Name: Feldbasierter thermischer Physiologie-Assay: Kälteschockrückgewinnung unter Umgebungsbedingungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen kostengünstigen Feldbasierten Assay zur Untersuchung der Kälteschockrückgewinnung bei Schmetterlingen unter Umgebungsbedingungen durchführen. Diese Methode ermöglicht physiologische und ökologische Einblicke.

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Vielen Dank an Jaret Daniels, Isabella Plummer, Brett Scheffers und Dan Hahn für den Input zum Protokoll, wie es zuerst entwickelt wurde. Zusätzlicher Dank geht an Jaime Haggard, Sebastián Durán und Indiana Cristóbal Róis-Málaver für die Implementierung mehrerer Iterationen dieses Protokolls und für den Input zu Schlüsselkomponenten. Danke auch an einen anonymen Gutachter für das Feedback zum Manuskript als Ganzes. Unterstützung wurde vom Publikationsfonds des McGuire Center for Lepidoptera and Biodiversity, dem College of Agricultural and Life Sciences, der School of Natural Resources and Environment und der Abteilung für Wildtierökologie und Naturschutz bei UF bereitgestellt.

1. Identifizierung von Arten von Interesse
<ol><li>Identifizieren Sie interessante Arten, um die Erholungszeit für Kälteschocks zu bestimmen. Denken Sie daran, dass sich jede Gruppe in der Zeit unterscheidet, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren (dh der Punkt, an dem das Insekt noch lebt, sich aber nicht bewegt und nicht reagiert). Wählen Sie ebenfalls basierend auf dem Organismus und der Verwendung von Daten verschiedene Cutoff-Punkte, an denen das Experiment abgebrochen werden soll, wenn die fokalen Personen nicht fliegen (siehe Abschnitt 4). HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Verwendung auf Lepidoptera entworfen und entwickelt. Es gilt jedoch für große, volante, terrestrische Insekten, insbesondere solche, die flach in Glassinhüllen gelagert werden können, die Bewegung und Schäden einschränken (z. B. Schmetterlinge und Libellen / Libellen).</li>
</ol>2. Durchführung eines Vorverfahrens
<ol><li>Führen Sie ein Vorverfahren an einer kleinen Stichprobe von Personen durch, um die Schlüsselparameter zu bestimmen. Befolgen Sie die Abschnitte 3 bis 5 des folgenden Protokolls mit 5-10 Personen für ein Vorverfahren.<ol>
<li>Testen Sie die Zeit, die auf Eis benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren (sich nicht zu bewegen), aber töten Sie die fokalen Spezies nicht, indem Sie Schritt 5.1 mit Behandlungen von 30 min, 60 min und 90 min befolgen. HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren, hängt von der Größe, dem Standort und der natürlichen Geschichte / dem Verhalten der Individuen ab.</li>
		<li>Basierend auf den Ergebnissen der Schritte 4.1-4.4 und unter Verwendung von Kenntnissen über die Ökologie der fokalen Insekten, wählen Sie einen Zeitpunkt, zu dem die Studie abgeschlossen werden kann, wenn sich eine bestimmte Person nicht vollständig erholt. Basieren Sie diese Zeit auch auf der Ökologie der Art, wobei Zu denken ist, dass nach vielen Minuten der Flugunfähigkeit viele Insekten vorveredelt sind. HINWEIS: Wenn zum Beispiel die meisten Vorversuche nach 15 Minuten im Flug enden, könnte man sich entscheiden, die Versuche nach 25 Minuten zu beenden, um sicherzustellen, dass auch Ausreißer eine Chance haben, sich vollständig zu erholen (dh zu fliegen). Dieses Protokoll basiert auf einer Cutoff-Zeit von 30 Minuten (Schritt 5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Parameter aus vorgerichtlichen Daten, um die Datenerfassung für die Experimente zu informieren. Ändern Sie das unten beschriebene Protokoll basierend auf den Bedürfnissen der Fokalorganismen, einschließlich der Zeit in der Eisaufschlämmung, der Zeit, zu der Versuche beendet werden, und der auf dem Datenblatt dokumentierten Verhaltensweisen (z. B. kann Zittern ein unangemessenes Verhalten für das Insekt der Wahl sein).<ol>
<li>Definieren Sie spezifische Forschungsfragen, die mit diesen Daten beantwortet werden sollen, während Sie die Parameter verfeinern. HINWEIS: Wenn der Forscher beispielsweise an der Wirkung einer längeren Exposition auf die Erholung interessiert ist, ist die Zeit im Eis eine Schlüsselvariable, die es zu ändern gilt. Wenn Forscher an Unterschieden in der Physiologie zwischen hell- und dunkel gefärbten Arten interessiert sind, können sie entweder zwei deutlich gefärbte Arten wählen oder die Flügelfarbe des Insekts modifizieren, um die Wirkung der Flügelfarbe auf die Erholungszeit zu messen. Wichtig ist, dass diese Methode in hohem Maße an die Bedürfnisse und Forschungsfragen angepasst werden kann (siehe Diskussionsabschnitt).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sammlung von Insekten
<ol><li>Sammeln Sie Insekten mit geeigneten Methoden wie Köderfallen und entomologischen Netzen (Ergänzende Abbildung 1). Legen Sie jede Person nach der Abholung in einen separaten Glassine-Umschlag mit einem eindeutigen Ausweis.</li>
	<li>Lagern Sie die Tiere an einem schattigen, kühlen Ort, nachdem sie gefangen wurden und bevor Sie sie dem Kälteschockexperiment zustellen. Setzen Sie das Tier immer innerhalb von 24 Stunden nach dem Einfangen der experimentellen Behandlung aus und standardisieren Sie diese Zeit so weit wie möglich über Versuche hinweg.<ol>
<li>Obwohl die Lagerbedingungen variieren können, halten Sie die Insekten von der direkten Sonne fern. Wenn möglich, platzieren Sie sie drinnen in einem kühlen, dunklen Raum.</li>
