Name: Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Methode zur Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Lipidstoffwechsel und Enzymregulation.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Henne-Labors für die Hilfe und konzeptionelle Beratung bei der Fertigstellung dieser Studie. W.M.H. wird durch Mittel der Welch Foundation (I-1873), des NIH NIGMS (GM119768), des Ara Paresghian Medical Research Fund und des UT Southwestern Endowed Scholars Program unterstützt. S.R wurde durch einen T32-Programmzuschuss (5T32GM008297) unterstützt.

1. Wachstum und Markierung von Hefezellen mit 14C-Essigsäure
<ol><li>Impfen Sie eine Hefekultur, indem Sie eine Kolonie von einem Teller pflücken und in 20 ml synthetisches komplettes (SC) Medium mit 2% Dextrose dosieren (siehe Ergänzungsdatei für die Rezeptur von SC-Medien). Bei 30 °C über Nacht mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren. HINWEIS: Wachstumszustand, Probenvolumen und Behandlung unterscheiden sich je nach den lipiden von Interesse. Vor der Durchführung vollständiger Experimente sollten optimale Wachstumsbedingungen und Kulturvolumina empirisch bestimmt werden. Dieses Protokoll diskutiert die Radiomarkierung von Hefekulturen, die in eine stationäre Phase gezüchtet wurden, eine Wachstumsphase, in der sich das Wachstum von Biomembran und Zellen verlangsamt, und die NL-Synthese ist sehr aktiv.</li>
	<li>Messen Sie den OD600 der Nachtkultur mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie die Hefezellkultur auf einen endgültigen OD600 von 0,2 in 50 ml frischem SC-Medium mit 2% Dextrose. Züchten Sie die Zellen für 24 h oder bis sie die stationäre Phase erreicht haben (die üblicherweise durch eine flache Auskleidung der Zellverdopplung OD600-Messung definiert wird).</li>
	<li>Bevor Sie die Zellen sammeln, machen Sie den Abschreckpuffer (siehe Ergänzungsdatei für Details). Machen Sie zwei 20-ml-Aliquoten Abschreckpuffer für jede Probe (d. h. 40 ml Abschreckpuffer für jede Probe) und teilen Sie sie gleichmäßig in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf). Lagern Sie die Quenching Buffer Aliquots bei -80 °C für den zukünftigen Gebrauch.</li>
	<li>Sobald die Kulturen die gewünschte OD- oder Wachstumsphase erreicht haben, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 10 min. Während sich die Proben in der Zentrifuge befinden, werden Radiomarkierungsmedien vorbereitet, indem Sie[1-14C] Essigsäure-Natriumsalz zu dextrosefreien SC-Medien in einer Endkonzentration von 10 μCi / ml hinzufügen. ACHTUNG: Bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen sollte immer eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Befolgen Sie immer die lokalen Richtlinien für die ordnungsgemäße Lagerung, Verwendung und Entsorgung radioaktiver Stoffe. HINWEIS: Sowohl die Konzentration von 14C-Essigsäure in den Markierungsmedien als auch die Radiomarkierungszeit sollten entsprechend dem/den interessierenden Metaboliten angepasst werden. Hier wird eine 20-minütige Radiomarkierungsimpulsinkubation verwendet, die ausreicht, um NL-Arten mit einem Abundanzbereich zu kennzeichnen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen und waschen Sie das Zellpellet einmal mit 20 ml dextrosefreiem SC-Medium, indem Sie das Pellet mit einer Pipette resusperieren. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 5 min.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml dextrosefreies SC-Medium und übertragen Sie die Zellen in ein markiertes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 2 min.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen erneut in 500 μL dextrosefreien SC-Medien. Kühlen Sie eine Zentrifuge vor, die für konische Rohre mit 50 ml auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung ausgestattet ist.</li>
