Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin
3. März 2021
Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.
Das Screening kleinerer organischer Verbindungen, sogenannter Fragmente, mittels Röntgenkristallographie ist eine effiziente Methode zur Identifizierung von Molekülen, die Ausgangspunkte für die Wirkstoffforschung oder die Entwicklung biochemischer Werkzeugverbindungen sind. Das kristallographische Fragmentscreening ergab nicht nur die Identität, sondern auch, wo und wie sich die Fragmente auf der Oberfläche des untersuchten Proteins binden. Diese Technik kann auf jedem biochemisch oder medizinisch relevanten Proteinziel angewendet werden, für das geeignete Proteinkristalle gezüchtet werden können.
Die Qualität der Ergebnisse ist eng mit der Qualität der Probenhandhabung verbunden. Wir glauben, dass die folgende visuelle Demonstration den Forschern helfen wird, qualitativ hochwertige Experimente durchzuführen. Demonstriert wird das Verfahren von Tatjana Barthel, Doktorandin und Doktorandin in meinem Labor.
Schneiden Sie zunächst den auf Raumtemperatur vorgewärmten Beutel der Siebplatte auf und entfernen Sie dann den Deckel und die Folie von der Siebplatte. Dekantieren Sie die fünf Milliliter einweichende Lösung im Reagenzbehälter. Füllen Sie dann jeden der 96 Behälter der Platte mit 40 Mikrolitern Einweichlösung mit einer 12-Kanal-Pipette.
Legen Sie den leicht zugänglichen Rahmen auf die Siebplatte und befestigen Sie ihn mit den mitgelieferten Klemmen, indem Sie sie auf die linke und rechte Seite des Geräts schieben. Legen Sie die Siebplatte und den leicht zugänglichen Rahmen unter das Mikroskop und schieben Sie den ersten Brunnen auf, indem Sie die jeweilige Acrylglasfliese des Rahmens bewegen. 0,4 Mikroliter Einweichlösung aus dem Reservoir mit einer frischen Pipettenspitze in das Fragment geben, das den Brunnen enthält.
Stellen Sie sicher, dass der Tropfen das getrocknete Fragment bedeckt. Legen Sie die Kristallisationsplatte, die die größten Kristalle enthält, unter das zweite Mikroskop und schneiden Sie die Siegelfolie an einem der Vertiefungen auf. Übertragen Sie mit einer entsprechend großen Schlaufe einen Kristall unter dem ersten Mikroskop auf den Brunnen der Siebplatte.
Waschen Sie die Schlaufe in der vorbereiteten Glasfleckplatte und trocknen Sie sie dann ab, indem Sie sie vorsichtig mit dem Gewebe berühren. Tun Sie dies nach jedem Transfer, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie das Mikroskop, um sicherzustellen, dass der Kristall richtig platziert wurde.
Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Fahren Sie mit der nächsten Bohrung fort und wiederholen Sie den Vorgang für alle verbleibenden Brunnen. Nachdem die Kristalle auf alle 96 Vertiefungen in der Siebplatte übertragen wurden, entfernen Sie die Siebplatte zusammen mit dem leicht zugänglichen Rahmen unter dem Mikroskop und legen Sie sie auf die Bank oder den Tisch.
Entfernen Sie dann den leicht zugänglichen Rahmen von der Siebplatte, versiegeln Sie die Siebplatte mit Siegelfolie und legen Sie sie in den Kristallisationsinkubator oder Schrank, um sie für die zuvor optimierte Einweichzeit zu inkubieren. Zwei Stunden Inkubation sind ausreichend, aber über Nacht kann bequemer sein. Bereiten Sie den Unipuck-Schaum Dewar mit drei Unipuck-Deckeln vor und füllen Sie ihn zur Hälfte mit flüssigem Stickstoff, um ihn auf dem Boden zu halten.
Bewegen Sie den halbgefüllten Dewar auf die Bank und füllen Sie ihn vollständig bis zum Rand. Halten Sie es während des gesamten Experiments bis zum oberen Rand gefüllt und ersetzen Sie den flüssigen Stickstoff häufig. Holen Sie die Siebplatte aus dem Inkubator und entfernen Sie die Folie.
Platzieren Sie den leicht zugänglichen Rahmen oben. Öffnen Sie den ersten Brunnen. Ernten Sie einen Kristall aus dem Tropfen und kühlen Sie ihn in flüssigem Stickstoff ab, indem Sie ihn mit einer schnellen vertikalen Bewegung eintauchen.
