtgeschützt werden.</li>
</ol>4. Zellbehandlung und -sammlung
HINWEIS: HEK293 stabile Zellen wurden 48 h nach der Transfektion gesammelt und dafür 24 h nach der Transfektion behandelt, da das höchste Nek4-Expressionsniveau innerhalb von 48 h erreicht wird. Zu diesem Zeitpunkt wurden jedoch hohe Konzentrationen der 13S-Isoformexpression (bis zu 90%) beobachtet. Um den Anteil der 13S-Isoform zu verringern, versuchen Sie, Zellen 30 h nach der Transfektion maximal zu behandeln und zu sammeln.
<ol><li>Verwenden Sie RNA / DNase-freie Spitzen und Röhrchen. Führen Sie eine vollständige RNA-Extraktion mit Phenol-Chloroform-Reagenz gemäß der Empfehlung des Herstellers durch.</li>
	<li>Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Transfektion die Zellmorphologie und Transfektionseffizienz mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium, vorzugsweise mit einer Pipette anstelle eines Vakuumpumpensystems. Dann fügen Sie Zellkulturmedium mit den Chemotherapeutika in der zuvor beschriebenen Endkonzentration hinzu.</li>
	<li>Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für 18 - 24 h.</li>
	<li>Sammeln Sie RNA, indem Sie das Zellkulturmedium in einem Behälter entsorgen und 0,5 - 1 ml RNA-Extraktionsreagenz direkt in den Brunnen geben. Wenn Vertiefungen sehr konfluent sind, verwenden Sie 1 ml RNA-Extraktionsreagenz, um die RNA-Qualität zu verbessern.</li>
	<li>Mit der Pipette homogenisieren und in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr überführen. An dieser Stelle kann das Protokoll durch Lagerung von Proben bei -80 °C pausiert oder sofort mit der RNA-Extraktion fortfahren. WARNUNG: Das phenolbasierte RNA-Extraktionsreagenz ist giftig und alle Verfahren sollten in einem chemischen Abzug durchgeführt und die Rückstände ordnungsgemäß entsorgt werden.</li>
</ol>5. RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
<ol><li>In einem Abzug die Proben auftauen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 0,1 -0,2 ml Chloroform hinzu und rühren Sie kräftig.</li>
	<li>3 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g und 4 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie die obere wässrige Phase und geben Sie sie in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr über. Sammeln Sie etwa 60% des Gesamtvolumens; Sammeln Sie jedoch nicht die DNA oder die organische (untere) Phase.</li>
	<li>Fügen Sie 0,25 - 0,5 ml Isopropanol hinzu und rühren Sie durch Inversion 4 mal. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min, bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit Ethanol (75% in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser). Zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min und entsorgen Sie das Ethanol.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie das Rohr auf einem Handtuchpapier umkehren und lassen Sie das Rohr dann in einem Abzug offen, um das Pellet für 5 - 10 minuten teilweise zu trocknen.</li>
	<li>Resuspend das RNA-Pellet in 15 μL DEPC-behandeltem Wasser.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA mithilfe der Absorption bei 230 nm, 260 nm und 280 nm, um die RNA-Qualität zu überprüfen.</li>
	<li>Um die Gesamt-RNA-Qualität zu überprüfen, führen Sie ein 1% iges Agarosegel vorbehandelt mit 1,2% (v / v) einer 2,5% igen Natriumhypochloritlösung für 30 min31.</li>
	<li>Führen Sie die cDNA-Synthese mit 1-2 μg Gesamt-RNA durch.<ol>
<li>Pipetten Sie RNA, 1 μL Oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) und bilden Sie das Volumen auf 12 μL mit nukleasefreiem Wasser. Im Thermocycler 5 min bei 65 °C inkubieren.</li>
		<li>Proben aus dem Thermocycler entfernen, um abzukühlen und die Reaktionsmischung vorzubereiten: 4 μL Reverse Transkriptase-Puffer, 2 μL Dithiothreitol (DTT) und 1 μL Ribonuklease-Inhibitor. Bei 37 °C 2 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 1 μL thermostabile Reverse Transkriptase hinzu. 50 min bei 37 °C inkubieren und das Enzym bei 70 °C für 15 min inaktivieren. HINWEIS: Der cDNA kann mehrere Wochen bei -20 °C gelagert werden. Führen Sie eine Nicht-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (NRT) für genomische Kontamination durch mutmaßliche Diskriminierung von Intron-Retentionsereignissen durch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. pMTE1A Minigen PCR