	<li>Beginnen Sie die Radiomarkierungsphase, indem Sie schnell 500 μL Radiomarkierungsmedien zu jeder 500 μL Zellsuspension hinzufügen (endgültige 14C-Essigsäurekonzentration = 5 μCi/ml). Inkubieren Sie die Röhrchen in einem rotierenden Inkubator bei 30 °C für 20 min. 2 min vor Ende der Etikettierzeit, geben Sie für jede Probe einen 20 mL Aliquotenabschreckpuffer aus dem -80 °C Gefrierschrank in einen Eimer Eis</li>
	<li>Sobald die Radiomarkierungsperiode beendet ist, verwenden Sie eine Pipette, um die gesamte 1-ml-Probe in 20 ml Kaltabschreckpuffer zu tauchen. Wirbeln Sie die konischen Röhrchen für 5-10 s vor, um sicherzustellen, dass die Probe gründlich mit dem Abschreckpuffer gemischt wurde. Inkubieren Sie die Proben im Abschreckpuffer für 2 min auf Eis.</li>
	<li>Sammeln Sie das Zellpellet durch Spinnen in einer Zentrifuge bei 5.000 x g für 3 min eingestellt auf -10 °C oder auf die niedrigste Temperatureinstellung. Während sich die Probenröhrchen drehen, wird ein weiterer Satz Abschreckpuffer-Aliquot aus dem Gefrierfach -80 °C in einen mit Eis gefüllten Eimer (d. h. ein 20-ml-Röhrchen Abschreckpuffer pro Probe) übertragen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Abschreckpufferüberstand aus den Zellpellets und ersetzen Sie ihn durch einen frischen, kalten Abschreckpuffer von 20 ml. Wirbeln Sie die Proben aus und schütteln Sie sie, bis das Pellet vom Boden des konischen Rohrs gelöst und vollständig im Abschreckpuffer resuspendiert wurde. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 5.000 x g für 3 min bei -10 °C, um die Zellen zu sammeln.</li>
	<li>Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie gründlich alle Abschreckpuffer aus den Proben, indem Sie den Überstand abgießen und den Überschuss mit einer Pipette entfernen. Rohre zur Weiterverarbeitung bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Isolierung der Gesamtlipide aus Hefe
HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Lipidisolierung basiert auf einer etablierten und häufig verwendeten Methode, die die meisten neutralen Lipidarten effizient extrahiert17,18. VORSICHT: Wenn Sie organische Lösungsmittel verwenden, tragen Sie immer geeignete PSA und arbeiten Sie, wenn möglich, in einem Abzug. Vermeiden Sie während der Lipidextraktion die Verwendung von Kunststoffen, die mit organischen Lösungsmitteln nicht kompatibel sind. Polypropylentuben sind für das folgende Protokoll geeignet.
<ol><li>Wiegen Sie für jede Probe 0,3 g säuregewaschene Glasperlen und lagern Sie sie in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Zellpellets aus dem -80 °C Gefrierschrank und halten Sie sie auf Eis. 350 μL Methanol und 700 μL Chloroform zu jeder Probe geben, resuspendieren und in Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewogenen Glasperlen geben.</li>
	<li>Lyse Zellen durch Rühren von Röhrchen auf einem Wirbel 3x für 1 min, mit 30 s Inkubationen auf Eis zwischen den Agitationen. Alternativ können Zellen mit einem Mini-Perlenschläger für drei 1-minütige Zyklen lysiert werden. Speichern Sie 25-30 μL ganzzelliges Lysat in einem separaten Röhrchen für die Szintillationszählung. HINWEIS: Das gespeicherte Lysat wird verwendet, um die relative Menge an Radioisotop zu bestimmen, die von jeder Probe während der Pulsperiode aufgenommen wird, was die Menge jeder auf die TLC-Platte geladenen Probe beeinflusst. Dies wird in Schritt 3.2 weiter erläutert.</li>
	<li>Gießen Sie den gesamten Inhalt des 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens in ein 15-ml-Glaszentrifugenröhrchen [Röhrchen A]. Waschen Sie die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 1 ml Methanol und Wirbel für 10-15 s. Die 1-ml-Methanolwäsche wird in Rohr A gegeben und 2 ml Chloroform in Rohr A gegeben, gefolgt von 400 μL Wasser für ein endgültiges Probenvolumen von 4,45 ml.</li>
	<li>Wirbelproben für 1 min, gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g. Nach der Zentrifugation sollten die wässrige (obere) und organische (untere) Phase visuell klar getrennt werden, wobei Zelltrümmer an der Grenzfläche liegen.</li>
