Name: Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine Gewebe-Transplantationstechnik zur Untersuchung von Interaktionen zwischen basalem Vorderhirn und Gesicht. Diese Methode isoliert das Vorderhirn und verhindert Kontamination mit Neuralleistenzellen.

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Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsarbeiten wurden vom National Institute of Dental and Craniofacial Research der National Institutes of Health unter den Fördernummern R01DE019648, R01DE018234 und R01DE019638 unterstützt.

Die Weiße Pekin-Ente (Anas platyrhynchos), das Weiße Leghornhuhn (Gallus gallus) und die Japanische Wachtel (Cortunix coturnix japonica) werden bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer inkubiert, bis sie bei HH7/817 aufeinander abgestimmt sind.
1. Aufbereitung des Spendergewebes
HINWEIS: Die Vorbereitung von Reagenzien und Werkzeugen und das Öffnen von Eiern für experimentelle Manipulationen wurde beschrieben6.
<ol><li>Bereiten Sie DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärften Wolframnadeln vor.</li>
	<li>Legen Sie die Embryonen frei (wie in6 gezeigt).</li>
	<li>Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im Stadium 7/8. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln6 , um vorsichtig ein Stück des Vorderhirns mit einer Länge von ~0,3 mm und einer Breite von 0,2 mm einzuschneiden, und achten Sie darauf, dass Sie das darunter liegende Endoderm nicht einschließen, indem Sie die Nadel unter das Vorderhirn schieben, so dass die Nadel parallel zur Achse des Neuralrohrs ist.</li>
	<li>Entnahme des Transplantats mit der Glastransferpipette aus dem Spenderembryo.</li>
	<li>Übertragen Sie das Transplantat für 2 Minuten in DMEM, das neutrales Rot (0,01 % in PBS, 23 °C) enthält, um es zu färben, und legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist.</li>
</ol>2. Den Host vorbereiten
<ol><li>Befruchtete Eier des weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer bis HH7/8 17 bebrüten.</li>
	<li>Legen Sie die Embryonen frei (wie in6 gezeigt).</li>
	<li>Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie sie vorsichtig abschneiden und dann ein 0,3 mm x 0,2 mm großes Stück basales Vorderhirn von der linken Seite entfernen, um das Transplantat aufzunehmen, wie es bei der Isolierung des Spendergewebes der Fall war.</li>
	<li>Achten Sie darauf, eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms zu vermeiden, die offensichtlich wird, wenn Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten. Dies erfordert Übung und nicht alle Versuche werden erfolgreich sein.</li>
	<li>Nach dem Transfer auf den Wirt6 ist das Transplantat so zu positionieren, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt.</li>
	<li>Legen Sie das Klebeband fest über das Loch und bringen Sie den Embryo für die entsprechende Zeit zur Analyse in den 37 °C heißen Inkubator zurück.</li>
</ol>

<ol><li>Waddington, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Mechanics+of+Chicken+and+Duck+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos.</a> Nature. 125, 924-925 (1930).</li>
<li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+neural+crest+in+patterning+of+avian+cranial+skeletal%2C+connective%2C+and+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues.</a> Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).</li>
<li>Borue, X., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+aberrant+craniofacial+myogenesis+by+grafted+trunk+somitic+and+segmental+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm.</a> Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).</li>
<li>Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quail-chick chimeras.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+signaling+properties+of+ectodermal+epithelia+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).</li>
<li>Griffin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+dosage+determines+midfacial+integration+and+polarity+within+the+nasal+and+optic+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules.</a> Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).</li>
<li>Schneider, R. A., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origins+of+beak+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origins of beak morphology.</a> Science. 299 (5606), 565-568 (2003).</li>
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<li>Fish, J. L., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+species-specific+contributions+to+craniofacial+development+using+quail-duck+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+and+the+origin+of+species-specific+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Neural crest and the origin of species-specific pattern.</a> Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).</li>
<li>Sohal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reciprocal+forebrain+transplantation+on+motility+and+hatching+in+chick+and+duck+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos.</a> Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+avian+brain+chimeras+reveal+that+large+brain+size+differences+are+influenced+by+cell-interdependent+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes.</a> PLoS One. 7 (7), 42477(2012).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+pattern+the+surface+cephalic+ectoderm+during+FEZ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation.</a> Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+brain+induce+variation+in+avian+facial+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Signals from the brain induce variation in avian facial shape.</a> Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+Between+the+Morphology+of+Sonic+Hedgehog+Expression+Domains+and+Embryonic+Craniofacial+Shape%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape.</a> Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genesis+of+cartilage+size+and+shape+during+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The genesis of cartilage size and shape during development and evolution.</a> Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).</li>
<li>Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchyme-dependent+BMP+signaling+directs+the+timing+of+mandibular+osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis.</a> Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).</li>
</ol>

Alle Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die beschriebene Methode erlaubt es, die Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem angrenzenden Ektoderm zu untersuchen. Dieser Ansatz unterscheidet sich von bisherigen Vorderhirntransplantationsmethoden dadurch, dass das Spendergewebe auf das ventrale Vorderhirn beschränkt war. Dadurch wird die Transplantation der Neuralleistenzellen eliminiert, von denen gezeigt wurde, dass sie an der Musterung der Gesichtsmorphologie beteiligt sind 9,10. Dahe...

