Abschätzung von Urin-Nanokristallen beim Menschen mittels Calciumfluorophor-Markierung und Nanopartikel-Tracking-Analyse
9. Februar 2021
Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Kalzium im Urin, die Nanokristalle von gesunden Erwachsenen enthält, nachweisen und quantifizieren kann. Die Ergebnisse der aktuellen Studie deuten darauf hin, dass NTA ein potenzielles Werkzeug zur Abschätzung von Urin-Nanokristallen während einer Nierensteinerkrankung sein könnte.
Dieses Protokoll kann speziell kalziumhaltige Nanokristalle im menschlichen Urin nachweisen. Diese Technik könnte möglicherweise nützlich sein, um frühe Stadien der Nierensteinbildung sowie andere Krankheiten im Zusammenhang mit Kristallharnstoff vorherzusagen. Demonstrieren wird das Verfahren von Dr. Parveen Kumar, einem Forscher IV in meinem Labor.
Lassen Sie die Teilnehmer drei Tage lang eine oxalatarme Diät zu sich nehmen und über Nacht fasten. Sammeln Sie dann eine 24-Stunden-Urinprobe von den Teilnehmern, bevor sie eine Oxalatladung konsumieren. Füttern Sie die Teilnehmer mit einem Smoothie mit Obst und Gemüse mit einer Oxalatladung von etwa acht Millimol.
Lassen Sie die Teilnehmer ihren Urin für 24 Stunden nach dem Oxalatkonsum sammeln und am nächsten Tag zurückgeben. Halten Sie alle Urinproben vor der Verarbeitung bei Raumtemperatur. Messen und aufzeichnen Sie den pH-Wert und das Volumen der Urinproben.
Gründlich mischen und 50 Milliliter Urin in ein markiertes steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, waschen Sie es dann und brauen Sie das Pellet erneut mit fünf Millilitern 100% Ethanol auf.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 100% Ethanol. Lagern Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung oder fahren Sie sofort mit dem Färben der Proben fort.
Verdünnen Sie 100 nanometergroße Goldnanopartikel in Reinstwasser im Verhältnis 1:1.000 und verwenden Sie sie zur Optimierung der Einstellungen am Instrument. Verdünnen Sie die Urinproben 20 Mal in Wasser, bevor Sie sie mit fünf Millimolar Fluo-4 AM für 30 Minuten im Dunkeln färben und die Proben mit NTA analysieren. Bereiten Sie Calciumoxalat- und Calciumphosphatkristalle vor, wie im Textmanuskript beschrieben, bevor Sie die NTA-Analyse durchführen.
Schalten Sie den Computer und das Instrument ein, öffnen Sie dann die Software und schalten Sie die Kamera ein. Klicken Sie auf das Aufnahmesymbol in der oberen linken Ecke des Fensters, um den Aufnahmemodus zu starten. Reinigen Sie die Plattform, indem Sie zuerst Luft mit einer Ein-Milliliter-Spritze in sie pumpen, bis die Plattform sauber erscheint.
Geben Sie dem Gerät zwei- bis dreimal vorsichtig Wasser hinzu und verwenden Sie eine weitere Milliliterspritze, um Luftblasen zu entfernen. Sobald die Plattform sauber ist, fügen Sie Wasser hinzu und überprüfen Sie die Kamera auf Verunreinigungen auf der Oberfläche, und fügen Sie dann Goldnanopartikel als Kontrolle zum Probenladepumpeninjektor hinzu, um das Instrument einzurichten. Passen Sie die Kameraebene auf dem Bildschirm oder am Knopf auf der rechten Seite des Instruments an, bis das Bild beginnt, farbige Pixel anzuzeigen, und reduzieren Sie dann die Kameraebene.
Als nächstes passen Sie den Bildschirm an, um das Bild zu optimieren. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Videobild. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt und ziehen Sie das Bild nach oben und unten, um die gesamte Ansicht zu erhalten.
Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit ein und fokussieren Sie die Kamera so, dass die Goldnanopartikel auf dem Kamerabildschirm sichtbar sind. Stellen Sie die Infusionsgeschwindigkeit für die Ersteinrichtung auf hoch ein, um sicherzustellen, dass die Goldnanopartikel erkannt werden. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit nach dem Nachweis auf 50 Mikroliter pro Minute, um Goldnanopartikel zu visualisieren.