	<li>Sammeln Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas die organische Phase von Rohr A und wechseln Sie zu einem neuen 15-ml-Glaszentrifugenrohr (Rohr B). 1 ml 1M KCl in Röhre B geben. Zu Rohr A werden 1 ml Methanol und 2 ml Chloroform sowie 200 μL MiliQ-Wasser hinzugefügt. Wiederholen Sie die Wirbel- und Zentrifugationsschritte auf Rohr A.</li>
	<li>Sammeln Sie erneut die organische Phase von Röhre A und geben Sie sie in Röhre B. Entsorgen Sie Rohr A in einem geeigneten Behälter. Wirbelrohr B für 1 min gefolgt von einer 5 min Zentrifugation bei 1.000 x g.</li>
	<li>Entfernen Sie die obere wässrige Schicht aus Rohr B und entsorgen Sie sie. Fügen Sie 1 ml frisches 1 M KCl zurück in rohr B und wiederholen Sie den Vortexing/Zentrifugationsschritt. Sobald die Schichten getrennt sind, sammeln Sie vorsichtig die gesamte untere organische Schicht in einer markierten 4-ml-Glasfläschchen. HINWEIS: In diesem Schritt können Lipidextrakte bei -80 °C gelagert oder das Protokoll für die TLC-Trennung von Lipiden fortgesetzt werden.</li>
</ol>3. Trennung und Quantifizierung von radioisotopenmarkierten NLs durch Dünnschichtchromatographie
<ol><li>Wenn Lipidextrakte bei -80 °C platziert wurden, langsam auf Raumtemperatur bringen, indem Sie auf Eis und anschließend auf einer Tischplatte inkubieren. Lösungsmittel aus Lipidextrakten durch Vakuumtrocknung oder unter Verwendung eines sanften Inertgasstroms (z. B. Argon oder Stickstoff) vollständig verdampfen. In der Zwischenzeit einen Backofen auf 145 °C vorheizen, um die TLC-Platte zu erhitzen.</li>
	<li>Bevor Proben auf die TLC-Platte geladen werden können, bestimmen Sie die relativen Mengen an Radiomarkierung, die von den Zellen aufgenommen werden. 10 μL des gesamten Zelllysats aus Schritt 2.2 in eine 6 mL Glasszintillationsfläschchen pipetten, 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzufügen und Fläschchen in ein Rack legen. Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um den cpm oder dpm jeder Probe mit der Option count single rack zu messen, die auf eine Zählzeit von 1 minute eingestellt ist. Messen Sie jedes ganze Zelllysat in doppelter Ausfertigung, um einen Durchschnitt für jede Probe zu erhalten. Passen Sie die Lademenge entsprechend einem Wildtyp oder einer Referenzprobe an HINWEIS: Die Menge jeder Probe, die auf die TLC-Platte geladen werden soll, kann mit der folgenden Gleichung bestimmt werden: (durchschnittliche Probenanzahl)/(durchschnittliche Referenzanzahl) x gewünschtes Ladevolumen. Wenn beispielsweise 20 μL der Referenzprobe auf die TLC-Platte geladen werden sollen und eine durchschnittliche Anzahl von 1.000 aufwies, dann werden in einer experimentellen Probe mit einer durchschnittlichen Anzahl von 2.000 10 μL auf die TLC-Platte geladen.</li>
	<li>Rekonstituieren Sie die Probenlipide in 40-50 μL von 1:1 (v/v%) Chloroform:Methanol durch Wirbeln für 5 min. Bereiten Sie 101 ml des mobilen Phasenlösungsmittels in einem Glasmesszylinder vor (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse für ein Beispiel für eine Trennung der wichtigsten NL-Spezies durch ein 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäurelösungsmittel).</li>
	<li>Gießen Sie das Lösungsmittel in eine TLC-Glaskammer, die ein 20 x 20 TLC-Sättigungspad und einen eng anliegenden Deckel enthält. Bereiten Sie eine kanalierte 20 x 20 Kieselgel 60 G Platte vor, indem Sie vorsichtig eine Linie 1,5 cm über dem Boden der Platte mit einem Bleistift markieren. Die Linie bezeichnet den Ursprung und wo die Lipide geladen werden. Beschriften Sie unterhalb der Linie vorsichtig die Probe, die in jeder Spur geladen wird. Sobald die TLC-Platte vorbereitet wurde, inkubieren Sie die Platte in einem 145 °C-Ofen für mindestens 30 Minuten, um die Platte vorzuwärmen und überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Sobald die Platte ausreichend erhitzt wurde und das