Name: Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Aufreinigung und 30-fache Expansion von iNKT-Zellen aus der Mausmilz für Immunologie-Studien. Diese Methode liefert große Mengen funktionsfähiger Zellen für in vitro und in vivo Experimente.

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Wir danken Paolo Dellabona und Giulia Casorati für die wissenschaftliche Unterstützung und kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch der NIH Tetramer Core Facility für Maus-CD1d-Tetramer. Die Studie wurde durch das Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (an M.F.) und das Stipendium der Italian Association for Cancer Research (AIRC) 2019-22604 (an G.D.) finanziert.

Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Nr. 1048) am San Raffaele Scientific Institute überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Alle Verfahren müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Milzverarbeitung
<ol><li>Euthanasierung von iVα14-Jα18-Mäusen durch Inhalation von CO2 gemäß der institutionellen Politik. HINWEIS: iVα14-Jα18-Mäuse müssen mindestens 8 Wochen alt sein. Um eine Abstoßung der Zellen aus dem In-vivo-Transfer der Zellen zu vermeiden, bedenken Sie, dass Zellen, die von weiblichen Mäusen isoliert wurden, sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Empfängern adoptiv übertragen werden können, während Zellen, die aus männlichen Mäusen isoliert wurden, nur bei männlichen Empfängern übertragen werden können. Bei In-vitro-Experimenten darf kein Gender Bias berücksichtigt werden. Mehr Mäuse können gepoolt werden, um mehr Zellen zu erhalten.</li>
	<li>Sezieren Sie die Milz der Maus und zerschlagen Sie sie durch ein 70-nm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% fetalem Rinderserum (FBS) zu erhalten.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Inversion und verarbeiten Sie ihn mit Erythrozyten-Lysepuffer. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml sterilem ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysing Buffer, inkubieren Sie für 3 min bei Raumtemperatur und blockieren Sie mit 5 ml PBS mit 2% FBS. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. HINWEIS: ACK ist im Handel erhältlich; es besteht aus einer Lösung von 0,15 MNH4Cl, 10 mMKHCO3und 0,1 mMNa2EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), gelöst in bidistilliertemH2O,pH 7,2-7,4. Wenn hausgemacht, sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,22 μm Filter.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Inversion. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 mL PBS mit 2% FBS und entfernen Sie Fettrückstände durch Pipettieren. Bei Bedarf bündeln Sie die Zellen, die von verschiedenen Mäusen stammen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen und halten Sie 50 μL für die FACS-Analyse.</li>
</ol>2. T-Zell-Anreicherung
HINWEIS: Für die Anreicherungsschritte schnell arbeiten, die Zellen kalt halten und Lösungen verwenden, die über Nacht bei 4 °C vorgekühlt und dann auf Eis gehalten werden
<ol><li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Resuspendieren Sie alle Zellen in der entsprechenden Menge PBS mit 2% FBS (500 μL für 107 Zellen) und Fc-Blocker (2,5 μL x 107 Zellen); 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie mit 1-2 ml MACS-Trennpuffer (MB) pro 107 Gesamtzellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min. HINWEIS: MACS-Puffer ist im Handel erhältlich. Es besteht aus PBS pH 7,2, 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA. Wenn hausgemacht, sterilisieren Sie durch Filtration mit einem 0,22 μm Filter.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand durch Inversion und färben Sie die Zellenmit CD19-FITC und H2(IA b)-FITC (verwenden Sie 5 μL x 107 Zellen in 100 μL MB). Gut mischen und 15 min im Dunkeln bei 4-8 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1−2 ml MB pro 107 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min.</li>
	<li>Pipettieren Sie den Überstand vollständig ab und resuspenieren Sie das Zellpellet in 90 μL MB pro 107 Gesamtzellen. Fügen Sie 10 μL Anti-FITC MicroBeads pro 107 Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und 15 min im Dunkeln bei 4-8 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1−2 ml MB pro 107 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min.</li>
	<li>Den Überstand vollständig abpfeifen und bis zu 1,25 x 108 Zellen in 500 μL MB resuspendieren.</li>
	<li>Platzieren Sie eine LD-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators, um mit der Erschöpfung fortzufahren. Um Verstopfungen zu vermeiden, tragen Sie einen Vorzerlegungsfilter auf die LD-Säule auf und spülen Sie mit 2 ml MB ab.</li>
	<li>Wenn der Säulenbehälter leer ist, tragen Sie die Zellsuspension auf den Filter auf. Sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die die Spalte passieren.</li>
	<li>3 mal mit 1 ml MB waschen, nur wenn der Säulenbehälter leer ist. Sammeln Sie das gesamte Abwasser, das in T-Zellen angereichert wird, und zählen Sie die Zellen. Halten Sie immer 50 μL für die FACS-Analyse bereit.</li>
</ol>3. iNKT-Zellanreicherung
