Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung
18. Februar 2021
Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die entwickelt wurde, um die Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns während der kraniofazialen Entwicklung zu testen.
Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem Gesicht zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das basale Vorderhirn für die Beurteilung isoliert und eine Kontamination mit Neuralleistenzellen verhindert, die die Analyse verfälschen würde. Der schwierige Teil dieser Technik ist die Entnahme des Vorderhirns aus dem Wirt und der Ersatz durch das Spendergewebe.
Das Verfahren wird von Diane Hu, einer Forscherin aus dem Labor von Dr. Ralph Marcucio, demonstriert. Bereiten Sie zunächst DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärftem Wolfram vor. Entfernen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel 0,5 Milliliter Albumin vom spitzen Ende der Eierschale.
Machen Sie mit der Scherenspitze ein kleines Loch auf der Oberseite der Schale. Legen Sie dann ein Stück Klebeband über das Loch und schneiden Sie eine kreisförmige Öffnung, um den Embryo freizulegen. Färben Sie den Embryo mit neutralem Rot.
Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im siebten oder achten Stadium. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln, um ein Stück des Vorderhirns vorsichtig einzuschneiden. Um das darunterliegende Endoderm nicht einzuschließen, schieben Sie die Nadel unter das Vorderhirn und parallel zur Achse des Neuralrohrs.
Nehmen Sie das Transplantat mit der Glastransferpipette vom Spenderembryo auf und übertragen Sie es zwei Minuten lang in DMEM, das neutrales Rot enthält, um es zu färben. Legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist. Befruchtete Eier von weißen Leghorn-Hühnern bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer bis zum Hamburger-Hamilton-Stadium sieben bis acht bebrüten.
Legen Sie die Embryonen frei, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie ein 0,3 x 0,2 Millimeter großes Stück des basalen Vorderhirns abschneiden und dann entfernen, um das Transplantat aufzunehmen. Vermeiden Sie eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms, die offensichtlich wird, da Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten.
Nachdem Sie das Transplantat auf den Wirt übertragen haben, positionieren Sie das Transplantat so, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt. Legen Sie Klebeband fest über das Loch und bringen Sie die Embryonen in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator zurück, bis sie für die Analyse bereit sind. Ursprünglich wurden Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen erzeugt.
Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers wurden Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden. Das Wachtel-Küken-System bestätigte, dass das gesamte Transplantat nur aus Nervengewebe bestand und nicht mit anderen Zelltypen kontaminiert war. Die Transplantation von Wachtelgewebe in Entenembryonen führte aufgrund eines sich schneller entwickelnden Wachtelgehirns zu stark deformierten Chimären.
Dazu wurde eine Transplantation von Entengewebe in Hühnerembryonen durchgeführt. Die daraus resultierenden Enten-Küken-Chimären deuten darauf hin, dass das Gehirn an der Regulierung der Morphologie beteiligt ist. Die Whole-Mountain-C2-Hybridisierung wurde verwendet, um die Expression von Sonic hedgehog in Chimären zu untersuchen.
Ähnlich wie bei der Morphologie schien der Ausdruck des Sonic Hedgehog auf der Entenseite der Chimäre eher entenartig zu sein. Das Vorbereiten des Host-Standorts erfordert Übung. Eine große Anzahl von Embryonen überlebt nicht, so dass die Schaffung einer großen Anzahl von Chimären dazu beitragen kann, dass die richtigen Proben für die Analyse geeignet sind.
Mit dieser Methode konnte beurteilt werden, wie Signale aus dem Gehirn die Sonic hedgehog-Expressionsdomäne in der frontonasalen ektodermalen Zone formen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die es Forschern ermöglicht, Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem Gesicht während der kraniofazialen Entwicklung zu untersuchen. Die Methode isoliert das basale Vorderhirn zur Beurteilung und verhindert eine Kontamination mit Neuralleistenzellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gesichtsschädelentwicklung
- Gewebetransplantationstechniken
Hintergrund
- Das basale Vorderhirn spielt eine entscheidende Rolle bei der kraniofazialen Entwicklung.
- Das Verständnis von Gewebeinteraktionen ist für die Entwicklungsbiologie unerlässlich.
- Kontaminationen durch Neuralleistenzellen können die Analyse verfälschen.
- Die Isolierung des basalen Vorderhirns ermöglicht eine klarere Beurteilung seiner Signalisierungseigenschaften.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode für die Gewebetransplantation.
- Verbesserung des Verständnisses der Mechanismen der kraniofazialen Entwicklung.