TLC-Sättigungspad mit Lösungsmittel gesättigt ist, entfernen Sie die TLC-Platte aus dem Ofen und fahren Sie sofort mit dem Laden der TLC-Platte fort. Das Beladen der Platte während des Warms sorgt für eine schnelle Lösungsmittelverdampfung. Laden Sie für jede Lipidart von Interesse 5-20 μg eines gereinigten Lipidstandards auf eine Spur der TLC-Platte, um die Trennung und den erwarteten Migrationsabstand zu verfolgen. Mit einer Pipette können Sie 5 μL Der Probe auf den Ursprung jeder Spur stellen, die sich 1,5 cm über dem Boden der TLC-Platte befindet. Wiederholtes Laden von 5 μL-Spots, bis 20-40 μL Probe in jede Spur geladen wurden. HINWEIS: 5-20 μg unmarkierte gereinigte Lipide können jeder Probenspur als Tracer zugesetzt werden, die nach TLC-Trennung von Lipiden gefärbt und visualisiert werden können. Das Vorhandensein eines gefärbten Standards ermöglicht eine einfache Verfolgung und Exzision von radioaktiv markierten Lipidbändern für die anschließende Szintillationszählung. Welche gereinigten Standards auf die Platte geladen werden, wird von der interessierenden NL-Spezies bestimmt. Im Abschnitt Repräsentatives Ergebnis finden Sie Beispiele für die Trennung von Ölsäure (FFA), 1,2 Dioleoylglycerin (DG), Triolein (TG), Cholesterin (Chol), Cholesteryl-Linoleat (SE) und Squalen in Bahnen neben den Probenbahnen.</li>
	<li>Sobald die Standard- und die Experimentellen proben geladen wurden, legen Sie die Platte in die Entwicklungskammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel die Oberseite der Platte erreicht hat (40-60 min). Sobald die Platte vollständig entwickelt ist, entfernen Sie sie aus der Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten im Abzug trocknen.</li>
	<li>Nachdem die Platte getrocknet ist, bedecken Sie sie mit Kunststofffolie und legen Sie sie in eine Entwicklungskassette mit einem Autoradiographie-Bildschirm. Lassen Sie die Platte mit dem Bildschirm für 24-48 h entwickeln.</li>
</ol>4. Visualisierung und Quantifizierung von TLC-getrennten Lipiden
<ol><li>Entfernen Sie den Bildschirm von der Entwicklungskassette und legen Sie ihn in einen Phosphor-Imager. Wählen Sie die Option Phosphor Imaging und entwickeln Sie bei 800-1000 V. HINWEIS: Die Phosphorbildgebung bietet eine qualitative Ansicht der radioaktiv markierten Lipide auf der TLC-Platte. Die Quantifizierung radioaktiv markierter Lipide erfolgt jedoch am besten durch Szintillationszählung, die anschließend beschrieben wird.</li>
	<li>100 ml p-Anisaldehyd-Reagenz mischen (siehe Ergänzungsdatei)und in einer Glassprühflasche abfüllen. Besprühen Sie die TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz, bis die Kieselsäure gesättigt ist. Backen Sie den Teller in einem 145 °C Ofen für 5 min, oder bis Bänder erschienen sind.</li>
	<li>Um einzelne Lipidspezies mit Hilfe der Radiolabel-Szintillationszählung zu quantifizieren, verwenden Sie eine Rasierklinge, um das Kieselgel von der Glas-TLC-Platte abzukratzen. Übertragen Sie jedes Kieselgelband, das einer einzelnen radioaktiv markierten Lipidspezies entspricht, in eine Glasszintillationsfläschchen und fügen Sie 6 ml Szintillationsflüssigkeit hinzu. Wirbeln Sie kräftig, bis das Kieselsäureband auf kleine Stücke reduziert wurde.<ol>
<li>Alternativ können Lipide aus dem Kieselgelband mit dem Lipidextraktionsprotokoll in Abschnitt 3 extrahiert werden. Wenn Lipide aus dem Kieselgel extrahiert werden, verdampfen Sie das Lösungsmittel vollständig wie in Schritt 3.1 und fügen Sie den getrockneten Lipiden 6 mL Szintillationsflüssigkeit hinzu. Legen Sie das Rack mit den Szintillationsfläschchen in einen Szintillationszähler. Wählen Sie die Option Einzelrack zählen und passen Sie die Zählzeit auf 2 Minuten pro Durchstechflasche an. Die Ergebnisse des Szintillationszählers werden gedruckt und können als Balkendiagramm visualisiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen an der Erstellung dieses Manuskripts gibt.