<ol><li>Zentrifugiere bei 300 x g für 5 min und entferne den Überstand durch Inversion.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit CD1d-Tetramer-PE (Maus PBS57-CD1d-Tetramer) entsprechend der Antikörpertitration in 50 μL MB pro 106 Zellen. Gut mischen und 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren. HINWEIS: Das Verfahren kann auch mit APC-markierten mCD1d-Tetrameren und Anti-APC-Perlen durchgeführt werden; Anpassung der fluorochrome, die in der folgenden Färbung verwendet werden, entsprechend. Im vorliegenden Protokoll verwendeten wir Maus-PBS-57-CD1d-Tetramere, die von NIH zur Verfügung gestellt wurden. αgalactosylceramid (αGal-Cer) ist das prototypische Antigen, das von iNKT-Zellen erkannt wird; PBS-57 ist ein Analogon von αGal-Cer mit verbesserter Löslichkeit9; Die NIH Tetramer Facility liefert PBS-57-Liganden, die zu CD1d-Tetrameren komplexiert sind. Andere CD1d-Dimere/Tetramere/Dextramere sind jedoch kommerziell erhältlich und können mit einem lipidischen Antigen wie αGal-Cer beladen werden. Wir sehen die Möglichkeit, das Protokoll für ihre Verwendung anzupassen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1−2 ml MB pro 107 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min.</li>
	<li>Pipettieren Sie den Überstand vollständig ab und resuspenieren Sie das Zellpellet in 80 μL MB pro 107 Gesamtzellen. Fügen Sie 20 μL Anti-PE MicroBeads pro 107 Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und 15 min im Dunkeln bei 4-8 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1−2 ml MB pro 107 Zellen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min.</li>
	<li>Pipettieren Sie den Überstand vollständig ab und resuspendieren Sie bis zu 108 Zellen in 500 μL MB. Andernfalls, wenn die Zellen 108überschreiten, passen Sie die Lautstärke entsprechend an.</li>
	<li>Platzieren Sie je nach Zellzahl eine LS- (bis zu 108)oder MS- (bis zu 107) Säuleim Magnetfeld des MACS-Separators. Spülen Sie die Säule mit MB (3 ml für LS, 500 μL für MS).</li>
	<li>Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf.</li>
	<li>Sammeln Sie nicht markierte Zellen, die durchlaufen werden. Waschen Sie die Säule 3 Mal, indem Sie die entsprechende Menge MB (3 x 3 ml für die LS-Säule, 3 x 500 μL für die MS-Säule) nur dann hinzufügen, wenn der Säulenbehälter leer ist. Der Gesamtabfluss ist der negative Anteil.</li>
	<li>Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie auf ein neues Auffangrohr.</li>
	<li>Pipette MB auf die Säule (5 ml für LS-Säule oder 1 ml für MS-Säule); Drücken Sie den mitgelieferten Kolben in die Säule und spülen Sie die positive Fraktion (angereichert mit iNKT-Zellen) aus.</li>
	<li>Um die iNKT-Zellrückgewinnung weiter zu erhöhen, zentrifugieren Sie die negative Fraktion bei 300 x g für 10 min und wiederholen Sie die Schritte 3.6-3.7 mit einer neuen LS- oder MS-Säule. Bündeln Sie die positiven Fraktionen und bestimmen Sie die Zellzahl. Bewahren Sie 50 μL positiver und negativer Fraktionen für die FACS-Analyse auf.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Reinigungsschritte anhand der FACS-Analyse. Zu den Proben gehören: Milz ex-vivo, mit T-Zellen angereicherte Fraktion, iNKT-positive Fraktion und iNKT-negative Fraktion. Färben Sie die Zellen mit: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-Tetramer-PE, TCRβ-APC und DAPI. HINWEIS: Die erwartete Erholung von einer iVα14-Jα18-Maus beträgt 2x106 iNKT-Zellen.</li>
</ol>4. Aktivierung und Erweiterung der iNKT-Zelle
<ol><li>Aktivieren Sie gereinigte iNKT-Zellen mit Maus-T-Aktivator Anti-CD3/CD28-Magnetperlen im Verhältnis 1:1.<ol>
<li>Zentrifugieren Sie die iNKT-Zellpositivfraktion bei 300 x g für 5 min.</li>
		<li>In der Zwischenzeit das entsprechende Volumen an Anti-CD3 / CD28-Magnetperlen in eine Röhre geben und eine gleiche Menge PBS hinzufügen, Wirbel für 5 Sekunden. Legen Sie das Rohr für 1 Minute auf einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten und resuspendieren Sie die gewaschenen Magnetperlen im richtigen Volumen des vollständigen RPMI (RPMI 1640 Medium, 10% hitzeinaktiviertes FCS, 1 mM Natriumpyruvat, 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 10 U / ml Penicyllin und Streptomycin, 50 μM β-Mercaptoethanol), um 5 x 105 iNKT-Zellen in 1 ml zu haben. Verwenden Sie diese Suspension, um die zentrifugierte iNKT-positive Fraktion zu resuspendieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte 1 mL der Zellsuspension (5 x 105 iNKT-Zellen) und Anti-CD3/CD28-Magnetperlen in einer 48-Well-Platte mit 20 U/mL IL-2 und inkubieren bei 37 °C.</li>
	<li>Nach 5 Tagen 10 ng / ml IL-7 hinzufügen.</li>
	<li>Teilen Sie die Zellen 1: 2, wenn sie 80-90% Konfluenz erreichen, fügen Sie immer 20U / ml IL-2 und 10 ng / ml IL-7 hinzu. Unter diesen Bedingungen können iNKT-Zellen für bis zu 15 Tage expandiert werden.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
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<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
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<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Hier zeigen wir ein reproduzierbares und praktikables Protokoll, um Millionen von gebrauchsfertigen iNKT-Zellen zu erhalten. Aufgrund des Mangels an diesen Zellen in vivo war eine Methode, um sie zu erweitern, dringend erforderlich. Das von uns vorgeschlagene Protokoll erfordert weder eine bestimmte Instrumentierung noch eine hohe Anzahl von Mäusen. Wir nutzten iVα14-Jα18 transgene Mäuse absichtlich, um die Anzahl der für das Verfahren benötigten Mäuse zu reduzieren.
Ein weiteres erfolgreiches...

Invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT-Zellen) sind angeborene T-Lymphozyten, die einen semi-invarianten αβ-T-Zellrezeptor (TCR) exprimieren, der in Mäusen durch eine invariante Vα14-Jα18-Kette gebildet wird, gepaart mit einem begrenzten Satz verschiedener Vβ-Ketten1, die spezifisch für Lipidantigene ist, die durch das MHC-Klasse-I-verwandte Molekül CD1d2präsentiert werden. iNKT-Zellen durchlaufen ein Agonisten-Selektionsprogramm, das zum Erwerb eines aktivierten/angeborenen Effektor-Phänotyps bereits im Thymus führt, der durch mehrere Reifestufen3,4auftrittundeine CD4+ und eine CD4- Untergruppe produziert. Durch dieses Programm erwerben iNKT-Zellen unterschiedliche T-Helfer (TH)-Effektor-Phänotypen, nämlich TH1 (iNKT1), TH2(iNKT2) und TH17 (iNKT17), die durch die Expression der Transkriptionsfaktoren T-bet, GATA3, PLZF und RORγt identifizierbar sind5. iNKT-Zellen erkennen eine Reihe von mikrobiellen Lipiden, sind aber auch selbstreaktiv gegen endogene Lipide, die im Kontext pathologischer Situationen von Zellstress und Gewebeschäden wie Krebs und Autoimmunität hochreguliert werden2. Nach der Aktivierung modulieren iNKT-Zellen die Funktionen anderer angeborener und adaptiver Immuneffektorzellen durch direkten Kontakt und Zytokinproduktion2.
Die Untersuchungen von iNKT-Zellen wurden durch Mausmodelle, einschließlich CD1d-defizienter oder Jα18-defizienter Mäuse, und durch die Produktion von antigenbeladenen CD1d-Tetrameren sowie die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) speziell für die menschliche semi-invariante TCR erleichtert. Die Erzeugung der primären Maus-iNKT-Zelllinie hat sich jedoch als schwierig erwiesen. Um die Antitumorfunktionen von iNKT-Zellen besser zu charakterisieren und für die adoptive Zelltherapie zu nutzen, haben wir ein Protokoll zur Reinigung und Erweiterung von Milz-iNKT-Zellen von iVα14-Jα18 transgenen Mäusen (iVα14Tg)6eingerichtet, bei denen iNKT-Zellen 30-mal häufiger vorkommen als bei Wildtyp-Mäusen.
Expandierte iNKT-Zellen können für In-vitro-Assays und in vivo bei der Rückübertragung in Mäuse genutzt werden. In diesem Setting haben wir zum Beispiel ihre potenten Anti-Tumor-Effekte gezeigt7. Darüber hinaus sind in vitro expandierte iNKT-Zellen für eine funktionelle Modifikation durch Gentransfer oder Editierung vor ihrer Injektion in vivo8zugänglich, was eine aufschlussreiche funktionelle Analyse molekularer Signalwege ermöglicht und den Weg für fortschrittliche Zelltherapien ebnet.