Ein Großteil der aktuellen Forschung in der Entwicklungsbiologie konzentriert sich auf die Rolle der Gene bei der Formung von Embryonen. Es gibt gute Werkzeuge, um Entwicklungsmechanismen aus genetischer Sicht zu untersuchen. Embryonen werden jedoch als Reaktion auf Gewebeinteraktionen zusammengesetzt und durchlaufen eine Morphogenese. Das Vogelsystem ist ein klassisches Instrument, um die Vielfalt der Gewebeinteraktionen zu beurteilen, die die Entwicklung regulieren, und zwar aus folgenden Gründen: Die Embryologie ist gut verstanden, die Embryonen sind leicht zugänglich, die Werkzeuge zur Analyse der Vogelsysteme sind gut entwickelt und die Embryonen sind kostengünstig.
Das Transplantationssystem von Vögeln wird seit fast einem Jahrhundert häufig zur Rückverfolgung von Abstammungslinien und zur Beurteilung von Gewebeinteraktionen während der Entwicklung eingesetzt 1,2,3,4. Dieses System wurde verwendet, um ein Signalzentrum, die frontonasale ektodermale Zone (FEZ), zu untersuchen, die die Morphogenese des Oberkiefers reguliert5, und es wurde ein Video veröffentlicht, das diese Technik zuvor beschriebenhat 6. Neben Wachtel-Küken wurden auch andere Arten verwendet, um Chimären für die Analyse von Gewebeinteraktionen zu erzeugen. Zum Beispiel wurde die Maus-FEZ vonWildtyp-7- und mutierten Mäusen8 transplantiert, und andere haben ein Enten-, Wachtel- und Kükensystem verwendet, um die Rolle der Neuralleiste bei der Strukturierung des Gesichtsskelettszu untersuchen 9,10,11,12.
In dieser Arbeit wurde die Rolle des Vorderhirns bei der Regulation des Genexpressionsmusters in der FEZ durch die reziproke Transplantation des ventralen Vorderhirns zwischen Wachtel-, Enten- und Kükenembryonen untersucht, da ein Signal aus dem Vorderhirn benötigt wird, um die Expression von Sonic hedgehog in der FEZ zu induzieren. Vorderhirntransplantationen sind kein Einzelfall auf diesem Gebiet. Diese Transplantate wurden verwendet, um die Entwicklung der Motilität in Wachtel- und Entenembryonenzu beurteilen 13, obwohl in diesen Experimenten auch Gewebe transplantiert wurden, die zu nicht-neuronalen Derivaten beitrugen. In anderen Arbeiten wurden Hörkreise bei Vögeln durch Vorderhirntransplantation untersucht14, aber diese Transplantate enthielten mutmaßliche Neuralleistenzellen, die zur Gesichtsformbeitragen 9,10 und an der Regulierung der SHH-Expression im FEZbeteiligt sind 15. Daher wurde ein System entwickelt, bei dem nur das ventrale Vorderhirn von einer Vogelart auf eine andere transplantiert wird, bevor das Neuralrohr verschlossen wird, um die Rolle des Gehirns bei der Gesichtsformzu beurteilen 16 (Abbildung 1A,B). Bei dieser Methode kam es zu keiner Neuralleistenkontamination des Transplantats. In diesem Artikel wird die Methode veranschaulicht, die erwarteten Ergebnisse beschrieben und die Herausforderungen diskutiert.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm Petrischale</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>553-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Nr. 5 Dumont Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipets</td><td>Thermofisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>QCPN Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank, Iowa University, Iowa, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Wolframnadel</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr></tbody></table>

erstellung von vogel-vorderhirn-chimären zur beurteilung der gesichtsentwicklung

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

Der Vogelembryo wird seit mehr als einem Jahrhundert als Modellsystem verwendet und hat zu einem grundlegenden Verständnis der Entwicklung von Wirbeltieren geführt. Eine der Stärken dieses Modellsystems besteht darin, dass die Wirkung und Interaktion zwischen Geweben direkt in chimären Embryonen beurteilt werden kann. Wir haben bereits gezeigt, dass Signale aus dem Vorderhirn zur Morphogenese des Gesichts beitragen, indem sie die Form der Expressionsdomäne von Sonic hedgehog (SHH) in der frontonasalen ektodermalen Zone (FEZ) regulieren. In diesem Artikel wird die Methode zur Erzeugung der Vorderhirnchimären beschrieben und die Ergebnisse dieser Experimente veranschaulicht.