Passen Sie die Kameraebene an, um die Partikel zu visualisieren. Für nicht gefärbte Proben passen Sie die Bildschirmverstärkung auf Stufe fünf an, um den Kamerafokus zu erreichen, und stellen Sie die Kameraebene auf acht ein. Sobald der Fokus eingestellt ist, zeichnen Sie die Probe auf.
Reinigen Sie das Gerät nach der Optimierung erneut mit Wasser, bevor Sie andere Proben bewerten, um sicherzustellen, dass der Schlauch sauber ist und keine Partikel vorhanden sind. Um gefärbte Proben zu analysieren, stellen Sie die Kamera auf die Filterposition ein, die den geeigneten Fluoreszenzfilter enthält, und laden Sie verdünnte und gefärbte Proben auf den Probenladepumpeninjektor, wodurch die Geschwindigkeit für die Analyse auf 20 Mikroliter pro Minute reduziert wird. Stellen Sie die Bildschirmverstärkung auf fünf und die Kamerastufe auf 13 ein.
Speichern Sie die Daten nach jeder Messung. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Nanopartikeln für alle fünf Messwerte für jede einzelne Probe und analysieren Sie die Daten anhand der Standardabweichung oder des Standardfehlers des Mittelwerts. Verwenden Sie T-Tests für die gepaarte Analyse.
Fluo-4 AM konnte sowohl an Calciumoxalatkristalle binden, die zwischen 50 und 270 Nanometer groß waren und eine mittlere Konzentration von 1.260 Millionen Partikeln pro Milliliter aufwiesen, als auch an Calciumphosphatkristalle, die zwischen 30 und 225 Nanometern lagen und eine mittlere Konzentration von 2.220 Millionen Partikeln pro Milliliter aufwiesen. 24-Stunden-Urinproben, die vor der Oxalatbelastung gesammelt wurden, enthielten einige Nanokristalle im Urin zwischen 110 und 300 Nanometern Größe. Im Gegensatz dazu gab es einen signifikanten Anstieg der Nanokristalle im Urin in Postoxalatproben.
Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu bestätigen, wurden die Proben dreimal gemessen und es gab keine signifikanten Unterschiede bei den technischen Replikaten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, kann es zu Schwierigkeiten beim Hinzufügen von Proben ohne Blasen zur Maschine geben. Um dies zu verhindern, fügen Sie der Maschine Luft und Wasser hinzu und fügen Sie dann langsam Proben hinzu.
Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie Ihre Proben kontinuierlich überwachen und dass keine Blasen vorhanden sind. Diese neue Methode wird an Personen mit Calciumoxalat-Nierensteinerkrankung getestet, um das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen und / oder das Nierensteinrisiko vorherzusagen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Anwendung der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) zur Detektion und Quantifizierung von Kalzium enthaltenden Nanokristallen im Urin, was zum Verständnis der Nierensteinerkrankung beitragen könnte. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NTA als wertvolles Werkzeug zur Abschätzung von Ur-Nanokristallen dienen könnte.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nephrologie
- Nanotechnologie
- Urologie
Hintergrund
- Nierensteine sind ein häufiges Gesundheitsproblem, das mit Harnkristallen assoziiert ist.
- Calciumhaltige Nanokristalle können auf frühe Stadien der Nierensteinbildung hinweisen.
- Aktuelle Methoden zur Detektion dieser Kristalle können unzureichend sein.
- Die NTA bietet einen neuartigen Ansatz zur Quantifizierung von urinären Nanokristallen.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Wirksamkeit der NTA bei der Detektion von kalziumhaltigen Nanokristallen im Urin.
- Beurteilung des Potenzials der NTA bei der Vorhersage von Nierensteinleiden.
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Urinprobenanalyse.
Verwendete Methoden
- Die Teilnehmer befolgten eine oxalatarme Diät und lieferten 24-Stunden-Urinproben.
- Die Urinproben wurden verarbeitet und mittels NTA analysiert.
- Zur Kalibrierung des Instruments wurden Gold-Nanopartikel verwendet.
- Die Färbung mit Fluo-4 AM wurde angewendet, um Kalziumkristalle sichtbar zu machen.
Hauptergebnisse
- Es wurden signifikante Unterschiede in den Konzentrationen von Harnnanokristallen vor und nach Oxalatbelastung beobachtet.
- Calciumoxalat- und Phosphatkristalle wurden erfolgreich detektiert und quantifiziert.