<ol><li>Führen Sie eine PCR mit der Reaktionszusammensetzung (1,5 mMMgCl2,0,3 mM dNTP-Mischung, 0,5 μM jeder Grundierung, 2,5 U einer Heißstart-Taq-Polymerase und 150 ng cDNA) unter folgenden Bedingungen durch: 94 °C für 2 min, 29 Zyklen von: 94 °C für 1 min, 50 °C für 2 min, 72 °C für 2 min, 72 °C für 10 min.</li>
	<li>20-25 μL des PCR-Produkts in ein 3%iges Agarosegel mit Nukleinsäurefleck laden und bei 100 V ca. 1 h laufen lassen.</li>
</ol>7. Analyse des Gels mit einer Bildverarbeitungs- und Analysesoftware32
<ol><li>Fotografieren Sie nach dem Lauf das Gel (mit einem Gel-Imaging-Erfassungssystem), vermeiden Sie eine Bandsättigung und quantifizieren Sie die Bänder mit einer Bildverarbeitungssoftware.</li>
	<li>Zur Quantifizierung betrachten Sie die Bänder bei ~631 bp, ~493 bp und ~156 bp, um den Isoformen 13S, 12S und 9S zu entsprechen.</li>
	<li>Öffnen Sie im Menü Datei der Software die Bilddatei, die Sie vom Bilderfassungssystem erhalten haben. Konvertieren Sie in Graustufen, passen Sie Helligkeit und Kontrast an und entfernen Sie bei Bedarf Ausreißerrauschen.</li>
	<li>Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahl-Werkzeug ein Rechteck um die erste Spur und wählen Sie es über die analyse | Gele | Wählen Sie den Befehl Erste Spur oder drücken Sie die Tastenkombination dafür.</li>
	<li>Klicken und halten Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf der ersten Spur und ziehen Sie es auf die nächste Spur. Gehe zu | analysieren Gele | Wählen Sie Nächste Spuraus, oder drücken Sie die verfügbare Verknüpfung. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Fahrspuren.</li>
	<li>Nachdem alle Fahrspuren hervorgehoben und nummeriert sind, gehen Sie zu Analysieren | Gele | Plot Lanes, um ein Profildiagramm für jede Lane zu zeichnen.</li>
	<li>Zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Gerade Linie" eine Linie über die Basis jedes Peaks, die jedem Band entspricht, wobei das Hintergrundrauschen weggelassen wird. Nachdem alle Gipfel von jeder Spur geschlossen wurden, wählen Sie das Stabwerkzeug und klicken Sie in jede Spitze. Für jeden hervorgehobenen Peak sollten die Messungen im angezeigten Fenster Ergebnisse angezeigt werden.</li>
	<li>Summieren Sie die Intensität aus allen 3 Bändern für jede Probe und berechnen Sie den Prozentsatz für jede Isoform relativ zur Gesamtmenge.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Prozentsätze jeder Isoform oder die Unterschiede im Prozentsatz im Verhältnis zu unbehandelten Proben auf. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Summe von drei E1A-Varianten gleich 100% sein muss.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Minigenes sind wichtige Werkzeuge, um die Auswirkungen beim globalen alternativen Spleißen in vivo zu bestimmen. Das adenovirale Minigen E1A wird seit Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um die Rolle von Proteinen zu bewerten, indem die Menge dieser in der Zelle erhöht wird13,14. Hier schlagen wir das Minigen E1A zur Bewertung des alternativen Spleißens nach chemotherapeutischer Exposition vor. Es wurde eine stabile Zelllinie verwendet, die die Nek4-Isoform 1 exp...

Das Spleißen gehört zu den wichtigsten Schritten in der eukaryotischen mRNA-Verarbeitung, die gleichzeitig mit dem 5'mRNA-Capping und der 3'mRNA-Polyadenylierung erfolgt, bestehend aus Intronentfernung gefolgt von Exon-Junction. Die Erkennung der Spleißstellen (SS) durch das Spleißosom, einen Ribonukleoproteinkomplex, der kleine Ribonukleoproteine (snRNP U1, U2, U4 und U6), kleine RNAs (snRNAs) und mehrere regulatorische Proteine1 enthält, ist für das Spleißen notwendig.