Beurteilung von Chimärismus und Transplantatkontamination Um die Chimären beurteilen zu können, sollte das Ausmaß des Chimärismus und die Kontamination des Transplantats mit anderen Zelltypen untersucht werden. Die Erzeugung von Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen ermöglicht diese Art der Analyse. Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers können Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden werden (Abbildung 1 C,D</strong...

Dieser Artikel beschreibt eine Gewebetransplantationstechnik, die entwickelt wurde, um die Signal- und Musterbildungseigenschaften des basalen Vorderhirns während der kraniofazialen Entwicklung zu testen.

Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen dem basalen Vorderhirn und dem Gesicht zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie das basale Vorderhirn für die Beurteilung isoliert und eine Kontamination mit Neuralleistenzellen verhindert, die die Analyse verfälschen würde. Der schwierige Teil dieser Technik ist die Entnahme des Vorderhirns aus dem Wirt und der Ersatz durch das Spendergewebe.Das Verfahren wird von Diane Hu, einer Forscherin aus dem Labor von Dr. Ralph Marcucio, demonstriert. Bereiten Sie zunächst DMEM-Medien mit neutralem Rot, einer Glastransferpipette und geschärftem Wolfram vor. Entfernen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel 0,5 Milliliter Albumin vom spitzen Ende der Eierschale.Machen Sie mit der Scherenspitze ein kleines Loch auf der Oberseite der Schale. Legen Sie dann ein Stück Klebeband über das Loch und schneiden Sie eine kreisförmige Öffnung, um den Embryo freizulegen. Färben Sie den Embryo mit neutralem Rot.Entnahme von Gewebetransplantaten aus der linken Seite des basalen Vorderhirns von Embryonen im siebten oder achten Stadium. Verwenden Sie gebogene, geschärfte Wolframnadeln, um ein Stück des Vorderhirns vorsichtig einzuschneiden. Um das darunterliegende Endoderm nicht einzuschließen, schieben Sie die Nadel unter das Vorderhirn und parallel zur Achse des Neuralrohrs.Nehmen Sie das Transplantat mit der Glastransferpipette vom Spenderembryo auf und übertragen Sie es zwei Minuten lang in DMEM, das neutrales Rot enthält, um es zu färben. Legen Sie dann das gefärbte Transplantat in DMEM, das kein neutrales Rot enthält, bis es für die Transplantation bereit ist. Befruchtete Eier von weißen Leghorn-Hühnern bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer bis zum Hamburger-Hamilton-Stadium sieben bis acht bebrüten.Legen Sie die Embryonen frei, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie die Transplantatstelle mit geschärften Wolframnadeln vor, indem Sie ein 0,3 x 0,2 Millimeter großes Stück des basalen Vorderhirns abschneiden und dann entfernen, um das Transplantat aufzunehmen. Vermeiden Sie eine übermäßige Zerstörung des darunter liegenden Endoderms, die offensichtlich wird, da Dotterkörner durch jeden entstandenen Riss austreten.Nachdem Sie das Transplantat auf den Wirt übertragen haben, positionieren Sie das Transplantat so, dass es das exstirpierte basale Vorderhirn des Wirts ersetzt. Legen Sie Klebeband fest über das Loch und bringen Sie die Embryonen in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator zurück, bis sie für die Analyse bereit sind. Ursprünglich wurden Chimären durch die Transplantation von Wachtelgewebe in Kükenembryonen erzeugt.Mit Hilfe des QCPN-Antikörpers wurden Wachtelzellen sichtbar gemacht und vom Wirtsgewebe unterschieden. Das Wachtel-Küken-System bestätigte, dass das gesamte Transplantat nur aus Nervengewebe bestand und nicht mit anderen Zelltypen kontaminiert war. Die Transplantation von Wachtelgewebe in Entenembryonen führte aufgrund eines sich schneller entwickelnden Wachtelgehirns zu stark deformierten Chimären.Dazu wurde eine Transplantation von Entengewebe in Hühnerembryonen durchgeführt. Die daraus resultierenden Enten-Küken-Chimären deuten darauf hin, dass das Gehirn an der Regulierung der Morphologie beteiligt ist. Die Whole-Mountain-C2-Hybridisierung wurde verwendet, um die Expression von Sonic hedgehog in Chimären zu untersuchen.Ähnlich wie bei der Morphologie schien der Ausdruck des Sonic Hedgehog auf der Entenseite der Chimäre eher entenartig zu sein. Das Vorbereiten des Host-Standorts erfordert Übung. Eine große Anzahl von Embryonen überlebt nicht, so dass die Schaffung einer großen Anzahl von Chimären dazu beitragen kann, dass die richtigen Proben für die Analyse geeignet sind.Mit dieser Methode konnte beurteilt werden, wie Signale aus dem Gehirn die Sonic hedgehog-Expressionsdomäne in der frontonasalen ektodermalen Zone formen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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