		<li>Stellen Sie auf dem Feld sicher, dass sie während der Lagerung beschattet werden und vor Wind (wegwehen) und anderen Insektenfressern geschützt sind, die in die Umschläge eindringen können.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Richten Sie das Kälteschockexperiment ein
<ol><li>Füllen Sie einen Kühler mit Eis und Wasser. Stellen Sie sicher, dass genügend Eis vorhanden ist, um mindestens eine Stunde lang zu bestehen, und fügen Sie bei Bedarf regelmäßig Eis hinzu, um die Umgebung im Wasser bei 0 ° C zu halten.</li>
	<li>Wählen Sie zwischen 1 und 4 Fokalpersonen für eine Runde des Experimentierens und stellen Sie sicher, dass jedes Individuum identifizierbar ist.<ol>
<li>Wenn Sie mehrere Arten verwenden, verwenden Sie nur eine von ihnen, um zu vermeiden, dass Individuen auf dem Datenblatt verwirrt werden. Wenn Sie nur mit einer Art experimentieren, verwenden Sie nur Individuen, die leicht zu unterscheiden sind, zum Beispiel durch einen gebrochenen Flügel oder eine deutliche Markierung.</li>
		<li>Wenn das Ziel des Experiments nichts mit der Flügelfärbung zu tun hat, markieren Sie die Flügel mit eindeutigen IDs (z. B. Zahlen) mit einem feinen Filzmarker, um Individuen zu unterscheiden.</li>
		<li>Wenn die Experimente keines der oben genannten Kriterien erfüllen, führen Sie das Experiment an einer Person gleichzeitig durch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie die Zeilen des Datenblatts mit den Informationen, die für jedes untersuchte Insekt relevant sind, einschließlich ihrer eindeutigen ID und einer nützlichen Kennung in den Anmerkungen wie Artname oder Unterscheidungszeichen (Ergänzende Tabelle 1).</li>
	<li>Legen Sie alle Fotrpersonen (noch in ihren individuell gekennzeichneten Umschlägen) in einen versiegelten Plastikbeutel mit einem Gewicht (Materialtabelle) und legen Sie den Beutel für 60 Minuten (oder bis ein Kühlkalkum verursacht wurde; siehe Diskussion) in Eiswasser (Ergänzende Abbildung 2).<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass das Gewicht schwer ist (z. B. große Münzen, große Unterlegscheiben oder glatte Felsen) und groß genug, um den Insektenbeutel im Eiswasser und senkrecht zur Wasseroberfläche zu halten. Verwenden Sie ein Gewicht, das keine Leckagen in der versiegelten Plastiktüte verursacht. HINWEIS: Während sich Insekten immer noch erholen können, wenn sie unter Wasser direkt dem Wasser ausgesetzt sind, erschweren nasse Hüllen das Entfernen jedes Einzelnen. Es ist am besten, die Insekten trocken in ihrem Beutel zu halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeichnen Sie Temperatur- und Lichtdaten auf.<ol>
<li>Verwenden Sie einen Datenlogger (siehe Materialtabelle),um Umgebungstemperatur- und Lichtdaten mit Schritt 5.1 oder 5.2 aufzuzeichnen.<ol>
<li>Programmieren Sie den Datenlogger so, dass er Temperatur- und Lichtdaten in Abständen von 10 s sammelt, beginnend mit dem Zeitpunkt, zu dem die Insekten freigesetzt werden.</li>
			<li>Basieren Sie die Startzeit des Datenloggers darauf, wann die Insekten in das Eiswasser gelegt wurden. Stellen Sie sicher, dass die Datenlogger-Informationen (Datum, Uhrzeit) synchronisiert sind, damit die Daten über die Umgebungsbedingungen später mit jedem einzelnen fokalen Insekt abgeglichen werden können.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie ein einfaches Thermometer, um Temperatur- und Lichtdaten in kurzen Abständen von Hand (von einem zweiten Forscher) aufzuzeichnen.<ol>
<li>Entscheiden Sie sich für die experimentellen Parameter, die mit der Erholungszeit verknüpft werden sollen, die ohne Datenlogger gemessen werden kann. Verwenden Sie verschiedene Behandlungen: Schatten / Sonne; Dämmerung/Mittag.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie einen Netzkäfig für die Insekten an einem geeigneten Ort, damit die Temperatur und die Lichtumgebungen innerhalb des Käfigs so homogen wie möglich sind und die Basis des Käfigs erhöht wird und vom Beobachter angezapft werden kann.</li>
	<li>Platzieren Sie den Datenlogger direkt außerhalb des Käfigs oder innerhalb des Käfigs, damit er nicht umgeworfen oder anderweitig durch kleine Bewegungen innerhalb des Käfigs beeinträchtigt wird. Wenn Sie keinen Datenlogger verwenden, positionieren Sie ein Thermometer entsprechend und/oder richten Sie die Käfige in der entsprechenden Konfiguration ein. HINWEIS: Der Datenlogger muss so platziert werden, dass die aufgezeichneten Umgebungsbedingungen so nah wie möglich an denen des Insekts liegen.</li>
</ol>5. Starten Sie das Kaltschockexperiment
<ol><li>Entfernen Sie die Tiere nach 60 Minuten (oder der zeitgemäßen Zeit; siehe oben) aus dem Eiswasserbad. Entfernen Sie die Insekten sofort aus der Plastiktüte und entfernen Sie jede Person so schnell wie möglich aus ihrer Hülle, wobei die Handhabung minimiert wird (Ergänzende Abbildung 3).</li>
	<li>Starten Sie die Stoppuhr, sobald sich die Tiere in den Netzkäfigen befinden (siehe Beispieldaten, Ergänzende Tabelle 1).</li>
	<li>Tippen Sie mit einem Bleistift auf die Basis des Käfigs, um die sich erholenden Insekten zu rühren. HINWEIS: Die Bereitstellung von Reizen während der Genesung stellt sicher, dass die fokalen Insekten Erholungsstatus und Verhaltensweisen zeigen, sobald sie physiologisch in der Lage sind (Supplemental Video).<ol>