- Die Methode zeigte eine gute Reproduzierbarkeit mit minimaler Variation bei technischen Wiederholungen.
- Es wurden Schwierigkeiten beim Probenumgang festgestellt, insbesondere im Hinblick auf die Bildung von Blasen.
Schlussfolgerungen
- Die NTA ist eine aussichtsreiche Technik zur Überwachung von Harn-Nanokristallen.
- Diese Methode könnte die Früherkennung von Nierensteinleiden verbessern.
- Weitere Studien sind erforderlich, um ihre Anwendung in klinischen Umgebungen zu validieren.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Der Nachweis von Harn-Nanokristallen liefert einen frühen mechanistischen Einblick in die Pathogenese von Nierensteinen und ermöglicht eine prädiktive Risikobewertung vor der klinischen Steinbildung. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung in der Nephrologie, indem er calciumhaltige Nanokristalle als Biomarker pathologischer Kristallisation quantifiziert. Die Methode bietet eine skalierbare, quantitative Messgröße zur Bewertung krankheitsmodifizierender Interventionen in der präklinischen und translationsmedizinischen Forschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Messung der Nanokristallbelastung als funktionellen Endpunkt der harnstoffmäßigen Übersättigung.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten, fluoreszenzbasierten Assay für Calciumoxalat- und Phosphat-Nanokristalle unter Verwendung der Fluo-4-AM-Färbung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Validierung präklinischer Modelle durch Korrelation der Nanokristallbelastung mit dem Risiko epithelialer Schädigungen in vitro.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Die NTA liefert nach der Ethanolreinigung und Fluorochrom-Färbung größenauflösende, quantitative Partikelzahlen.
- Reproduzierbarkeit: Technische Wiederholungen zeigen minimale Variationen, was die Präzision des Assays für Längsschnittstudien unterstützt.
- Skalierbarkeit: Das Verfahren ermöglicht die Verarbeitung großer Probenmengen durch standardisierte Zentrifugations- und Verdünnungsschritte.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Nachweis von Nanokristallurie bei gesunden Menschen unter Oxalatbelastung zur Modellierung früher steinbildender Zustände.
- Translationale Kontinuität: Verbindet in-vitro-Befunde zur Nanokristall-Zytotoxizität mit dem Nachweis von Harnbiomarkern in vivo.
- Risikostratifizierung: Ermöglicht die longitudinale Überwachung von Schwankungen der Nanokristalle, um den Zeitpunkt prophylaktischer Maßnahmen zu bestimmen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein und bietet einen quantitativen Biomarker für Kristallisationswege.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Bildung von Nanokristallen als direkter Indikator für die Urin-Übersättigung mit Mineralien quantifiziert wird.
- Screening: Ermöglicht proben, die für Assays bereit sind und über definierte Größen- und Konzentrationsparameter verfügen, zur Untersuchung von Substanzbibliotheken.
- Analytik: Erzeugt Daten zur Partikelkonzentration und Größenverteilung, die einer statistischen Vergleichbarkeit über verschiedene Bedingungen hinweg zugänglich sind.
- Translationale Forschung: Unterstützt Bemühungen zur Qualifizierung von Biomarkern, indem ein nachweisbares, mechanistisch verknüpftes urinäres Signal bereitgestellt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Quantifizierung von Nanokristallen über verschiedene Krankheitsmodelle und Interventionsstudien hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei Kristallisationswegen, indem eine direkte Zählung von Nanokristallen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Ethanolwäsche und Gerätekalibrierung mit Goldnanopartikeln.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine frühzeitige Erkennung pro-kristallogener Verschiebungen im Urin ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen, die auf die Urinübersättigung oder Hemmung des Kristallwachstums abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Nanopartikel-Verfolgungsanalyse und der Fluoreszenzmikroskopie.
- Abhängig von NTA-Geräten mit Fluoreszenzfiltern und kalibrierten Probeninjektionssystemen.
- Erfordert standardisierte Urinsammlung, pH- und Volumenaufzeichnung sowie ethanolbasierte Reinigung, um Kontaminationen zu vermeiden.
- Erfordert die Optimierung der Probenverdünnung und der Färbedauer, um Aggregation oder Löschung zu verhindern.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit, die Bildung von Blasen während der Probenzugabe zu minimieren, um eine genaue Partikelverfolgung sicherzustellen.