Hier wird ein vielseitiges Radiolabeling-Protokoll zur quantitativen Überwachung der Synthese von NL-Arten in Hefe vorgestellt. Dieses Protokoll ist sehr modular aufgebaut, so dass das Verfahren innerhalb von 3-6 Tagen abgeschlossen werden kann. Darüber hinaus gibt es eine Fülle von Literatur über die Verwendung von TLC zur Trennung von Lipidspezies und Metaboliten, die es dem Benutzer ermöglichen sollte, mehrere Lipidspezies von Interesse mit einem einfachen Wechsel der TLC-Lösungsmittelsysteme nachzuweisen<sup class="x...

Acetyl-CoA ist der grundlegende Baustein verschiedener Biomoleküle, einschließlich neutraler Lipide (NLs), die als vielseitige biomolekulare Währung für den Aufbau von Membranen, die Erzeugung von ATP und die Regulierung der Zellsignalisierung dienen1,2. Die Verfügbarkeit von NLs, die in einen dieser jeweiligen Pfade geschoben werden können, wird teilweise durch ihre Speicherung reguliert. Lipidtröpfchen (LDs), zytoplasmatische Organellen, die aus hydrophoben Kernen von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) bestehen, sind die Hauptspeicherkompartimente der meisten zellulären NLs. Als solche sequestrieren und regulieren LDs NLs, die abgebaut und anschließend für biochemische und metabolische Prozesse genutzt werden können3,4. Es ist bekannt, dass die Fehlregulation von NL- und LD-assoziierten Proteinen mit dem Auftreten von Pathologien wie Lipodystrophie und metabolischen Syndromen korreliert5,6. Aus diesem So konzentriert sich die aktuelle LD-Forschung intensiv darauf, wie die NL-Synthese räumlich, zeitlich und über verschiedene Gewebe mehrzelliger Organismen hinweg reguliert wird. Aufgrund der allgegenwärtigen zellulären Rolle für NLs sind viele Enzyme, die für die Synthese und Regulation von NLs verantwortlich sind, in allen Eukaryotenerhalten 7. Tatsächlich speichern sogar einige Prokaryoten NLs in LDs8. Daher waren genetisch traktierbare Modellorganismen wie Saccharomyces cerevisiae (Knospenhefe) für die Untersuchung der NL-Synthese und -Regulation nützlich.
Die Trennung und Quantifizierung von NLs aus Zellextrakten kann auf vielfältige Weise erreicht werden, einschließlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Die vielleicht einfachste Methode zur Trennung von NLs ist die Dünnschichtchromatographie (TLC), die eine anschließende densitometrische Quantifizierung aus einer Standardkurve12,13ermöglicht. Obwohl TLC nur eine kurskörnige Trennung von NLs bietet, bleibt es eine leistungsstarke Technik, da es kostengünstig ist und die schnelle Trennung von NLs von mehreren Proben gleichzeitig ermöglicht. Zwei der größten Herausforderungen bei der Untersuchung von NLs mittels TLC sind: 1) das breite Spektrum der zellulären Häufigkeiten von NL-Spezies und ihren Zwischenprodukten und 2) das Spektrum der Hydrophilie / Hydrophobie von Lipidzwischenprodukten innerhalb der NL-Synthesewege. Folglich ist die Quantifizierung von NL-Arten über TLC typischerweise auf die am häufigsten vorkommenden Arten beschränkt; Die Einführung einer 14-C-Essigsäure-Radiomarkierung kann jedoch den Nachweis von Zwischenprodukten mit geringer Abundanz innerhalb von NL-Signalwegen erheblich verbessern. Essigsäure wird durch die Acetyl-CoA-Synthetase ACS214schnell in Acetyl-CoA umgewandelt, wodurch 14C-Essigsäure ein geeignetes Radiomarkierungssubstrat in Hefe15ist. Zusätzlich kann die Trennung sowohl von hydrophoben NLs als auch von hydrophilen Zwischenprodukten von NLs durch TLC durch den Einsatz mehrerer Lösungsmittelsysteme erreicht werden16. Hier wird ein Verfahren zur Trennung von NLs mittels 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung in Hefe vorgestellt. Lipide, die während der Pulszeit markiert werden, werden anschließend durch ein gut etabliertes Totallipidisolationsprotokoll17isoliert, gefolgt von der Trennung der NL-Spezies durch TLC. Die Entwicklung von TLC-Platten sowohl durch Autoradiographie zur Visualisierung markierter Lipide als auch durch ein chemisches Spray zur Visualisierung von Gesamtlipiden ermöglicht mehrere Quantifizierungsmethoden. Einzelne Lipidbänder können auch leicht mit einer Rasierklinge aus der TLC-Platte extrahiert werden, und die Szintillationszählung kann verwendet werden, um die Menge an radioaktiv markiertem Material innerhalb des Bandes zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Essigsäure-Natriumsalz-spezifische Aktivität: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 Dioleoyl-sn-glycerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 proof absolutes Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Säuregewaschene Glasperlen 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Braune Glühbirnen für Pastuer-Pipetten</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat >99%</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 Szintillationszähler</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (HPLC-Qualität)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin >99%</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl-Linoleat >98%</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrierte Schwefelsäure</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning konische Röhrchen 50 ml, Polypropylen mit Zentristarkappe</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose, wasserfrei</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether wasserfrei</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Trockenschrank</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume Szintillationsflüssigkeit</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Zentrifuge</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Speicher Phosphorsieb</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 Imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eisessig, ACS-Qualität</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glas 6mL Szintillationsfläschchen</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Deckel für Zentrifugenröhrchen</td><td>aus Glas Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>aus Glas Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur-Glaspipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hexan, wasserfrei</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adenin >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin >99%</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin >98</td>%<td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartat >98%</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein >97%</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure Mononatriumsalz-Monohydrat >98</td>%<td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin >99%</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycin >99%</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin >99%</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucin >98%</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin >98%</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin >98%</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin, HPLC-Qualität</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanin, Reagenzqualität</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serin >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Theronin, Reagenzqualität</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophan >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Uracil >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin >98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, ACS-Qualität</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure >99</td>%<td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-Anisaldehyd</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Petrolether, ACS-Klasse</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholin, Dipalmitoyl >99%</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, ACS</td><td>Grade Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid Pellets, zertifiziert ACS</td><td></td><td>Fisher S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Squalen >98%</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinsäure kristallin/zertifiziert</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC Sättigungspad</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC Kieselgel 60G Glaskanalplatte</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Keine fluoreszierenden Indikatoren</td></tr><tr><td>Transparente Kunststofffolie</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Triolein >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Belichtungskassette</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Hefe Stickstoffbase ohne Ammoniumsulfat und Aminosäuren</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der neutralen lipidsynthese in saccharomyces cerevisiae durch metabolische markierung und dünnschichtchromatographie

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Neutrale Lipide (NLs) sind eine Klasse von hydrophoben, ladungslosen Biomolekülen, die eine Schlüsselrolle bei der Energie- und Lipidhomöostase spielen. NLs werden de novo aus Acetyl-CoA synthetisiert und kommen in Eukaryoten vor allem in Form von Triglyceriden (TGs) und Sterolestern (SEs) vor. Die Enzyme, die für die Synthese von NLs verantwortlich sind, sind von Saccharomyces cerevisiae (Hefe) für den Menschen hoch konserviert, was Hefe zu einem nützlichen Modellorganismus macht, um die Funktion und Regulation von NL-Stoffwechselenzymen zu analysieren. Während viel darüber bekannt ist, wie Acetyl-CoA in eine Vielzahl von NL-Spezies umgewandelt wird, werden Mechanismen zur Regulierung von NL-Stoffwechselenzymen und wie Fehlregulation zu zellulären Pathologien beitragen kann, immer noch entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von NL-Arten wurden in jahrzehntelanger Forschung entwickelt und eingesetzt; Ein quantitatives und einfaches Protokoll für die umfassende Charakterisierung der wichtigsten NL-Arten wurde jedoch nicht diskutiert. Hier wird eine einfache und anpassungsfähige Methode zur Quantifizierung der De-novo-Synthese wichtiger NL-Arten in Hefe vorgestellt. Wir wenden 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierungen in Verbindung mit Dünnschichtchromatographie an, um eine Vielzahl physiologisch wichtiger NLs zu trennen und zu quantifizieren. Darüber hinaus kann diese Methode leicht angewendet werden, um in vivo Reaktionsraten von NL-Enzymen oder den Abbau von NL-Spezies im Laufe der Zeit zu untersuchen.

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass die Markierung, Detektion und Quantifizierung von NL-Spezies durch 14C-Essigsäure-Stoffwechselmarkierung erreicht werden kann. Wichtige NL-Spezies können in einem Lösungsmittelsystem von 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexan:Petrolether:Diethylether:Essigsäure(Abbildung 1A,B)getrennt werden. Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung von markierten freien Fettsäuren (FFA), Triacylglycerin (TG), Diacylglycerin (DG), Chole...