Neben der Intronentfernung (konstitutives Spleißen) können in Eukaryoten Introns zurückgehalten und Exons ausgeschlossen werden, wodurch der Prozess namens mRNA Alternatives Spleißen (AS) konfiguriert wird. Das alternative Pre-mRNA-Spleißen erweitert die Kodierungskapazität eukaryotischer Genome und ermöglicht die Produktion einer großen und vielfältigen Anzahl von Proteinen aus einer relativ kleinen Anzahl von Genen. Es wird geschätzt, dass 95-100% der menschlichen mRNAs, die mehr als ein Exon enthalten, einem alternativen Spleißenunterzogenwerden können2,3. Dies ist grundlegend für biologische Prozesse wie neuronale Entwicklung, Apoptose-Aktivierung und zelluläre Stressreaktion4, die dem Organismus Alternativen zur Regulierung der Zellfunktion mit dem gleichen Repertoire an Genen bieten.
Die für das alternative Spleißen erforderliche Maschine ist die gleiche, die für das konstitutive Spleißen verwendet wird, und die Verwendung des SS ist die Hauptdeterminante für das Auftreten alternativer Spleißen. Konstitutives Spleißen ist mit der Verwendung von starken Spleißstellen verbunden, die in der Regel Konsensmotiven für die Spleißosomerkennung ähnlicher sind5.
Alternative Exons werden typischerweise weniger effizient erkannt als konstitutive Exons, sobald ihre cis-regulatorischenElemente, die Sequenzen in 5'SS und 3'SS, die diese Exons flankieren, eine geringere Bindungskapazität an das Spleißosom aufweisen. mRNA enthält auch Regionen namens Enhancer oder Schalldämpfer, die sich in Exons (Exonic Splicing Enhancers (ESEs) und Exonic Splicing Silencers (ESSs)) und Introns (Intronic Splicing Enhancers (ISEs) und Intronic Splicing Silencers (ISSs)) befinden, die die Exonnutzung verbessern oder unterdrücken, bzw.5. Diese Sequenzen werden durch transregulatorische Elemente oder Spleißfaktoren (SF) erkannt. SFs werden hauptsächlich durch zwei Proteinfamilien repräsentiert, die Serin/Arginin-reichen Spleißfaktoren (SRSFs), die an ESEs binden, und die Familie der heterogenen nuklearen Ribonukleoproteine (hnRNPs), die an ESS-Sequenzen binden5.
Alternatives Spleißen kann durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung von Transfaktoren moduliert werden, wodurch die Interaktionspartner und die zelluläre Lokalisation der Spleißfaktoren6,7,8modifizieren. Die Identifizierung neuer Regulatoren von Spleißfaktoren kann neue Werkzeuge zur Regulierung des Spleißens und folglich einiger Krebsbehandlungen bieten.
Anufrieva et al. 9 beobachteten ineinemmRNA-Microarray-Genexpressionsprofil konsistente Veränderungen der Spiegel spleißosomaler Komponenten in 101 Zelllinien und nach verschiedenen Stressbedingungen (platinbasierte Medikamente, Gammabestrahlung, Topoisomerase-Inhibitoren, Tyrosinkinase-Inhibitoren und Taxane). Der Zusammenhang zwischen Spleißmuster und Chemotherapie-Wirksamkeit wurde bereits in Lungenkrebszellen nachgewiesen, die chemotherapieresistent sind und Veränderungen in der Caspase-9-Variantenrate10zeigen. HEK293-Zellen, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, zeigen Veränderungen beim Spleißen mit einer Zunahme pro-apoptotischer Varianten. Gabriel et al.11 beobachteten Veränderungen bei mindestens 700 Spleißereignissen nach Cisplatin-Behandlung in verschiedenen Zelllinien und weisen darauf hin, dass Spleißwege cisplatin-beeinflusst sind. Spleißmodulatoren haben bereits eine antitumorale Aktivität gezeigt und gezeigt, dass das Spleißen für die Tumorentwicklung und vor allem für das Ansprechen auf die Chemotherapie wichtig ist12. Daher ist die Charakterisierung neuer Proteine, die das Spleißen nach zellulären Stressoren wie Chemotherapeutika regulieren, sehr wichtig, um neue Behandlungsstrategien zu entdecken.