<li>Tippen Sie häufig und stark genug, um sicherzustellen, dass ein Tier nach Möglichkeit reagiert, aber keine Reaktion hervorruft. HINWEIS: Wenn zum Beispiel beim Klopfen auf den Käfig ein Tier in die Luft katapultiert wird und aufrecht landet, sich aber nicht bewegt, um alleine zu stehen, wird dies nicht als "Standverhalten" betrachtet, da der Organismus tatsächlich nicht für sich allein stand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Markieren Sie die Studie als abgeschlossen, sobald eine Person geflogen ist (d. H. Eine vollständige Genesung gezeigt wird). Beenden Sie den Versuch und betrachten Sie, dass das Insekt eine vollständige Genesung erreicht hat, wenn es sich nach 30 Minuten nicht bewegt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Insekten aus dem Netzkäfig und legen Sie die Individuen wieder in ihre beschrifteten Glassinhüllen. Befreien Sie die Tiere oder halten Sie sie zur weiteren Datenerhebung (z.B. individuelle Merkmale von Größe, Gewicht).</li>
	<li>Wenn Sie einen Datenlogger verwenden, stoppen Sie die Datenerfassung des Datenloggers und speichern Sie die Datei mit Temperatur- und Lichtdaten während des Experiments mit den entsprechenden Datums- / Uhrzeitinformationen.</li>
</ol>6. Datenverarbeitung
<ol><li>Geben Sie die aus dem Datenblatt dargestellten Daten in eine Tabelle ein (z. B. MS Excel).</li>
	<li>Wenn Sie einen Datenlogger verwenden, fügen Sie Temperatur- und Lichtdaten für jede Reaktion jedes einzelnen Assays hinzu.<ol>
<li>Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Temperatur und des Lichts für jedes Verhalten jedes Einzelnen. HINWEIS: Da der Datenlogger alle 10 s Daten protokolliert, wenn das Standverhalten für ein Tier 48 s dauerte, verwenden Sie die ersten 5 Einträge des Datenloggers für diesen Versuch.</li>
		<li>Verknüpfen Sie jedes Wiederherstellungsverhalten jedes Einzelnen mit abiotischen Daten, die vom Datenlogger aufgezeichnet wurden, und runden Sie bei Bedarf Intervalle von 10 s auf oder ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plotten und analysieren Sie Daten. Abbildung 1veranschaulicht beispielsweise den Einfluss von Temperatur und Licht auf die Erholungszeit von Kälteschocks. Stellen Sie weitere relevante Daten (Artenmerkmale, regionale Lebensraummerkmale) zusammen, um die ökologischen und evolutionären Muster in physiologischen Merkmalen der getesteten Gruppen zu untersuchen. HINWEIS: Abbildung 1 wurde mit dem ggplot2-Paket in R dargestellt. Der Detaillierungsgrad der Daten über die Umgebungsbedingungen wird je nach den instrumenten zur Messung der Umgebungsbedingungen unterschiedlich sein. Wird ein Datenlogger verwendet, können Zahlen mit einem Detail erstellt werden, der mit Abbildung 2 vergleichbar ist. Wenn ein Thermometer verwendet wird, kann der Forscher kein Diagramm erstellen, das durch Umgebungslicht informiert wird. Wenn Forscher Kategorien von Licht oder Temperatur verwenden, können diese Streudiagramme in Boxplots oder eine andere geeignete Vorlage umgewandelt werden, um diese Phänomene zu veranschaulichen.</li>
</ol>

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</ol>

Der Autor hat keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Das Studium der thermischen Physiologie umfasst Messungen von Arten und Umweltmerkmalen, um die Wechselwirkungen zwischen Organismen und ihrer Umgebung, die für Überleben und Fitness entscheidend sind, besser zu verstehen. Obwohl es immer ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses der Naturgeschichte und Ökologie von Pflanzen und Tieren ist, sind thermische Merkmale angesichts des Landschafts- und Klimawandels von zunehmender Bedeutung11,21. Mehrere Gruppen ektothermischer Terrestrischer Insekten, insbesondere Lepidoptera und Odonatan, sind relativ groß und reichlich vorhanden, zeigen unterschiedliche Verhaltensweisen und sind manipulationsfähig. Hier wird ein effizienter und kostengünstiger Assay beschrieben, um die physiologischen Reaktionen solcher Insekten effektiv zu messen. Dieses Protokoll erfordert eine Quelle gesunder Organismen, deren Handhabungszeit vor dem Experiment begrenzt ist. Obwohl die Anzahl der gleichzeitig untersuchten Organismen flexibel ist, variiert die Anzahl der Fokalpersonen pro Experiment je nach Zweck der Datenerhebung und / oder Anzahl der Beobachter. 
Zum Beispiel wurde dieses Protokoll entwickelt, um detaillierte Einzeldaten über Schmetterlinge in ganzen Gemeinden zu sammeln. Die repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen daher das Bestreben, die Datenerhebung für Individuen möglichst vieler Arten und unter einer Vielzahl von für die lokale Umwelt relevanten Bedingungen zu maximieren. Unabhängig von der Anzahl der fokalen Arten ist es für den Beobachter entscheidend, jedes Individuum im Käfig identifizieren zu können, das die Genesung erlebt. Wenn das Ziel darin besteht, Daten von nur einer Art zu sammeln, sollten nur ein oder zwei Individuen (wenn sie anhand unterschiedlicher Flügelverschleiße identifizierbar oder einzeln markiert sind) gleichzeitig untersucht werden. Die Studienfächer müssen in Übereinstimmung mit einer bestimmten Forschungsfrage oder einem bestimmten Studienplan ausgewählt werden. Basierend auf der gestellten Frage und dem Zweck der Datenerhebung (z. B. Forschung oder Unterricht) unterscheiden sich die Stichprobengröße und die Sammlung anderer Merkmale.
