TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing
26. Februar 2021
Wir beschreiben Methoden zur Untersuchung von TGF-β2-induzierter EndMT in Endothelzellen, indem wir Veränderungen der Zellmorphologie beobachten und die Expression EndMT-bedingte Markerveränderungen mittels Immunfluoreszenzfärbung untersuchen. CrispR/Cas9-Gen-Editing wurde beschrieben und verwendet, um das Gen zu erschöpfen, das für Snail kodiert, um seine Rolle bei TGF-β2-induzierter EndMT zu untersuchen.
Der endotheliale zu mesenchymale Übergang ist ein zellulärer Prozess, bei dem Endothelzellen ihre Kopfsteinpflastermorphologie in einen fibroblastenartigen Phänotyp verwandeln. Und das Zytokin TGF-beta, transformierender Wachstumsfaktor beta, ist ein Haupttreiber dieses Übergangs. Die Analyse der Veränderungen in der Zellmorphologie und der Expressionsniveaus von endothelialen und mesenchymalen Markern ermöglicht es uns, das Auftreten eines endothelialen zu mesenchymalen Übergangs zu beurteilen.
Neue Daten verbinden den endothelialen zu mesenchymalen Übergangsprozess mit verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fibrose. Und die Daten deuten darauf hin, dass die Intervention von therapeutischem Nutzen sein kann. Durch die Stimulierung des endothelialen zu mesenchymalen Übergangsprozesses, der während der Embryogenese und Organentwicklung auftritt, können wir möglicherweise mesenchymale Gewebe wie Knorpel, Knochen und Muskeln regenerieren.
Um das intrazelluläre Protein durch Immunfloureszenzfärbung nachzuweisen, ist eine Zellpermeabilisierung mit 0,1% Triton X-100 notwendig, damit die Antikörper die Zellmembranen passieren können. Mit dieser Videodemonstration werden die Forscher ein gutes Verständnis dafür bekommen, wie sie die Rolle von Zytokinen wie TGF-beta beim endothelialen zu mesenchymalen Übergang untersuchen können. Zuerst 1 x 10 ^5 spiegelnde Pankreasinsel-endotheliale MS1-Zellen in DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin auf einer 0,1% gelatinebeschichteten Kulturplatte.
Nach der Inkubation über Nacht im Zellkulturinkubator waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie mit zwei Millilitern 0,25% Trypsin, 0,02% EDTA-Lösung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius behandelt werden. Wenn sich die Zellen zu lösen begonnen haben, löschen Sie die Reaktion mit fünf Millilitern des vollständigen Kulturmediums ab und übertragen Sie die resultierende Zellsuspension zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Das Pellet wird zum Zählen in vier Milliliter frischem, vollständigem Medium resuspendiert.
Und 1 x 10^3 Zellen pro Kubikzentimeter in einen neuen Zellkulturbehälter einsäen. Nach der Kultur über Nacht werden zwei Vertiefungen mit fünf mikromolaren TGF-beta-Rezeptorkinase-Inhibitoren SB-431542 und zwei Vertiefungen mit DMSO-Lösungsmittelkontrolle behandelt. Und legen Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.
Am Ende der Inkubation behandeln Sie zwei Vertiefungen mit Fahrzeugsteuerung und zwei Vertiefungen mit TGF-beta 2. Verwenden Sie nach drei Tagen ein invertiertes Mikroskop, um die Zellmorphologie jeder Zellbehandlungsgruppe unter Hellfeldbildgebung zu untersuchen. Um endMT-bedingte Markerveränderungen durch immunfluoreszierende Färbung zu beurteilen, lösen Sie die Zellen von einer geeigneten MS1-Zellkultur, wie gezeigt.
Und säen Sie die Zellen mit einer Konzentration von 1,9 x 10 ^ 3 Zellen auf 0,1% gelatinebeschichteten 12 Millimeter runden Deckgläsern, die in einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte platziert sind. Nach der Nachtkultur behandeln Sie die Zellen drei Tage lang mit einem Nanogramm Milliliter TGF-beta 2. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren die behandelten Kulturen mit 300 Mikrolitern 4% Formaldehyd pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Am Ende der Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, bevor Sie die Zellen mit 300 Mikrolitern von 0,1% Triton X-100 und PBS pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisieren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal in PBS und blockieren die Zellen mit 3% BSA in PBS. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen mit primären PECAM-1- und SM22-alpha-Antikörpern für 45 Minuten bei Raumtemperatur beschriften, gefolgt von drei Wäschen in PBS.