Legen Sie die Probe in die richtige Puckposition ein und machen Sie relevante Notizen auf dem Probenverfolgungsblatt. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Kristall. Gehen Sie zum nächsten Brunnen und wiederholen Sie die Positionierung anderer Kristalle, bis alle drei Pucks voll sind.
Kühlen Sie die Unipuck-Basen in flüssigem Stickstoff vor und fügen Sie sie auf die Deckel hinzu. Lagern Sie die Unipucks im Lagerregal in einem Transport-Dewar oder Lager-Dewar. Bewahren Sie sie bis zur Messung in flüssigem Stickstoff bei kryogenen Temperaturen auf.
Wiederholen Sie den gleichen Vorgang der Ernte und Lagerung der Kristalle in Unipucks für die verbleibenden Proben in der Siebplatte. Die Variabilität der Kristallmorphologien nach Durchführung der Fragmenteinweichung und Kristallernte wird hier gezeigt. Sogar Kristalle, die etwas verschlechtert aussehen, wurden aufgenommen, da sie immer noch zu nützlichen Daten führen.
Die Daten wurden an den Beamlines 14.1 und 14.2 am Synchrotron BESSY II gesammelt. Für jede Probe wurde eine Beugungsdatenerfassung durchgeführt. Die Daten wurden mit FragMAXapp analysiert, wobei der Schwerpunkt auf der Kombination von XDSAPP für die Verarbeitung, fspipeline für die Strukturverfeinerung und PenDA für die Treffersuche lag.
Dies führte zu 15 Treffern auf den AR-Proteinkomplex unter Verwendung einer DMSO-freien Einweichbedingung. In einer früheren Kampagne des F2X-Einstiegsbildschirms gegen das gleiche Ziel, einschließlich DMSO im durchnässten Zustand, wurden 20 Treffer gefunden. Das bedeutet, dass 75% der Treffer identifiziert werden können, wenn DMSO weggelassen wird.
Für den Erfolg des Experiments ist es entscheidend, dass die Kristalle bei jedem Schritt des Eingriffs richtig und sorgfältig behandelt werden. Das kristallographische Fragmentscreening hat sich zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, die häufig in der Wissenschaft und in der pharmazeutischen Industrie angewendet wird.
Übersicht
In diesem Artikel wird die kristallographische Fragment-Screening-Methode zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffkandidaten mittels Röntgenkristallographie beschrieben. Das Protokoll zielt darauf ab, die Effizienz von Experimenten durch automatisierte Datenanalyse und optimiertes Probenhandling zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kristallographie
- Wirkstofffindung
- Biochemie
Hintergrund
- Das Fragment-Screening ist eine Technik, die zur Identifizierung kleiner organischer Verbindungen eingesetzt wird, die an Proteine binden können.
- Die Qualität der Ergebnisse hängt stark von der Probenaufbereitung und den Kristallisationstechniken ab.
- Diese Methode kann auf verschiedene biochemisch relevante Proteintargets angewendet werden.
- Die sachgemäße Handhabung der Kristalle ist entscheidend für eine erfolgreiche Datenerfassung.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die kristallographische Fragment-Screening-Methode demonstrieren.
- Einblicke in die Bindungseigenschaften von Fragmenten an Proteinoberflächen liefern.
- Die Ausbeute von Experimenten für die strukturbasierte Ligandenentwicklung verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Screening-Platten mit Einweichlösungen.
- Übertragung der Protein-Kristalle in die Screening-Gele.
- Inkubation der Kristalle unter optimierten Bedingungen.
- Datenerfassung und Analyse mithilfe spezialisierter Software.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von 15 Treffern am AR-Proteinkomplex unter DMSO-freien Bedingungen.
- Der Vergleich mit früheren Experimenten zeigte, dass das Weglassen von DMSO dennoch signifikante Treffer liefern kann.
- Nachweis von Variabilität in Kristallmorphologien und deren Einfluss auf die Datenqualität.
Schlussfolgerungen
- Kristallographisches Fragment-Screening ist eine wertvolle Technik in der Arzneimittelforschung.
- Sorgfältiges Handling der Kristalle ist entscheidend für die Gewinnung zuverlässiger Daten.