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Diese Technik verwendet Instrumente, die in den meisten Laborumgebungen üblich sind, und ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben. Diese Methode kann wichtige Erkenntnisse darüber liefern, wie Fettstoffwechselenzyme in einem zellulären Kontext und in verschiedenen genetischen Hintergründen reguliert werden. Impfen Sie eine Kolonie von einer Hefekulturplatte in 20 Milliliter SC-Medien mit 2% Dextrose und inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für die Nacht mit Schütteln bei 200 U / min.Am nächsten Tag die Kultur in 50 Millilitern frischem Medium auf einen endverabschnenden ZÄHLER von 0,2 verdünnen und 24 Stunden lang züchten, bis die stationäre Phase erreicht ist. Bereiten Sie für jede Probe zwei 20-Milliliter-Aliquoten Abschreckpuffer vor und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Bereiten Sie gleichzeitig Radiomarkierungsmedien vor, indem Sie Essigsäure-Natriumsalz zu dextrosefreien SC-Medien in einer Endkonzentration von 10 Mikrocurie pro Milliliter hinzufügen.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.100 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Zellpellet einmalig mit 20 Millilitern dextrosefreien SC-Medien. Sammeln Sie die Zellen wieder auf, indem Sie fünf Minuten lang bei 4.100 x g zentrifugieren und mit dextoren freien Medien in ein markiertes zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Zentrifugieren Sie die Zellen für weitere zwei Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern dextrosefreier SC-Medien und beginnen Sie die Radiomarkierungsphase, indem Sie schnell 500 Mikroliter Radiomarkierungsmedien zu jeder Zellsuspension hinzufügen. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem rotierenden Inkubator bei 30 Grad Celsius für 20 Minuten.In der Zwischenzeit die für 50 Milliliter konische Röhrchen ausgerüstete Zentrifuge auf minus 10 Grad Celsius vorkühlen und einen 20 Milliliter Aliquots Abschreckpuffer auftauen. Nach Ablauf der Radiomarkierungszeit wird die gesamte Ein-Milliliter-Probe mit einer Pipette in einen aufgetauten Abschreckpuffer auf Eis getaucht. Sammeln Sie das Zellpellet, indem Sie es in einer vorgekühlten Zentrifuge bei 5.000 x g für drei Minuten drehen und 20 Milliliter frischen Kaltabschreckpuffer hinzufügen.Wirbeln Sie die Proben aus und schütteln Sie sie vollständig im Abschreckpuffer und zentrifugieren Sie die Proben erneut, um die Zellen zu sammeln. Sobald die Zellen pelletiert sind, entfernen Sie gründlich alle Abschreckpuffer aus den Proben, indem Sie den Überstand abgießen und den Überschuss mit einer Pipette entfernen. Lagern Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius zur Weiterverarbeitung.Wiegen Sie 0,3 Gramm säuregewaschene Glasperlen für jede Probe und lagern Sie sie in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Entfernen Sie die Zellpellets aus dem minus 80 Grad Gefrierfach und legen Sie sie auf Eis. Dann fügen Sie 350 Mikroliter Methanol und 700 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe hinzu und resuspendieren Sie die Zellen.Geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen mit vorgewogenen Glasperlen. Lyse der Zellen durch Dreitexen für eine Minute, mit 30 Sekunden Inkubation auf Eis zwischen den Agitationen. Gießen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen und beschriften Sie das Röhrchen als Röhrchen A.Waschen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Methanol, wirbeln Sie es ein und gießen Sie das Methanol in Rohr A.Fügen Sie zwei Milliliter Chloroform hinzu, gefolgt von 400 Mikrolitern Wasser in Rohr A für ein endgültiges Probenvolumen von 4,45 Millilitern.Wirbeln Sie die Proben für eine Minute vor, gefolgt von einer fünfminütigen Zentrifugation bei 1000 x g, um die wässrigen und organischen Phasen mit Zelltrümmern an der Grenzfläche klar zu trennen. Sammeln Sie mit einer Glasweidepipette die organische Phase in einem neuen Glaszentrifugenröhrchen mit der Bezeichnung B und fügen Sie