Die Hinweise auf alternative Spleißregulation aus Interaktomstudien, die besonders wichtig sind, um Funktionen neuer oder uncharakterisierter Proteine zu charakterisieren, können einen allgemeineren und einfacheren Ansatz erfordern, um die tatsächliche Rolle des Proteins bei AS zu überprüfen. Minigenes sind wichtige Werkzeuge für die Analyse der allgemeinen Rolle eines Proteins, das die Spleißregulation beeinflusst. Sie enthalten Segmente aus einem interessierenden Gen, das alternativ gespleißte und flankierende genomische Regionen13enthält. Die Verwendung eines Minigen-Tools ermöglicht die Analyse des Spleißens in vivo mit mehreren Vorteilen, wie z. B. der Länge des Minigens, die geringfügig ist und daher keine Beschränkung auf die Amplifikationsreaktion darstellt; das gleiche Minigen kann in verschiedenen Zelllinien bewertet werden; alle zellulären Komponenten, hauptsächlich ihre regulierende post-translationale Modifikation (Phosphorylierung und Veränderungen in Zellkompartimenten) vorhanden sind und angesprochen werden können13,14. Darüber hinaus können Veränderungen des alternativen Spleißmusters nach zellulärem Stress beobachtet werden und die Verwendung eines Minigensystems ermöglicht es, den durch verschiedene Reize modulierten Signalweg zu identifizieren.
Es gibt bereits mehrere Minigensysteme, die spezifisch für verschiedene Arten von Spleißereignissensind 13,14,jedoch ist das Minigen E1A15 als vorläufiger Assay ein sehr gut etabliertes alternatives Spleiß-Reportersystem für die Untersuchung der 5'SS-Selektion in vivo. Aus nur einem Gen, E1A, werden fünf mRNAs durch alternatives Spleißen erzeugt, basierend auf der Auswahl von drei verschiedenen 5' Spleißstellen und einer großen oder einer kleineren 3' Spleißstelle16,17,18. Die Expression von E1A-Varianten ändert sich entsprechend der Periode der adenoviralen Infektion19,20.
Wir haben bereits gezeigt, dass beide Nek4-Isoformen mit Spleißfaktoren wie SRSF1 und hnRNPA1 interagieren, und während Isoform 2 das Minigen E1A alternative Spleißen ändert, hat Isoform 1 keine Wirkung in diesem21. Da Isoform 1 die am häufigsten vorkommende Isoform ist und die Chemotherapieresistenz und die DNA-Schadensreaktion verändert, bewerten wir, ob sie das alternative Spleißen des Minigens E1A in einem Stresszustand verändern könnte.
Der Minigene-Assay ist eine einfache, kostengünstige und schnelle Methode, da er nur RNA-Extraktion, cDNA-Synthese, Amplifikation und Agarose-Gel-Analysen benötigt und ein nützliches Werkzeug sein kann, um eine mögliche Wirkung auf das alternative Spleißen durch ein Protein von Interesse bis zur Wirkung verschiedener Behandlungen auf das zelluläre alternative Spleißmuster zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 Wells Platte</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Wasser</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mischung</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging Acquisition System - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 stabile Zellen - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>Generiert von Flp-In&trade; T-REx&Handel; 293 - Invitrogen und beschrieben in Ref. 21</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>Wird für die Instandhaltung von Flp-In-Zellen</td></tr><tr><td>verwendet Bildverarbeitungs- und Analysesoftware - FIJI-Software</td><td></td><td></td><td>Ref. 32</td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz auf Lipidbasis - jetOPTIMUS Polyplus Reagenz</td><td>Polyplus</td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader/ UV-Absorption</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek/ Take3 Adapter</td></tr><tr><td>pMTE1A Plasmid</td><td></td><td></td><td>Zur Verfügung gestellt von Dr. Adrian Krainer</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A R</td><td>Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase - Hochgestellt IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Ribunuklease-Inhibitor RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Extraktion Reagenz auf Phenol-Chloroform-Basis - Trizol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA-Gelfärbung</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>Verwendet für Flag empty oder Nek4- Flag expression</td></tr><tr><td>induction Thermocycler Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung des e1a minigene tools zur untersuchung von mrna-spleißänderungen