Nach der letzten Wäsche die Zellen mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellen dreimal mit PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit einem DAPI-ergänzten Montagemedium und einem Abdeckschein montieren. Versiegeln Sie dann die Kanten des Deckzettels mit klarem Nagellack und bilden Sie die Zellmarkerexpression durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit den entsprechenden Filtern nach Standard-Bildgebungsprotokollen. Nach dreitägiger Behandlung mit TGF-beta 2 verlieren endotheliale MS1-Zellen ihre kopfsteinpflasterartige Struktur und differenzieren sich zu spindelförmigen mesenchymalen Zellen.
Diese TGF-beta 2-induzierte Differenzierung wird unterdrückt, wenn die Zellen dem TGF-beta-Rezeptorkinase-Inhibitor SB-431542 ausgesetzt werden. Die Expression des endothelialen Proteins PECAM-1 ist nach TGF-beta-2-Stimulation stark verringert, während der mesenchymale Faktor SM-22 alpha stark hochreguliert ist. Darüber hinaus wird Snail durch TGF-beta 2-Exposition deutlich hochreguliert, während die Slug-Expression nicht beeinflusst wird.
Wie beobachtet, kann die CRISPR-Cas9-Genbearbeitung verwendet werden, um die Einführung von zwei unabhängigen Schnecken-Einzelleiter-RNAs in Cas9-exprimierende MS1-Zellen zu erleichtern, um die Schneckenexpression zu stören. Der Knockout von Snail reicht aus, um die fibroblastenähnliche Zellmorphologie, die durch TGF-beta 2 in MS1-Zellen angetrieben wird, zu hemmen und den TGF-beta 2-vermittelten PECAM-1-Rückgang und die SM-22-alpha-Verbesserung zu blockieren. Die Beurteilung von Veränderungen in der Zellmorphologie und Expression endothelialer und mesenchymaler Marker durch Immunfluoreszenz kann durch Messung der Expression dieser Marker auf quantitativer PCR in der Western-Blot-Analyse weiter validiert werden.
Diese Technik zum Nachweis des endothelialen zu mesenchymalen Übergangs hat es den Forschern ermöglicht, diese aufkommende Bedeutung als physiologischen Prozess zu untersuchen, der bei mehreren Krankheiten auftritt.
Übersicht
Diese Studie untersucht die durch TGF-β2 induzierte endotheliale zu mesenchymale Transition (EndMT) in endothelialen Zellen unter besonderer Berücksichtigung morphologischer Veränderungen und der Expression von Markern. Die Rolle des Snail-Gens wird mittels CRISPR/Cas9-Genbearbeitung untersucht, um dessen Beitrag zu diesen Prozessen zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Endotheliale-mesenchymale Transition
- Auswirkungen auf Krankheiten wie Krebs und Fibrose
- Therapeutisches Potenzial der Modulation der EndMT
Hintergrund
- Die EndMT beinhaltet die Umwandlung von endothelialen Zellen in einen mesenchymal-ähnlichen Zustand.
- TGF-β2 ist ein entscheidender Zytokin, der diesen Übergang antreibt.
- Die Bedeutung der EndMT bei verschiedenen Erkrankungen und in der regenerativen Medizin wird hervorgehoben.
Verwendete Methoden
- Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung der Zellmorphologie und Markerausprägung
- MS1-Endothelzellmodell
- CRISPR/Cas9-Geneditierung zur Unterbrechung der Snail-Expression
Hauptergebnisse
- Die Analyse zeigt morphologische Veränderungen in endothelialen MS1-Zellen nach Behandlung mit TGF-β2.
- Die Expression von PECAM-1 nahm ab, während SM-22 alpha zunahm, was auf das Auftreten einer EndMT hinweist.
- Der Knockout von Snail hemmt die morphologischen Veränderungen und bestätigt damit seine Rolle bei der TGF-β2-induzierten EndMT.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie verdeutlicht die Mechanismen der TGF-β2-induzierten EndMT und die Rolle von Snail.