<table><tbody><tr><td>Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lösung</td><td>im Haus</td><td></td><td>0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2-7,4</td></tr><tr><td>Anti-FITC Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Mikrokügelchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>Klon 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-Tetramer -PE</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>Maus PBS57-Cd1d-Tetramere</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>100528</td><td>Klon RM4-5 Fc-Blocker</td></tr><tr><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td> vor <td>Gebrauch hitzeinaktiviert und gefiltert .22</td></tr><tr><td>FOXP3 Transkriptionsfaktor-Färbepuffer</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>Klon AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Puffer (MB)</td><td>im Haus</td><td></td><td>0,5 % Rinderserumalbumin (BSA; Sigma-Aldrich) und 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin und Streptomycin (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepuffert Kochsalzlösung (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinate Maus IL-7</td><td>R& D System</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>Klon H57-597</td></tr><tr><td>&alpha; CD3CD28 Maus T-Aktivator Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

aufreinigung und expansion von mausinvarianten natürlichen killer-t-zellen für in vitro und in vivo studien

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Invariante Natural Killer T (iNKT)-Zellen sind angeborene T-Lymphozyten, die einen konservierten semi-invarianten T-Zellrezeptor (TCR) exprimieren, der spezifisch für selbst- oder mikrobielle Lipidantigene ist, die durch das nicht-polymorphe MHC-Klasse-I-bezogene Molekül CD1d präsentiert werden. iNKT-Zellen sind in allen Spezies sehr konserviert und ihre Untersuchung wurde durch Mausmodelle erleichtert, einschließlich CD1d-defizienter oder iNKT-defizienter Mäuse, und die Möglichkeit, sie eindeutig in Mäusen und Männern mit CD1d-Tetrameren oder mAbs nachzuweisen, die für die semi-invariante TCR spezifisch sind. iNKT-Zellen sind jedoch selten und müssen erweitert werden, um für jede Studie überschaubare Zahlen zu erreichen. Da sich die Erzeugung primärer Maus-iNKT-Zelllinien in vitro als schwierig erwiesen hat, haben wir ein robustes Protokoll zur Reinigung und Erweiterung von Milz-iNKT-Zellen aus den transgenen iVα14-Jα18-Mäusen (iVα14Tg) eingerichtet, in denen iNKT-Zellen 30-mal häufiger vorkommen. Wir zeigen hier, dass primäre milzhaltige iVα14Tg iNKT-Zellen durch einen immunmagnetischen Trennprozess angereichert werden können, was zu etwa 95-98% reinen iNKT-Zellen führt. Die gereinigten iNKT-Zellen werden durch Anti-CD3/CD28-Kügelchen plus IL-2 und IL-7 stimuliert, was zu einer 30-fachen Ausdehnung pro Tag +14 der Kultur mit 85-99% Reinheit führt. Die expandierten iNKT-Zellen können leicht genetisch manipuliert werden und bieten ein unschätzbares Werkzeug, um Mechanismen der Aktivierung und Funktion in vitro und vor allem auch beim adoptiven Transfer in vivo zu sezieren.

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht es, iNKT-Zellen aus der Milz transgener iVa14-Ja18-Mäuse durch einen immunmagnetischen Trennprozess anzureichern, der in Abbildung 1Azusammengefasst ist. Gesamtmilz-T-Zellen werden zunächst negativ selektiert, indem B-Zellen und Monozyten erschöpft werden, gefolgt von einer iNKT-Zell-positiven immunmagnetischen Sortierung mit PBS-57-Lipidantigen-beladenen CD1d-Tetrameren, die es ermöglichen, nur iNKT-Zellen spezifisch zu färben. Dies...