Um die grundlegenden Komponenten der Physiologie zu veranschaulichen, die durch dieses Protokoll erläutert werden (Induktion von Kaltkoa, Schritte der Erholung, Rolle der Umgebungsbedingungen), kann ein Klassenlehrer zwei verschiedene Arten oder Morphen einer einzigen Spezies auswählen. Wenn sich die fokussierten Individuen nur in einem Schlüsselmerkmal (z. B. Farbe) unterscheiden, ist eine kleinere Stichprobengröße erforderlich, und die Schüler können die Beziehung zwischen diesem Merkmal und der Organismenphysiologie genau untersuchen. Forscher, die sich für ökologische Physiologie interessieren, können ihre experimentellen Daten nutzen, um komplexe ökologische und evolutionäre Fragen zu untersuchen. Forscher müssen sicherstellen, dass sie fokale Insekten sorgfältig auswählen, die ihre Fragen direkt ansprechen (z. B. basierend auf Lebensstadium, Alter, Geschlecht, Standort) und basierend auf der Anzahl der beteiligten Variablen die geeignete Stichprobengröße bestimmen. Die Stichprobengrößen für komplexe Modelle sind größer als die oben beschriebenen. 
Beim Sammeln von Verhaltenswiederherstellungsdaten ist es wichtig, dass der Käfig über dem Boden ruht, da der Beobachter in der Lage sein muss, auf den Boden des Käfigs zu tippen, um Wiederherstellungsverhalten hervorzubelocken. Dadurch wird sichergestellt, dass der Organismus reagiert (steht, fliegt), sobald er physiologisch dazu in der Lage ist, und das terminale Erholungsverhalten (Flug) dokumentiert wird. Die Aufzeichnung der Umgebungsbedingungen während der Kälteschock-Erholung ist ein wesentlicher Bestandteil der Untersuchung der thermischen Physiologie, da dieses Protokoll darauf ausgelegt ist, die Rolle der Umwelt in der organismischen Physiologie zu untersuchen und zu entwirren. Datenlogger (siehe Materialtabelle)sind nützlich, um standardisierte Messungen relevanter Bedingungen (z. B. Temperatur, Licht und sogar Feuchtigkeit) aufzuzeichnen. Wenn diese Werkzeuge jedoch nicht verfügbar sind, können relevante Bedingungen auf andere Weise gemessen werden, z. B. mit einem digitalen Thermometer oder durch Vereinfachung der Variablen der Umgebungsbedingungen und durch Verwendung unterschiedlicher Umgebungen wie Schatten und Sonne. Dieses Protokoll gibt dem Forscher die Möglichkeit, die Bedingungen während der Erholung des Kälteschocks basierend auf dem Zweck und dem Umfang der Studie zu messen.
Obwohl diese Methode modifiziert werden kann, um besser an bestimmte taxonomische Gruppen anzupassen, wird empfohlen, große, volante Insekten zu verwenden. Fliegende Insekten, die ihre Fähigkeit wiedererlangen, unabhängig zu fliegen, können als vollständig erholt angesehen werden. Die beschriebene Methode wurde erfolgreich bei Schmetterlingen in den Tropen und Subtropen eingesetzt. Basierend auf den thermischen Trends eines bestimmten Gebiets (d. H. Der Temperaturbereich an einem Ort, der variiert und somit die Erwartungen basierend auf Höhe, Breitengrad und Baldachinbedeckung beeinflusst), kann ein Organismus mehr oder weniger als eine Stunde in einem Eiswasserbad benötigen, um in ein kühles Koma einzutreten. Die Größe des Organismus kann auch die Zeit beeinflussen, die notwendig ist, um in ein Kühlkalk zu gelangen. Es ist wichtig, die Zeit der Kälteexposition zu finden, die notwendig ist, um ein Kühlkoma zu induzieren (sich nicht zu bewegen), aber keine fokalen Arten zu töten. Die Zeit, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren, hängt von der Größe, dem Standort und der natürlichen Geschichte / dem Verhalten der Individuen ab. Basierend auf den Ergebnissen des hier beschriebenen Kälteschockexperiments und unter Verwendung von Kenntnissen über die Ökologie der fokalen Insekten wählen Sie einen Zeitpunkt, zu dem die Studie abgeschlossen werden kann, wenn sich eine bestimmte Person nicht vollständig erholt. 
Basierend auf den spezifischen Fragen des Forschers kann diese Methode entweder im Feld oder im Labor eingesetzt werden, um sowohl natürliche Umweltschwankungen als auch die Kontrolle wichtiger Variablen zu ermöglichen. Dieser Assay ist einfach und kostengünstig und hilft, bestehende Lücken im Bereich der thermischen Physiologie zu schließen. Die Leichtigkeit dieses Protokolls macht es für eine Vielzahl von Taxa zugänglich und öffnet das Feld für mehr als laborfreundliche Organismen. Die Neuheit der Durchführung eines standardisierten, aber dennoch umgebungsthermischen Assays füllt die Lücke zwischen Labor- und Feldergebnissen22. Die Nutzung der Umgebungsbedingungen für die Erholung des Organismus wird den Forschern helfen, die Rolle von Umwelt- und Artenfaktoren in der Physiologieaufzuteilen 14,22. Schließlich kann dieses Protokoll aufgrund seiner geringen Kosten und des Mangels an erforderlichen Materialien an abgelegenen Orten im Feld mit wenig Ausrüstung - ideal für viele Feldbiologen - sowie in Klassenzimmern verwendet werden, um jungen Schülern eine praktische Lernerfahrung zu ermöglichen.