- Das Protokoll kann als Leitfaden für Forscher in Wissenschaft und Industrie dienen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die kristallographische Fragment-Screening-Methode ermöglicht die frühzeitige Identifizierung von Liganden-Bindungsmodi mit atomarer Auflösung und unterstützt so die Zielvalidierung sowie die Optimierung von Leitstrukturen in der strukturbasierten Wirkstoffentwicklung. Der am HZB vorgestellte Workflow integriert automatisierte Datenverarbeitung und standardisierte Kristallhandhabung, um die Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung bei der Identifizierung von Fragment-Hits zu verbessern. Dieser Ansatz verringert die mechanistische Unsicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er direkte strukturelle Einblicke in Fragment-Protein-Wechselwirkungen liefert und damit die Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung nachgeschalteter medizinisch-chemischer Arbeiten unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte 3D-Visualisierung von Fragment-Bindungsstellen und damit die mechanistische Absicherung von Target-Hypothesen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die schnelle Durchmusterung von 96-komponentigen Fragmentbibliotheken an Proteinkristallen, um die Plastizität der Bindungsstelle zu untersuchen.
- Prädiktiver Wert: Identifiziert Fragment-Treffer, die als Ausgangspunkte für die strukturgeleitete Optimierung potenter Binder dienen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Elektronendichtekarten zur Bestätigung der Fragmentbesetzung und Bindungskonformation.
- Operativer Wert: Nutzt robotergestützte Probenaustauschsysteme an Synchrotron-Strahllinien für die automatisierte Datensammlung an Hunderten von Kristallen.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Verwendet standardisierte Einweich- und Flash-Freezing-Protokolle, um reproduzierbare, diffraktionsfähige Daten zu gewährleisten.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Mithilfe von CFS identifizierte Fragment-Treffer können zu Leitstrukturen weiterentwickelt werden, die verbesserte pharmakologische Eigenschaften für die präklinische Bewertung aufweisen.
- Mechanistische Ent风险reduktion: Strukturdaten der Fragmentbindung leiten die SAR-Entwicklung und verringern das Risiko von Ausscheidungen während der Optimierung der Leitstrukturen.
- Präklinische Relevanz: Ermöglicht die Beurteilung der Fragment-Effizienz und der Liganden-Effizienz-Metriken, um Chemotypen mit günstigen Entwicklungseigenschaften zu priorisieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der CFS-Arbeitsablauf ist in den frühen Entdeckungsprozess integriert, unterstützt die Zielvalidierung durch strukturelle Charakterisierung und ermöglicht die Identifizierung von Leitverbindungen mittels Fragmentvergrößerung oder Fragmentverknüpfungsstrategien.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung, indem aufgezeigt wird, wo und wie kleine Moleküle an Zielproteine binden.
- Screening: Ermöglicht das parallele Screening von Fragmentbibliotheken mittels automatisierter Kristallhandhabung und datensatzbasierter Datensammlung an Synchrotronanlagen.
- Analytik: Integriert XDSAPP, fspipeline und PenDA zur automatisierten Verarbeitung, Verbesserung und Identifizierung von Treffern aus Beugungsdatensätzen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die strukturbasierte Ligandenentwicklung, indem atomare Bindungsmodi für die Optimierung von Fragmenten bereitgestellt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, wiederverwendbare Plattform für das Fragment-Screening an mehreren Zielproteinen innerhalb eines Entdeckungsportfolios.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in Target-Ligand-Interaktionen durch direkte experimentelle Nachweise des Bindungsmodus.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Kristall-Soaking-, Erntungs- und Kryo-Lagerungsverfahren.
- Strategischer Wert: Erhöht die Effizienz von Hit-zu-Lead-Prozessen, indem Fragmente mit günstigen Bindungsinteraktionen für die medizinische Chemie priorisiert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf den Ergebnissen der Fragment-Screenings und der strukturellen Zugänglichkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinkristallisation, im Umgang mit Kristallen und in der Datensammlung an Synchrotronstrahlungsquellen.
- Setzt Zugang zu hochintensiven Strahllinien und automatisierten Probengebern für Hochdurchsatz-Screenings voraus.
- Benötigt standardisierte Protokolle für die Herstellung von Fragmentbibliotheken, Bedingungen für das Einweichen sowie Datenanalyse-Pipelines.
- Beinhaltet die Zusammenarbeit zwischen Arbeitsgruppen der Strukturbiologie, medizinischen Chemie und Datenanalyse.
- Auf Zielstrukturen beschränkt, für die reproduzierbare, hochwertige Kristalle unter den Bedingungen des Screenings erhalten und aufrechterhalten werden können.