einen Milliliter eines molaren Kaliumchlorids hinzu. Fügen Sie ein Milliliter Methanol und zwei Milliliter Chloroform in Rohr A hinzu und wiederholen Sie die Wirbel- und Zentrifugationsschritte.Wirbel- und Zentrifugenröhrchen B zur Trennung der wässrigen und organischen Phase. Entfernen Sie die obere wässrige Schicht und sammeln Sie die gesamte untere organische Schicht in einem vier Milliliter Glasfläschchen. Das Lösungsmittel aus den Lipidextrakten durch Trocknen unter Inertgas vollständig verdampfen und einen Ofen auf 145 Grad Celsius vorheizen, um die TLC-Platte zu erhitzen.Bestimmen Sie die relativen Mengen an Radiomarkierung, die von den Zellen aufgenommen werden, bevor Sie sie auf die TLC-Platte laden. Rekonstituieren Sie die Probenlipide in 40 bis 50 Mikroliter Chloroform und Methanol, die im Verhältnis eins zu eins gemischt werden, indem Sie fünf Minuten lang vortexen. Bereiten Sie 101 Milliliter des mobilen Phasenlösungsmittels in einem Glasmesszylinder vor.Dann gießen Sie das Lösungsmittel in eine Glas-TLC-Kammer, die ein 20 x 20 TLC-Sättigungspad und einen eng anliegenden Deckel enthält. Bereiten Sie eine kanalisierte 20 x 20 Kieselgel-60G-Platte vor und markieren Sie eine Linie 1,5 Zentimeter über dem Boden der Platte mit einem Bleistift. Sobald die Platte ausreichend erhitzt und das TLC-Sättigungspad mit Lösungsmittel gesättigt ist, entfernen Sie die TLC-Platte aus dem Ofen und fahren Sie sofort mit dem Laden fort.Mit einer Pipette fünf Mikroliter Proben auf den Ursprung jeder Spur, die sich 1,5 Zentimeter über dem Boden der TLC-Platte befindet, und wiederholen Sie die Belastung, bis 20 bis 40 Mikroliter Proben in jede Spur geladen wurden. Sobald der Standard und die Proben geladen wurden, legen Sie die Platte in die Entwicklungskammer und warten Sie, bis das Lösungsmittel die Oberseite der Platte erreicht hat. Wenn die Platte vollständig entwickelt ist, entfernen Sie sie aus der Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten im Abzug trocknen.Nachdem die Platte getrocknet ist, bedecken Sie sie mit Kunststofffolie und legen Sie sie in eine Entwicklungskassette mit einem Autoradiographie-Bildschirm. Entfernen Sie den Bildschirm von der Entwicklungskassette und legen Sie ihn in einen Phosphor-Imager. Besprühen Sie die TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz, bis die Kieselsäure gesättigt ist, und backen Sie sie dann in einem 145-Grad-Ofen für fünf Minuten oder bis Bänder aufgetreten sind.Um Lipidspezies zu quantifizieren, kratzen Sie das Kieselgel, das einzelne Lipidspezies enthält, und übertragen Sie sie auf Glasszintillationsfläschchen. Fügen Sie sechs Milliliter Szintillationsflüssigkeit hinzu und wirbeln Sie kräftig, bis das Kieselsäureband auf kleine Stücke reduziert wurde. Legen Sie das Rack mit den Szintillationsfläschchen in einen Szintillationszähler und zählen Sie, indem Sie die Zählzeit auf zwei Minuten pro Durchstechflasche einstellen.Die Phosphorbildgebung ermöglicht die Visualisierung des Autoradiogramms von markierungsfreien Fettsäuren, Triacylglycerin, Diacylglycerin, Cholesterin und Squalan. Es wurde gezeigt, dass gereinigte Lipidspezies bei dieser Methode abgetrennt und anschließend durch Besprühen der TLC-Platte mit p-Anisaldehyd-Reagenz visualisiert werden können. Zu den visualisierten Arten gehören neben sterilen Estern auch alle zuvor genannten Lipide.Durch die Anwendung einer 10-minütigen Verfolgungsperiode in radioaktiven Medien nach dem Puls wurde beobachtet, dass am Hauptpool von Squalan verschwand und das Gesamtcholesterin erhöht wurde. In ähnlicher Weise korrelierte das Auftreten von Diacylglycerin in der Verfolgungsperiode mit einer Abnahme des Signals der freien Fettsäuren. Vor der Durchführung des vollständigen Protokolls ist es wichtig zu bestimmen, ob die Zellen die Essigsäure-Radiomarkierung im Wachstumszustand und im genetischen Hintergrund von Interesse aufnehmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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