Verwendete Methoden
- Herstellung von DMEM-Medien mit Neutralrot.
- Verwendung einer Glas-Transferpipette und eines geschärften Wolframs.
- Entfernung von Albumin von der spitzen Eierschalenendung mithilfe einer Spritze.
- Ersetzen des Wirtsvorderhirns durch Spendergewebe.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine effektive Isolierung des basalen Vorderhirns zur Analyse.
- Vorführung des Verfahrens durch einen Wissenschaftler.
- Erfolgreiche Beurteilung der Gewebeinteraktionen ohne Kontamination.
- Erkenntnisse zur Rolle des basalen Vorderhirns bei der kraniofazialen Entwicklung.
Schlussfolgerungen
- Die Transplantationstechnik ist ein wertvolles Hilfsmittel zur Untersuchung der kraniofazialen Entwicklung.
- Die Isolierung des basalen Vorderhirns erhöht die Genauigkeit von Entwicklungsbeurteilungen.
- Diese Methode kann auf weiterführende Forschung in der Entwicklungsneurowissenschaft angewandt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht eine präzise Beurteilung der Gewebesignale bei der kraniofazialen Entwicklung, indem sie den basalen Vorderhirnbereich von störenden Beiträgen der Neuralleiste isoliert. Sie unterstützt die mechanistische Risikominderung bei der Zielvalidierung, indem sie verdeutlicht, wie vom Gehirn stammende Signale morphogenetische Signalwege wie den Sonic-hedgehog-Weg in der frontonasalen ektodermalen Zone regulieren. Der Ansatz bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung entwicklungsbiologischer Signalwege mit vorhersagbarer Zuverlässigkeit in der frühen Entdeckungsphase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen über Wechselwirkungen zwischen Gehirn und Gesichtsgewebe in der Wirbeltierentwicklung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch die Isolierung der Signalgebungseigenschaften des basalen Vorderhirns.
- Prädiktiver Wert: Stärkt die Vorhersagegenauigkeit, indem Manipulationen des basalen Vorderhirns mit Veränderungen der SHH-Expressionsdomänen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte chimäre Systeme zur quantitativen Beurteilung der Morphogen-Expression.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebetransplantation, um reproduzierbare Assayauswertungen über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg zu gewährleisten.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Erzeugung mehrerer Chimären, um geringe Überlebensraten auszugleichen und analytische Robustheit sicherzustellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus der Entdeckungsphase mit präklinischen Modellen der kraniofazialen Musterbildung.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Klärt die upstream liegenden Regulatoren von SHH, einem zentralen Signalweg bei der Modellierung angeborener Störungen.
- Krankheitsrelevante Systeme: Nutzt aviäre Chimären, um konservierte Mechanismen der Gesichtsdevelopment bei Wirbeltieren zu untersuchen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen Gewebeinteraktionsassays das Target-Vertrauen vor den Bemühungen zur Identifizierung von Leitverbindungen beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Signalzentren in der kraniofazialen Morphogenese.
- Analystauchung: Erzeugt standardisierte biologische Systeme für die quantitative SHH-Expressionsanalyse.
- Analytik: Ermöglicht die Ganzpräparat-In-situ-Hybridisierung, um räumliche Genexpressionsänderungen als zentrale Messgröße zu erfassen.
- Translationale Forschung: Stellt eine mechanistische Kontinuität von der Transplantation neuralen Gewebes bis hin zu faziellen Phänotypausprägungen bereit.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung gewebespezifischer Beiträge zu Entwicklungsprozessen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem basale vordere Hirnsignale bei der Gesichtsentwicklung isoliert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Transplantations- und Wirtsvorbereitungstechniken.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Klärung der upstream regulierenden Faktoren pharmakologisch ansprechbarer Signalwege wie SHH.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Gewebeinteraktionsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im mikrochirurgischen Umgang mit Gewebe und der Manipulation von Vogelembryonen.
- Benötigt spezialisierte Werkzeuge wie geschärfte Wolframnadeln und Glas-Transferpipetten.
- Setzt standardisierte Inkubations- und Stadieneinteilungsprotokolle für Wirt- und Spenderembryonen voraus.
- Beinhaltet die Optimierung der Vorbereitung der Transplantationsstelle, um Eigelbverlust zu verhindern und die Lebensfähigkeit des Wirts sicherzustellen.
- Wird durch niedrige Überlebensraten der Embryonen begrenzt, was eine hohe Stichprobengröße für zuverlässige Analysen erforderlich macht.