Die Integration von thermischer Physiologie und Ökologie in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren1,2 startete das Gebiet der ökologischen Physiologie. Umfangreiche thermische Studien, die an Ektothermen durchgeführt wurden, zeigen ökologisch-physiologische Synergien in verschiedenen öko-evolutionären Kontextenauf 3,4,5. Die Forschung zur thermischen Physiologie ektothermer Organismen hat in jüngster Zeit angesichts des Klimawandels und der veränderten thermischen Landschaften auf der ganzen Welt wieder Anachtung erlangt6,7. Neben der Information über Studien im akademischen Bereich der ökologischen Physiologie können thermische Physiologie-Assays für Forscher allgemein zugänglich sein und als praktischer Lehransatz für alle Ebenen dienen. Komponenten der thermischen Leistung, einschließlich thermischer Grenzen und Auswirkungen von Temperaturschocks, sind grundlegend für die Ökologie, das Verhalten und die Lebensgeschichte von Tieren8,9.
Insbesondere werden Ökotothermen verwendet, um Fragen der Physiologie zu beantworten, da die Endothermie eine untrennbare Verbindung zwischen Umgebungs- und Organismustemperatur vorschreibt. Der Temperaturbereich, dem Organismen standhalten können (ihr kritisches thermisches Minimum bis maximal-thermischer Bereich) und die Temperaturen, bei denen ihr Verhalten und ihre Fitness maximiert werden (thermal optima), sind oft in ökologischen und evolutionären Prozessen verwurzelt. Diese physiologischen Merkmale sind von zunehmender Bedeutung, da die Temperaturen, sowohl Mittel als auch Extreme, um10 steigen. Zum Beispiel haben die abiotischen Veränderungen, einschließlich Temperaturerhöhungen, die mit der Zerstörung und Fragmentierung von Lebensräumen einhergehen, Gemeinschaften von Ektothermen, einschließlich Anuren, beeinflusst und physiologisch fragile Arten (mit enger thermischer Toleranz) auf kleine Restlebensraumfleckenbeschränkt 11,12.
Die Bewertung von Schlüsselkomponenten der thermischen Leistung kann sowohl in Bezug auf Zeit als auch Ressourcen teuer sein und erfordert traditionell Laborgeräte und standardisierte Bedingungen. Darüber hinaus spiegeln herkömmliche Assays oft nicht die Breite der Umgebungsbedingungen wider, die ein bestimmtes Tier in der Natur erlebt13, da die Temperatur in ähnlichen physiologischen Experimenten sorgfältig kontrolliert wird und oft nichts mit den Umgebungsbedingungen eines Tieres zu tun hat. Diese Temperaturregelung kann das Verständnis der Variation der einzelnen Reaktionen verringern2,14. Physiologen haben sich auf laborbasierte Heiz- und Kühlexperimente verlassen, bei denen programmierbare Wasserbäder verwendet wurden, um die Umgebung eines Tieres stetig zu erwärmen oder zu kühlen, um thermische Leistungskurven zu erstellen15.
Typischerweise werden Tiere in Fläschchen mit einem Thermoelement gelegt, und ihre Umgebungstemperatur wird durch die Kontrolle der Temperatur des umgebenden Wasserbades stetig verändert. Die Forscher messen die Zeit, die benötigt wird, um einen veränderten physiologischen Zustand zu erreichen (z. B. Kühlkoma, Knockdown) und die Temperatur, bei der die Statusänderung aufgetreten ist16,17. Ab einem Minimum von 500 US$Dollar sind diese Werkzeuge groß, schwer und erfordern zusätzliche technische Ausrüstung (z. B. Computer, Thermoelemente). Folglich sind die grundlegenden Werkzeuge zur Durchführung klassischer Methoden zur Beurteilung der thermischen Leistung 1) nicht für alle wirtschaftlich zugänglich, 2) nicht für die Untersuchung von Tieren geeignet, die zu groß sind, um in üblichen Fläschchen für kleine Dipteren enthalten zu sein, und 3) nicht tragbar für den Einsatz in abgelegenen Feldumgebungen. Die Einhaltung der gängigen Praxis hat zu einer begrenzten Repräsentation über Taxonomie und experimentelle Bedingungen hinweg geführt18,19,20.
Während vollständige thermische Leistungskurven unter anderem die Artenverteilung, die Merkmale der Lebensgeschichte und das Verhalten beeinflussen können, kann die Quantifizierung von weniger und einfacheren thermischen Metriken effizienter und dennoch äußerst informativ sein. Physiologische Assays, die den Beginn des Kaltkalkomas und die anschließende Kaltschockrückgewinnung, das Kalthärten und das Aufrichten des Verhaltens messen, sind effektive und ausführbare Proxys für das kritische thermische Minimum eines Organismus8. Hier wird ein Kälteschock-Assay beschrieben, der nützlich ist, um physiologische Daten von großen terrestrischen ektothermischen Insekten zu erhalten. Der Assay ist erschwinglich, zugänglich und einfach unter Feldbedingungen oder im Klassenzimmer durchzuführen. Daten zur Erholung von Kälteschocks, die durch dieses Protokoll generiert werden, können mit Merkmalsdaten auf Arten- oder individueller Ebene gekoppelt werden, um Fragen zur ökologischen Physiologie zu verfolgen und / oder verwendet werden, um Studenten über physiologische Prinzipien zu unterrichten.