- Die Ergebnisse deuten auf mögliche therapeutische Strategien hin, die auf die EndMT bei verschiedenen Erkrankungen abzielen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das Verständnis der durch TGF-β2 induzierten endothelialen zu mesenchymalen Transition (EndMT) liefert Einblicke in die Mechanismen von Krankheitswegen, die für Fibrose, Krebs und kardiovaskuläre Erkrankungen relevant sind. Die genetische Untersuchung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9 ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen und die Absicherung therapeutischer Hypothesen in der frühen Entdeckungsphase. Dieser Ansatz trägt dazu bei, die Vorhersagekraft bei der Identifizierung neuartiger Regulatoren der endothelialen Plastizität für translationale Anwendungen zu stärken.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht die Rolle spezifischer Transkriptionsfaktoren wie Snail bei der durch TGF-β2 getriebenen phänotypischen Umwandlung.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung putativer EndMT-Modulatoren durch genetischen Knockout in einem geeigneten endothelialen Modell.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen, indem kausale Zusammenhänge zwischen Genexpression und mesenchymalen Übergangsphänotypen etabliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Etabliert einen quantitativen, immunfluoreszenzbasierten Nachweis für EndMT unter Verwendung endothelialer (PECAM-1) und mesenchymaler (SM-22-alpha) Marker.
- Operationaler Wert: Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares Assay-Format zur Überwachung von durch TGF-β2 induzierten phänotypischen Veränderungen in MS1-Zellen.
- Skalierbarkeitswert: Kompatibel mit genetischen und pharmakologischen Screening-Formaten zur Identifizierung neuartiger EndMT-Regulatoren.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Verbindet die Modulation der EndMT mit potenziellen therapeutischen Strategien bei Fibrose und Krebs, bei denen endotheliale Plastizität zur Pathogenese beiträgt.
- Präklinische Relevanz: Verwendet ein murines Modell von pankreatischen mikrovaskulären endothelialen Zellen, um konservierte Mechanismen der TGF-β2-Signalübertragung zu untersuchen.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Bestätigt Snail als notwendigen Effektor der TGF-β2-induzierten EndMT und stützt damit das Vertrauen in Zielstrukturen bei Strategien zur Hemmung dieses Signalwegs.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und ermöglicht eine mechanistische Ent-Risikobewertung vor der Verbindungsscreening- oder In-vivo-Validierung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zytokinvermittelter transkriptioneller Programme in endothelialen Zellen mittels genetischer Störung.
- Screening: Bietet assaysichere, quantitative morphologische und Biomarker-Auswertungen, die für die Anpassung an High-Content-Screenings geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt multiplexe Daten zur Proteinexpression und -lokalisation mittels Immunfluoreszenz, um die Modulation von Signalwegen zu bewerten.
- Translationale Forschung: Verbindet Phänotypänderungen der Endothelzellen mit krankheitsrelevanten Prozessen wie Fibrose und Stromaformation von Tumoren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der endothelialen Plastizität in verschiedenen Krankheitskontexten und Screening-Kampagnen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine mechanistische Klarheit bezüglich der Regulation der EndMT und reduziert damit die Uneindeutigkeit bei der Zielstrukturwahl für anti-fibrotische oder anti-karzinogene Strategien.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes, reproduzierbares System zur Beurteilung endothelialer Phänotypübergänge mit integrierten Kontrollen (z. B. Hemmung des TGF-β-Rezeptors).
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung eines Targets, indem die Notwendigkeit des Targets in einem krankheitsrelevanten zellulären Kontext vor der Investition validiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von EndMT-modulierenden Targets basierend auf genetischer Validierung.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur endothelialer Zellen, der CRISPR/Cas9-Genbearbeitung und der Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie und standardisierten Bildgebungsprotokollen zur Quantifizierung von Markern voraus.
- Erfordert die Optimierung der Effizienz der Leit-RNA und die Validierung der Knockout-Effizienz in klonalen Populationen.
- Erfordert die Standardisierung der TGF-β2-Dosierung und -Zeitplanung, um eine reproduzierbare EndMT-Induktion über verschiedene Experimente hinweg sicherzustellen.
- Auf In-vitro-Modelle beschränkt; die Ergebnisse bedürfen der Validierung in physiologisch relevanten Systemen wie Ko-Kulturen oder tierischen Krankheitsmodellen.
