Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

Dieses Protokoll ist wichtig, da es Patientenmaterial verwendet. Wenn der Patient die Krankheit hat, sollte die Verwendung seiner Zellen die biologische Reaktion des Patienten genauer widerspiegeln. Diese Technik ist einfach durchzuführen, unkompliziert und erfordert keine ausgeklügelte Ausrüstung.

Diese Methoden können beispielsweise zur Diagnose eingesetzt werden, um nachzuweisen, dass eine RYR1-Mutation die Calciumhomöostase funktionell verändert, sowie um die mögliche therapeutische Funktion einer Verbindung zu testen. Abhängig von den Kenntnissen und technischen Fähigkeiten des einzelnen Forschers sollten Testexperimente durchgeführt werden, bevor tatsächliche Patientenproben verwendet werden. Um Veränderungen in der intrazellulären Calciumkonzentration von EBV-transformierten B-Lymphozyten zu überwachen, resuspendieren Sie die immortalisierten B-Zellen bei einer einmaligen Konzentration von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in Krebs Ringers Lösung und Fura-2 AM auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolaren für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspenieren Sie das Pellet in frischer Krebs Ringer-Lösung in einer zweifachen Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Kurz vor Beginn des Experiments zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspenieren Sie die Zellen schnell in 1,5 Milliliter Krebs Ringers Lösung, ergänzt mit 0,5 Millimolar EGTA, aber ohne Zusatz von Kalzium. Übertragen Sie die Zellen auf eine Drei-Milliliter-Spektrofluorometer-Küvette aus Glas und zeichnen Sie das Fluoreszenzverhältnis auf einem Spektrofluorometer auf, das mit einem Magnetrührer ausgestattet ist, der für etwa 30 Sekunden auf maximale Geschwindigkeit und 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Um die Calciumfreisetzungsreaktion in einzelnen Zellen zu beurteilen, einmal 106 Fura-2 AM beladene Zellen in einem Milliliter Krebs Ringers Lösung, ergänzt mit einem Millimolar Calciumchlorid, auf einzelne Poly-L-Lysin-beschichtete Glasabdeckungsrutschen und inkubieren Sie die Deckgläser bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator für 30 Minuten. Wenn sich die Zellen festgeklebt haben, legen Sie einen Deckschlicker in eine Perfusionskammer und beginnen Sie, die Zellen bei einer Zwei-Milliliter-Krebs Ringer-Lösung zu perfundieren, die mit einer Durchflussrate von einem Millimolaren Kalzium pro Minute ergänzt wird. Mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv und den entsprechenden Filtern ausgestattet ist, können Sie Online-Messungen mit einem softwaregesteuerten, ladungsgekoppelten Gerätekameraaufsatz in Sekundenabständen zu einer festen Belichtungszeit aufzeichnen.

Um eine Zellstimulation zu erreichen, verwenden Sie einen Zellperfusionsstimulator mit 12 Klappen, um die verschiedenen Konzentrationen des Agonisten hinzuzufügen. Um Myotuben aus menschlichen Muskelbiopsien zu isolieren, spülen Sie zuerst die Biopsie mit sterilem PBS aus, um überschüssiges Blut zu entfernen, bevor Sie das Gewebe in kleine, 0,5 bis einen Millimeter große Fragmente zerkleinern. Platzieren Sie zwei bis drei Fragmente in einzelne Einsätze in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte, die 1,5 Milliliter menschliches Muskelwachstumsmedium pro Vertiefung und 500 Mikroliter Medium pro Einsatz enthält, und legen Sie die Platte in den Zellkulturinkubator.

Um Veränderungen der Kalziumexpression in menschlichen Myotuben zu messen, wenn mehrkernige Myotuben beobachtet werden können, ersetzen Sie die Myotube-Kulturüberstände durch frisches Differenzierungsmedium, ergänzt mit 10 Mikrolitern Ein-Millimolar Fura-2 AM für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation wird eine Glasabdeckungs-Slipkultur in die Perfusionskammer überführt und die Zellen mit der Krebs Ringer-Lösung, die mit zweimillilarem Calciumchlorid ergänzt wird, gespült. Führen Sie dann Online-Kalziummessungen durch, wie mit einem 20-fachen Wasserimmersionsziel demonstriert.

In dieser repräsentativen Analyse wurde ein schneller Anstieg des Kalziums in EBV-immortalisierten B-Lymphozyten nach der Zugabe von Agonisten beobachtet, der im Laufe der Zeit langsam wieder auf ein Ruheniveau zurückging. In einem ähnlichen Experiment verursachte die Zugabe von 400-nanomolarem Thapsigargin einen großen Kalziumtransienten, der einen Spitzenfluoreszenzwert von 2,4 beliebigen Einheiten erreichte. Dieser Fluoreszenzwert wurde bei der Erstellung der entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurve als 100 % angesehen.

In dieser Analyse wurden immortalisierte B-Zellen für 20 Sekunden mit fünf Millimolarem Koffein stimuliert, was zu einer sofortigen Erhöhung des Fluoreszenzverhältnisses von 340 und 380 Nanometern führte. Für jede getestete Koffeinkonzentration wurde der koffeininduzierte Peak im Verhältnis von 340 x 380 Nanometer Fluoreszenz berechnet und zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve verwendet. Die Kalziumfreisetzung aus differenzierten Myotuben kann auch als Reaktion auf die Spülung mit Kaliumchlorid, unterschiedlichen Konzentrationen von Agonisten und / oder Koffein beurteilt werden, und es können normale Dosis-Wirkungs-Kurven erzeugt werden.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellen richtig mit Fura-2 geladen sind und dass sowohl die Wellenlängen 340 als auch 380 Nanometer auf die Zugabe des Agonisten reagieren. Intrazelluläre Calciummessungen mit fluoreszierenden Calciumindikatoren können in den meisten Säugetierzellen untersucht werden und können auf die Untersuchung intrazellulärer Calciumveränderungen als Reaktion auf verschiedene Reize angewendet werden.