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung von INK-T-Zellen, die sehr selten sind, und ermöglicht eine 30-fache Ausdehnung ihrer Anzahl. Die Reinigung kann an einem Tag durchgeführt werden und produziert in zwei Wochen eine große Anzahl von gebrauchsfertigen INK-T-Zellen für In-vivo- und In-vitro-Studien. Das Verfahren wird Gloria Delfanti, eine Postdoktorandin im Labor, demonstrieren.Nachdem Sie die Milz der Maus seziert haben, zerschlagen Sie sie durch ein 70-Nanometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension in 10 Milliliter PBS mit 2% FBS zu erhalten. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet mit einem Milliliter sterilem Ammoniumchlorid-Kaliumlysinpuffer.Inkubieren Sie die Zellen für drei Minuten bei Raumtemperatur und blockieren Sie sie dann mit fünf Millilitern PBS mit 2% FBS. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes das Zellpellet in drei Milliliter PBS mit 2% FBS resuspendieren und Fettrückstände durch Pipettieren entfernen.Halten Sie die Zellen für die Anreicherungsschritte kalt und verwenden Sie Lösungen, die bei vier Grad Celsius vorgekühlt und dann auf Eis gehalten werden. Zentrifugiere bei 300 mal G für fünf Minuten. Alle Zellen in der entsprechenden Menge PBS mit 2% FPS und Fc-Blocker resuspendieren und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Mit ein bis zwei Millilitern MACS-Trennpuffer pro 10 Millionen Zellen waschen und bei 300 mal G für 10 Minuten zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstandes färben Sie die Zellen mit CD19-FITC und H2-IAb-FITC und inkubieren Sie 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 90 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen. Fügen Sie 10 Mikroliter Anti-FITC-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu. Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren.Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und 10 Minuten lang bei 300 mal G zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 125 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer. Platzieren Sie eine LD-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators.Um Verstopfungen zu vermeiden, tragen Sie einen Vorzerlegungsfilter auf die LD-Säule auf und spülen Sie sie mit zwei Millilitern MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf den Filter auf und sammeln Sie die unbeschrifteten Zellen, die die Spalte passieren. Waschen Sie den leeren Säulenbehälter dreimal mit einem Milliliter MACS-Puffer.Sammeln Sie das mit T-Zellen angereicherte Abwasser und zählen Sie die Zellen, wobei Sie 50 Mikroliter für die FACS-Analyse aufbewahren. Nach dem Zentrifugieren bei 300 mal G für fünf Minuten den Überstand entfernen und die Zellen mit CD1d Tetramer-PE färben. Gut mischen und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren.Waschen Sie die Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen. Nach der Zentrifugation bei 300 mal G für 10 Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 80 Mikroliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen resuspendieren. Fügen Sie 20 Mikroliter Anti-PE-Mikrokügelchen pro 10 Millionen Zellen hinzu.Gut mischen und 15 Minuten im Dunkeln bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie Zellen, indem Sie ein bis zwei Milliliter MACS-Puffer pro 10 Millionen Zellen hinzufügen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie bis zu 100 Millionen Zellen in 500 Mikroliter MACS-Puffer.Platzieren Sie je nach Zellzahl die LS- oder MS-Säule im Magnetfeld des MACS-Separators und spülen Sie die Säule mit MACS-Puffer ab. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, sammeln Sie unbeschriftete Zellen, die passieren, und waschen Sie die Spalte dreimal wie zuvor beschrieben. Dies ist der negative Bruch.Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie auf ein neues Auffangrohr. Den MACS-Puffer auf die Säule pipettieren und den mitgelieferten Kolben in die Säule drücken, um die mit INK-T-Zellen angereicherte positive Fraktion auszuspülen. Um die Ink-T-Zell-Wiederherstellung weiter zu erhöhen, zentrifugieren Sie die negative Fraktion bei 300 mal G für 10 Minuten und wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit einer neuen LS- oder MS-Säule.Ziehen Sie die positiven Fraktionen und bestimmen Sie die Zellzahl. Bewahren Sie 50 Mikroliter positiver und negativer Fraktionen für die FACS-Analyse auf, um die Reinheit zu überprüfen. Um INK-T-Zellen in einem Verhältnis von eins zu eins zu aktivieren, übertragen Sie das entsprechende Volumen an Anti-CD3- und CD28-Magnetperlen in eine Röhre und mit einem gleichen Volumen pbS, dann wirbeln Sie für fünf Sekunden.Legen Sie das Rohr für eine Minute auf einen Magneten und entsorgen Sie den Überstand. Entfernen Sie das Rohr vom Magneten und befestigen Sie die gewaschenen Magnetperlen im richtigen Volumen von RPMI. Zentrifugieren Sie gereinigte INK-T-Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten und mischen Sie sie mit Maus-T-Aktivator Anti-CD3 oder CD28 Magnetperlen.Einen Milliliter der Zellsuspension, Anti-CD23- und CD28-Magnetperlen in einer 48-Well-Platte mit 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 plattieren, dann bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Tagen 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzufügen. Teilen Sie die Zellen in zwei Hälften, wenn sie 80 bis 90% Konfluenz erreichen, und fügen Sie immer 20 Einheiten pro Milliliter IL-2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL-7 hinzu.Unter diesen Bedingungen können INK-T-Zellen bis zu 15 Tage lang expandiert werden. Mit diesem Protokoll werden INK-T-Zellen durch einen immunmagnetischen Trennprozess aus der Milz transgener Mäuse angereichert. Nach der Anreicherung können die Zellen mit Anti-CD3- und CD28-Kügelchen erweitert werden, was zu einer 30-fachen Ausdehnung im Durchschnitt bis zum 14. Tag der Kultur führt.Die starke Aktivierung mit Anti-CD3- und Anti-CD-Kügelchen induzierte die Herunterregulierung der IMK-T-Zell-TCR-Expression auf der Zelloberfläche und eine doppelt negative Population trat auf. Die Mehrheit der expandierten INK-T-Zellen ist CD4-negativ. Die Charakterisierung der linienspezifischen Transkriptionsfaktoren PLZF und ROR gamma T ermöglichte es, die Phänotypen NKT1, NKT2 und NKT17 auf angereicherten INK-T-Zellen am Tag Null und 14 zu identifizieren.Die angereicherten INK-T-Zellen zeigen einen T80-ähnlichen Effektor-Phänotyp, der nach 14 Tagen der Expansion konserviert wird, wie durch die Sekretion von Interferon gamma und IL-4 nach PMA- und Ionomycin-Stimulation bestätigt wird. Denken Sie während der Reinigungsschritte daran, schnell mit vorgekühlten Lösungen zu arbeiten und Fettrückstände zu entfernen, die beim Pipettieren auftreten können. Erweiterte INK-T-Zellen können für In-vitro-Assays und In-vivo-Transfers in Mäuse genutzt werden, auch nach funktionellen Modifikationen durch Gentransfer oder Editing.Die In-vitro-Expansion von INK-T-Zellen überwindet die durch den Mangel gegebene Einschränkung und macht sie in präklinischen Studien in den Bereichen Tumorimmunüberwachung, Infektionskrankheiten und Autoimmunität nutzbar.