<table><tbody><tr><td>24 x 24 x 36" Popup Aufzucht & Beobachtungskäfig</td><td>Bioquip</td><td>1466PB</td><td>Stellen Sie sicher, dass der Käfig leicht vom Boden abgehoben ist, um während der Experimente auf den Boden des Käfigs klopfen zu können.</td></tr><tr><td>Kühler</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pergamin Umschläge</td><td>Bioquip</td><td>1130B</td><td></td></tr><tr><td>HOBO Pendant Temperatur/Licht 8K Datenlogger</td><td>Onset</td><td>UA-002-08</td><td>Wenn ein Datenlogger nicht zugänglich ist, können Forscher ein digitales Thermometer verwenden, um die Umgebungstemperaturen in regelmäßigen Abständen aufzuzeichnen. Weitere Informationen finden Sie im Protokollschritt 4.5.</td></tr><tr><td>HOBO Optic USB Base Station</td><td>Onset</td><td>Base-U-1</td><td></td></tr><tr><td>Eiswasser</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Insekten (fokale Taxa)</td><td>NA</td><td>Alle</td><td>Sammeln Sie ausreichend Proben zum Testen, um die Replikation von Versuchsgruppen sicherzustellen (z. B. Spezies, Probenahmeort)</td></tr><tr><td>PVC T-Stück</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verschließbare Plastiktüte</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NAStoppuhr/Timer</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Gewicht</td><td>Beliebig</td><td>NA</td><td>Große Münzen oder kleine Steine zum Beschweren der Plastiktüten sorgen dafür, dass die Proben in Eiswasser getaucht werden. Ideal ist ein standardisiertes Gewicht.</td></tr></tbody></table>

feldbasierter thermischer physiologie-assay: kälteschockrückgewinnung unter umgebungsbedingungen

Field-Based Thermal Physiology Assay: Cold Shock Recovery under Ambient Conditions

Die ökologische Physiologie, insbesondere der Ektothermen, wird in dieser sich verändernden Welt immer wichtiger, da sie Messungen von Arten und Umweltmerkmalen verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Organismen und ihrer Umgebung zu untersuchen, um ihr Überleben und ihre Fitness besser zu verstehen. Herkömmliche thermische Assays sind in Bezug auf Zeit, Geld und Ausrüstung kostspielig und daher oft auf kleine Stichprobengrößen und wenige Arten beschränkt. Hier wird ein neuartiges Protokoll vorgestellt, das detaillierte Daten über das individuelle Verhalten und die Physiologie großer, volanter, terrestrischer Insekten am Beispiel von Schmetterlingen generiert. Dieses Papier beschreibt die Methoden eines Kaltschock-Wiederherstellungstests, der im Feld unter Umgebungsbedingungen durchgeführt werden kann und keine kostspielige Laborausrüstung erfordert. Diese Methode wurde verwendet, um die Reaktions- und Erholungsstrategie auf den Kälteschock tropischer Schmetterlinge zu verstehen und Daten auf individueller Ebene über ganze Schmetterlingsgemeinschaften hinweg zu generieren. Diese Methoden können sowohl in abgelegenen Feldumgebungen als auch in Klassenzimmern eingesetzt werden und können zur Generierung ökologisch relevanter physiologischer Daten und als Lehrmittel verwendet werden.

Die in diesem Protokoll gesammelten Daten ermöglichen die Untersuchung und Aufteilung von Variablen, die für die Physiologie des Organismus wichtig sind. Zum Beispiel tragen sowohl Temperatur als auch Lichtverhältnisse zur Erholung von Schmetterlingen von einem Kälteschock bei (Abbildung 1). Die Handlung soll die Wechselwirkung zwischen Umgebungsbedingungen und Kälteschock-Erholung untersuchen. Unter Verwendung von wild gefangenen Schmetterlingen sowohl aus Fallen als auch aus Netzen zeigten 181 Schmetterlingsarten eine deutliche Erholung von einem durch Kälteschock induzierten Kühlkre koma (Abbildung 2). Die in Abbildung 2 dargestellten Daten wurden von drei Beobachtern über etwa fünf Monate (Januar, Februar, Mai-Juli 2020) in den kolumbianischen Anden erhoben. Experimente wurden immer am Morgen nach der Schmetterlingssammlung durchgeführt. Bei maximaler Effizienz war es zwei Beobachtern möglich, jeweils vier Schmetterlinge gleichzeitig zu beobachten, die sieben Mal wiederholt wurden (mindestens 7,37 Stunden), was zu einer Untersuchung von 56 Individuen an einem einzigen Morgen führte. Dies ermöglichte eine große Datenerfassung über ganze Schmetterlingsgemeinschaften hinweg, während Daten über individuelle Variationen eingeschlossen und berücksichtigt wurden. Da Assays unter Umgebungsbedingungen auftreten können, sind die Erholungsbedingungen repräsentativ für ihre Lebensräume und spiegeln die natürliche Variation wider, die Organismen in der Natur erfahren. Abbildung 3 zeigt die Überlappung zwischen Temperatur und Lichtverhältnissen des Kälteschock-Erholungsexperiments und den Bedingungen auf einer Weide, von der einige getestete Schmetterlinge gesammelt wurden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig01.jpg"> Abbildung 1: Streudiagramme der Erholungszeit (in Sekunden) von Schmetterlingen nach einem Kälteschock. (A) Mittlere Temperatur und (B) mittlere LUX (Lichtintensität) während