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Die mRNA-Verarbeitung umfasst mehrere gleichzeitige Schritte, um mRNA für die Translation vorzubereiten, wie z. B. 5'Capping, Poly-A-Addition und Spleißen. Neben dem konstitutiven Spleißen ermöglicht das alternative mRNA-Spleißen die Expression multifunktionaler Proteine aus einem Gen. Da Interkonomstudien in der Regel die erste Analyse für neue oder unbekannte Proteine sind, ist die Assoziation des Köderproteins mit Spleißfaktoren ein Hinweis darauf, dass es am mRNA-Spleißprozess teilnehmen kann, aber zu bestimmen, in welchem Kontext oder welche Gene reguliert werden, ist ein empirischer Prozess. Ein guter Ausgangspunkt, um diese Funktion zu evaluieren, ist die Verwendung des klassischen Minigene-Tools. Hier stellen wir die adenovirale E1A-Minigenverwendung zur Bewertung der alternativen Spleißveränderungen nach verschiedenen zellulären Stressreizen vor. Wir untersuchten das Spleißen von E1A-Minigen in HEK293, das das Nek4-Protein nach verschiedenen Stressbehandlungen stabil überexprimiert. Das Protokoll umfasst E1A-Minigentransfektion, Zellbehandlung, RNA-Extraktion und cDNA-Synthese, gefolgt von PCR- und Gelanalyse und Quantifizierung der E1A-Spleißvarianten. Der Einsatz dieser einfachen und etablierten Methode in Kombination mit spezifischen Behandlungen ist ein zuverlässiger Ausgangspunkt, um zelluläre Prozesse zu beleuchten oder welche Gene durch mRNA-Spleißen reguliert werden können.

Ein 5'-Spleißstellen-Assay mit E1A-Minigen wurde durchgeführt, um Veränderungen des Spleißprofils in Zellen nach Chemotherapie-Exposition zu bewerten. Die Rolle von Nek4 - Isoform 1 bei der AS-Regulation in HEK293-stabilen Zellen nach Paclitaxel- oder Cisplatin-Behandlung wurde untersucht.
Die adenovirale E1A-Region ist aufgrund der Verwendung verschiedener Spleißspender für die Produktion von drei Haupt-mRNAs aus einem RNA-Vorl...

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur Verwendung des Minigens E1A2 zur Bewertung globaler mRNA-Spleißänderungen bereitzustellen. Dies ist ein schnelles, kostengünstiges und einfaches Werkzeug zur Beurteilung der Funktion des Zielproteins bei der alternativen Spleißregulation, ohne dass spezielle Regime oder Laborbedingungen erforderlich sind. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HEK 293-Zellen mit stabiler Expression des interessierenden Gens.Teilen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin EDTA, dann platten Sie 300.000 Zellen pro Vertiefung in Sechs-Well-Platten und inkubieren Sie sie für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Überprüfen Sie nach 24 Stunden den Zusammenfluss und transfizieren Sie HEK 293 stabile Zellen nur, wenn 70 bis 80% konfluent sind. Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium mit einer Pipette, fügen Sie dann zwei Milliliter vollständiges DMEM-Medium ohne Antibiotika hinzu und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.Bereiten Sie ein Röhrchen mit dem Transfektionspuffer vor, fügen Sie dann zwei Mikrogramm pMTE1A-DNA, Wirbel und zwei Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu. Erneut Wirbel und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und fügen Sie die Transfektionsmischung vorsichtig tropfenweise hinzu.Sechs Stunden nach der Transfektion wird Tetracyclin zu den stabilen HEK 293-Zellen für die Nek4-Expressionsinduktion hinzugefügt. Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Transfektion die Zellmorphologie und Transfektionseffizienz mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine Pipette, um das Zellkulturmedium zu entfernen, und fügen Sie dann Zellkulturmedium mit den Chemotherapeutika hinzu.Inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Um RNA zu sammeln, verwerfen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 0,5 bis 1 Milliliter RNA-Extraktionsreagenz direkt in den Brunnen hinzu. Wenn Brunnen sehr konfluent sind, verwenden Sie einen Milliliter RNA-Extraktionsreagenz, um die RNA-Qualität zu verbessern.Homogenisieren Sie die Zellen mit einer Pipette und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen über. Fahren Sie sofort mit der RNA-Extraktion fort oder lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius. Die Proben in einem Abzug auftauen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie 0,1 bis 0,2 Milliliter Chloroform hinzu und rühren Sie kräftig, dann drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie für 15 Minuten bei 12.000 mal G und vier Grad Celsius, sammeln Sie dann die obere wässrige Phase und übertragen Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr. Sammeln Sie etwa 60% des Gesamtvolumens, aber sammeln Sie nicht die DNA oder die organische Phase.Fügen Sie 0,25 bis 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu und rühren Sie die Probe viermal durch Inversion. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann bei 12.000 mal G 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit Ethanol und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 7.500 mal G und entsorgen Sie es dann.Entfernen Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie das Röhrchen auf einem Papiertuch umkehren, und lassen Sie das Rohr dann in einem Abzug offen, um das Pellet fünf bis 10 Minuten lang teilweise zu trocknen. Suspendieren Sie das RNA-Pellet in 15 Mikrolitern DEPC-behandeltem Wasser. Quantifizieren Sie die Gesamt-RNA und verifizieren Sie die RNA-Qualität, indem Sie die Absorption bei 230, 260 und 280 Nanometern messen.Um die Gesamt-RNA-Qualität zu überprüfen, führen Sie 30 Minuten lang ein 1% Agarose-Gel aus, das mit 1,2% einer 2,5% igen Natriumhypochloritlösung vorbehandelt wurde. Führen Sie die cDNA-Synthese mit ein bis zwei Mikrogramm Gesamt-RNA durch. Kombinieren Sie RNA, einen Mikroliter Oligo d-T, einen Mikroliter DNTP und nukleasefreies Wasser zu 12 Mikrolitern.Inkubieren Sie die Reaktion im Thermo Cycler fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Entfernen Sie Proben aus dem Thermo Cycler und fügen Sie vier Mikroliter Reverse Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter DTT und ein Mikroliter Ribonuklease-Inhibitor hinzu. Bei 37 Grad Celsius zwei Minuten lang inkubieren.Fügen Sie einen Mikroliter thermostabile Reverse Transkriptase hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 50 Minuten. Inaktivieren Sie das Enzym bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten. Führen Sie die PCR wie im Textmanuskript beschrieben durch, laden Sie dann 20 bis 25 Mikroliter des PCR-Produkts auf ein 3%iges Agarosegel, das Nukleinsäurefleck enthält, und führen Sie es etwa eine Stunde lang mit 100 Volt aus.Fotografieren Sie das Gel, vermeiden Sie eine Bandsättigung und quantifizieren Sie die Bänder mit einer Bildverarbeitungssoftware. Die Bänder bei 631, 493 und 156 Basenpaaren entsprechen den Isoformen 13S, 12S und 9S. Öffnen Sie im Menü Datei der Software die Bilddatei und konvertieren Sie sie in Graustufen.Passen Sie Helligkeit und Kontrast an und entfernen Sie bei Bedarf Ausreißerrauschen. Zeichnen Sie mit dem Rechteckauswahlwerkzeug ein Rechteck um die erste Spur, und wählen Sie es mit den Befehlen Analysieren, Gele und Erste Spur auswählen oder mithilfe der Tastenkombination aus. Klicken und halten Sie mit der Maus in der Mitte des Rechtecks auf der ersten Spur und ziehen Sie es auf die nächste Spur.Gehen Sie zu Analysieren, Gele und Wählen Sie Nächste Spur aus. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle verbleibenden Fahrspuren. Nachdem alle Lanes hervorgehoben und nummeriert wurden, wechseln Sie zu Analyze, Gels und Plot Lanes, um ein Profildiagramm für jede Lane zu zeichnen.Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um eine Linie über die Basis jedes Peaks zu zeichnen, die jedem Band entspricht, wobei das Hintergrundrauschen weggelassen wird. Nachdem alle Spitzen von jeder Spur gesperrt wurden, wählen Sie das Zauberstabwerkzeug und klicken Sie in jede Spitze. Messungen sollten im Ergebnisfenster für jeden hervorgehobenen Peak angezeigt werden.Betrachten Sie nur die 13S-, 12S- und 9S-Peaks, die den Basenpaarbändern 631, 493 und 156 entsprechen. Kopieren Sie Intensitätsdaten für einen Tabellenkalkulationseditor, summieren Sie die Intensität aus allen drei Bändern für jede Stichprobe, und berechnen Sie dann den Prozentsatz für jede Isoform relativ zur Gesamtsumme. Zeichnen Sie die Prozentsätze jeder Isoform oder die Unterschiede im Prozentsatz relativ zu den unbehandelten Proben auf.Ein Plasmid, das das Minigen aus E1A enthielt, wurde verwendet, um die Wirkung auf das alternative Spleißen zu beobachten, indem der Anteil an mRNA aus jeder produzierten Isoform bewertet wurde. Die basale Expression von E1A-Isoformen-Varianten hing von der Zelllinie und dem Zeitpunkt der E1A-Expression ab. Die stabile HeK 293-Zelllinie oder HEK 293-Rekombinase-haltige Stelle zeigte eine höhere Expression von 13S im Vergleich zu HeLa-Zellen, zeigte jedoch nach 48 Stunden E1A-Expression ähnliche Konzentrationen von 13S- und 12S-Isoformen.Zellen, die Cisplatin ausgesetzt waren, zeigten eine Verschiebung in der Selektion von fünf Primzahlen von S-S-Spleißen, die die 12S-Expression begünstigten. Dieser Effekt wurde in HEK 293 beobachtet, das den leeren Flag-Vektor stabil ausdrückte, sowie die Isoform eines von Nek4. Veränderungen im alternativen Spleißen nach der Paclitaxel-Behandlung waren sehr diskret, aber die Richtungen der Veränderungen waren in Flag- und Nek4-exprimierenden Zellen entgegengesetzt.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, nicht transfizierte und nicht-reverse Transkriptase-Kontrollen zu verwenden, um Fehlinterpretationen mit endogener E1A-Expression zu vermeiden, hauptsächlich bei der Verwendung von HEK 293-Zellen. Nach Erhalt positiver Ergebnisse kann das alternative Spleißen bestimmter Gene im Zusammenhang mit dem chemotherapeutischen Ansprechen bewertet werden. Wenn ein Effekt beobachtet wird, kann dieses einfache Protokoll diese Studien für konsistentere Wege lenken, bei denen das Protein eine Rolle bei der Regulierung des alternativen Spleißens spielt, zum Beispiel bei der Chemotherapie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Tandem-Spleißereignisse treten an Stellen auf, die weniger als 12 Nukleotide voneinander entfernt sind. Die Quantifizierung der Verhältnisse solcher Spleißvarianten ist mit einem absolut quantitativen PCR-Ansatz möglich. Dieses Manuskript beschreibt, wie Spleißvarianten des Gens STAT3 quantifiziert werden können, bei denen zwei Spleißereignisse zu Serin-701-Einschluss/-Ausschluss und α/β C-Termini führen.

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur (a) Depletion von U1 snRNP aus Kernextrakten mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität; und (b) Rekonstitution der Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt durch Galectin-3 - U1-snRNP-Partikel, die an Perlen gebunden sind, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern.

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Alternative Spleißen (AS) und alternative Polyadenylierung (APA) erweitern die Vielfalt der Transkriptisoformen und ihrer Produkte. Hier beschreiben wir bioinformatische Protokolle zur Analyse von Bulk-RNA-seq und 3'-Endsequenzierungsassays, um AS und APA zu erkennen und zu visualisieren, die unter experimentellen Bedingungen variieren.

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Der ACT1-CUP1-Assay, ein Kupferwachstumsassay, ermöglicht eine schnelle Ablesung des Precursor-Messenger-RNA-Spleißens (pre-mRNA) und des Einflusses mutierter Spleißfaktoren auf die spleißöosomale Funktion. Diese Studie bietet ein Protokoll und hebt die Anpassungsmöglichkeiten hervor, um die interessierende Spleißfrage zu beantworten.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.

Ein Nonsequencing-Ansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung

Erfahren Sie die Verwendung des E1A-Minigen-Tools zur Analyse globaler mRNA-Spleißänderungen in HEK 293-Zellen. Diese kostengünstige Methode ermöglicht Forschern die Bewertung von Proteinfunktionen in der alternativen Spleißregulation nach Chemotherapie.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

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