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Dieses Video zeigt die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich natürlicher Killerzellen oder NK-Zellen, aus menschlichem Lebergewebe für die selektive Expansion. Der enzymatische und mechanische Verdau, gefolgt von der Trennung durch Dichtegradienten, fördert die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich NK-Zellen. Die gesammelten Lymphozyten können für die selektive Vermehrung von NK-Zellen weiter verwendet werden.

Isolierung natürlicher Killerzellen aus Lebergewebe für die selektive Expansion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen, auch bekannt als iNKT-Zellen. Das Verfahren beginnt mit der Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus, um die Aktivierung und Proliferation von iNKT-Zellen in der Milz zu stimulieren. Anschließend werden einzellige Suspensionen aus der Milz hergestellt und mit iNKT-Zell-erkennenden Komplexen, die mit Fluorophoren markiert sind, inkubiert, gefolgt von einer magnetischen Bead-basierten...

Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Hier stellen wir ein angepasstes Protokoll vor, das zur Erzeugung einer großen Anzahl von murinen invarianten natürlichen Killer-T-Zellen aus der Milz der Maus verwendet werden kann. Das Protokoll beschreibt einen Ansatz, mit dem Milz-iNKT-Zellen in vitro mit einer begrenzten Anzahl von Tieren und Reagenzien angereichert, isoliert und expandiert werden können.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Dies ist eine Methode, um uteruslymphoide Zellen sowohl von schwangeren als auch von nicht schwangeren Mäusen zu isolieren. Diese Methode kann für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, Zellsortierung, funktionelle Assays, RNA-seq und Proteomik verwendet werden. Das Protokoll hier zeigt, wie man angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 1 durch Durchflusszytometrie phänotypisiert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Aufreinigung und 30-fache Expansion von iNKT-Zellen aus der Mausmilz für Immunologie-Studien. Diese Methode liefert große Mengen funktionsfähiger Zellen für in vitro und in vivo Experimente.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

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