ihrer Genesung. Arten sind nach Familie organisiert und gefärbt. Insgesamt nimmt mit zunehmendem Licht und Temperatur die Erholungszeit für Kälteschocks ab, was eine Variabilität zwischen den Taxa zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für Ergebnisse des Kälteschock-Erholungstests an 181 Schmetterlingsarten aus den kolumbianischen Anden. Die Daten stellen die Anzahl der Sekunden dar, die verstrichen sind, bis der Schmetterling aus der Kälte entfernt wurde und wann er fliegen konnte. Arten sind nach Familie organisiert und gefärbt. Diese Abbildung zeigt die taxonomische Breite, über die dieses Experiment erfolgreich angewendet werden kann, und die Vielfalt der Kälteschock-Erholungsreaktionen über Arten hinweg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig03.jpg"> Abbildung 3: Umgebungstemperatur und LUX während Kaltschock-Wiederherstellungsversuchen. Darstellung der Umgebungstemperatur (blau) und LUX (Lichtintensität, rot), wie sie von Datenloggern aufgezeichnet wurden, die auf den Weiden platziert wurden, auf denen die Schmetterlingssammlung stattfand (helle Farben, Bedingungen erstrecken sich über den ganzen Tag) und Bedingungen während Kaltschock-Erholungsversuchen (dunkle Farben, nur Morgenstunden). Die dargestellten Umgebungsfeldbedingungen und Experimentellenbedingungen zeigen die Bandbreite und die durchschnittlichen Bedingungen, die Schmetterlinge während einer Woche Feldproben und -experimenten erlebt haben. Die Experimente wurden nur in den frühen Morgenstunden (07:00-13:00 Uhr) durchgeführt, während die Datenlogger eine Woche lang im Feld eingesetzt wurden (Tageslichtstunden, 06:00-18:00 Uhr). Hier wird die Überschneidung zwischen experimentellen Bedingungen und Umgebungsbedingungen von Schmetterlingen gezeigt, was die ökologische Relevanz der Durchführung physiologischer Assays unter Umgebungsbedingungen zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Verfahren zum Sammeln von fokalen Insekten-in diesem Fall Schmetterlingen-mit geköderten Van-Someren-Fallen und aktiven Netzen. Fallen wurden sowohl mit verrottenden Fischen als auch mit verrottenden Fruchtködern geködert. Falle (ohne Köder) im Hintergrund, im Vordergrund ist ein Exemplar in seiner einzigartigen Hülle vor einer blauen Plastiksammelbox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/Jove%20supplement%20fig%201.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Taschen mit bis zu vier einzelnen Schmetterlingen, die in Eiswasser in einem Kühler getaunken sind. Plastiktüten wurden mit der Zeit markiert, in der sie in das Eiswasser gelegt wurden, so dass Kälteschockexperimente durch den Morgen gestaffelt werden konnten. Plastiktüten sollten versiegelt werden, um zu verhindern, dass Proben nass werden; Eine Überflutung der Säcke und des Umschlags hatte in diesem Fall jedoch keinen messbaren Effekt auf die Erholung der Schmetterlinge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20supp%20fig%202.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Zwei Beobachter sammeln Daten im Feld. Jeder Netzkäfig enthält vier einzigartige Schmetterlinge, die sich von einem Kälteschock erholen. Das Polyvinylchlorid-T-Gelenk im Käfig beherbergt den Datenlogger, um direkte Sonnen- oder Regeneinstrahlung zu verhindern. Jeder Beobachter hat eine Stoppuhr, die sofort nach der Entlassung des Schmetterlings in den Käfig gestartet wurde. Die Käfige werden durch Bänke angehoben, so dass die Beobachter die Basis des Käfigs bewegen können, um sicherzustellen, dass die Schmetterlinge so schnell wie physiologisch möglich verhaltensmäßig reagieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20sup%20fig%203.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Beispieldatenblatt. Das Blatt zeigt die eindeutige ID jedes Schmetterlings, wie sie im Feld zugewiesen ist, und die Unterscheidungszeichen (Artname, Schlüsselfarben) in Notizen. Ebenfalls aufgezeichnet ist die dominante Position des Schmetterlings (d.h. welche Seite des Flügels der Sonne ausgesetzt war) während der Erholungsphase, notiert als D (dorsal) oder V (ventral). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218_R1_Supp-table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 1: Klopfen des Käfigs zur Erholung des Kälteschocks. Wenn sich Schmetterlinge erholen, tippt der Beobachter sanft auf die Basis des Käfigs, um Verhaltensweisen zu induzieren, sobald die Schmetterlinge dazu in der Lage sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/IMG_1712.MOV" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

Hier wird ein kostengünstiges, zugängliches Protokoll beschrieben, um die Kälteschockrückgewinnung von Schmetterlingen unter Umgebungsbedingungen zu bewerten.

Feldbasierter thermischer Physiologie-Assay: Kälteschockrückgewinnung unter Umgebungsbedingungen

Ecological physiology, particularly of ectotherms, is increasingly important in this changing world as it uses measures of species and environmental ...

Dieses Protokoll ist eine extrem kostengünstige Methode, um Daten über die Physiologie des Organismus auf zugängliche und standardisierte Weise zu sammeln. Dieses Werkzeug kann verwendet werden, um die Physiologie auf mehreren Ebenen zu erforschen. Es kann sowohl von unerschrockenen Feldbiologen als auch von kleinen Schulkindern eingesetzt werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf leicht verfügbaren Materialien beruht und sehr kostengünstig ist. Es kann fast überall und von Forschern mit einer Reihe von Fachkenntnissen und Zielen durchgeführt werden. Diese Methode kann Einblicke in physiologische, verhaltensbezogene und ökologische Prozesse geben.Da die Schlüsselmetriken für die Auslösung einer physiologischen Reaktion standardisiert sind, kann die Methode unsere Fähigkeit erhöhen, Schlüsselmerkmale über Gruppen von Individuen, Arten und ökologischen Gemeinschaften hinweg zu verstehen und zu vergleichen. Der Umgang mit Insekten, ohne sie zu beschädigen, erfordert Übung, aber Übung macht den Meister. Die Definition der Parameter Ihres Experiments, z. B. wie lange Insekten im Eiswasser zu halten sind, kann Zeit in Anspruch nehmen und erfordert Experimente und das Verständnis Ihrer fokalen Taxa.Heather Rohrer und Matt Standridge, zwei Techniker aus dem Daniel's Labor, demonstrieren mit mir das Verfahren. Beginnen Sie mit der Identifizierung der interessierenden Arten und denken Sie daran, dass sich jede Gruppe in der Zeit unterscheidet, die benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren. Wählen Sie basierend auf dem Organismus und der Verwendung von Daten verschiedene Cutoff-Punkte für das Experiment, wenn das Fokusperson nicht fliegt.Führen Sie ein Vorverfahren an einer kleinen Probe durch, um die Schlüsselparameter zu bestimmen, wie z. B. die Zeit, die auf Eis benötigt wird, um ein Kühlkoma zu induzieren. Wählen Sie eine Cutoff-Zeit basierend auf der Ökologie der Art. Denken Sie daran, dass nach vielen Minuten der Flugunfähigkeit einige Insekten von Raubtieren gefangen werden.Sammeln Sie Insekten mit geeigneten Methoden wie Köderfallen und entomologischen Netzen. Legen Sie jedes Individuum in eine separate Glassine-Hülle mit einer einzigartigen ID und bewahren Sie die Tiere an einem schattigen, kühlen Ort auf, der vor direkter Sonne, Wind und Raubtieren geschützt ist. Setzen Sie das Tier immer innerhalb von 24 Stunden nach dem Einfangen der experimentellen Behandlung aus, um diese Zeit so weit wie möglich über Versuche hinweg zu standardisieren.Füllen Sie einen Kühler mit Wasser und ausreichend Eis, um die Umgebung im Wasser bei null Grad Celsius zu halten. Wählen Sie zwischen einer und vier Fokuspersonen für eine Runde des Experimentierens und stellen Sie sicher, dass jedes Individuum identifizierbar ist. Wenn Sie mehrere Arten verwenden, verwenden Sie nur eine von ihnen, um Verwirrung zu vermeiden.Wenn das Experiment nicht mit der Flügelfärbung zusammenhängt, markieren Sie die Flügel mit eindeutigen IDs mit einem feinen Filzmarker, um Individuen zu unterscheiden. Wenn die Experimente keines der oben genannten Kriterien erfüllen, führen Sie das Experiment an einer Person gleichzeitig durch. Füllen Sie die Zeilen des Datenblatts mit den Informationen zu jedem untersuchten Insekt, einschließlich ihrer eindeutigen ID und einer nützlichen Kennung, in den Notizen.Legen Sie alle Fokuspersonen in einen versiegelten Plastikbeutel mit einem Gewicht und legen Sie den Beutel für 60 Minuten in Eiswasser, um ein Kühlkalkab zu verursachen. Verwenden Sie ein einfaches Thermometer, um die Umgebungstemperatur in kurzen Intervallen von Hand zu erfassen. Falls vorhanden, können Sie die Umgebungsbedingungen mit einem Datenlogger aufzeichnen.Verbinden Sie zunächst den Datenlogger, gehen Sie zum Gerät, starten Sie und wählen Sie das angeschlossene Gerät aus, indem Sie auf Ok klicken. Geben Sie den Testnamen ein, wählen Sie Temperatur und Lichtintensität und geben Sie die Einheiten ein. Legen Sie das Protokollierungsintervall auf 10 Sekunden fest.Geben Sie Datum und Uhrzeit für das Experiment ein und wählen Sie Verzögerter Start, um den Datenlogger zur ausgewählten Zeit zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Informationen des Datenloggers, einschließlich der Tageszeit, mit Experimenten synchronisiert werden, damit Daten über die Umgebungsbedingungen später mit jedem einzelnen fokalen Insekt abgeglichen werden können. Entscheiden Sie sich für die experimentellen Parameter, z. B. ob die Erholung im Schatten oder in der Sonne stattfinden wird, und vermerken Sie diese Behandlungen auf dem Datenblatt.Stellen Sie einen Netzkäfig für die Insekten an einem geeigneten Ort auf, damit die Temperatur und die Lichtumgebungen innerhalb des Käfigs homogen sind. Halten Sie die Basis des Käfigs erhöht, damit er vom Beobachter angezapft werden kann, und platzieren Sie den Datenlogger direkt außerhalb oder innerhalb des Käfigs, wo er ungestört gehalten werden kann. Entfernen Sie die Tiere nach 60 Minuten aus dem Eiswasserbad und entfernen Sie sofort die Insekten aus der Plastiktüte, entfernen Sie dann jedes Individuum schnell mit minimaler Handhabung aus seinem Umschlag und starten Sie die Stoppuhr, sobald sich die Tiere im Netzkäfig befinden.Klopfen Sie häufig und stark genug mit einem Bleistift auf die Basis des Käfigs, nur um die sich erholenden Insekten zu rühren, ohne eine Reaktion zu verursachen. Markieren Sie die Studie als abgeschlossen, sobald eine Person geflogen ist. Beenden Sie den Versuch und betrachten Sie, dass sich das Insekt nicht erholt hat, wenn es sich nach 30 Minuten nicht bewegt hat.Entfernen Sie die Insekten aus dem Netzkäfig und legen Sie die Individuen wieder in ihre beschrifteten Glassin-Umschläge. Befreien Sie die Tiere oder halten Sie sie für die weitere Datenerhebung und verarbeiten Sie die Daten wie im Textmanuskript beschrieben. Um auf die aufgezeichneten Umgebungsdaten zuzugreifen, stecken Sie den HOBO Datenlogger wieder in den Computer ein.Gehen Sie zur Geräteanzeige, wählen Sie Protokollierung beenden und speichern Sie die Dateien im gewünschten Ordner als HOBO-Dateien. Nachdem ein Popup angezeigt wurde, bestätigen Sie die Einheiten der Parameter und wählen Sie Plotten, um ein Diagramm für experimentelle Bedingungen zu erhalten. Um die Datentabelle zu exportieren, wählen Sie Tabellendaten exportieren und exportieren Sie sie als CSV-Datei, um sie im entsprechenden Ordner zu speichern.In diesem Protokoll wurde die Wechselwirkung zwischen Umgebungsbedingungen, die für die Physiologie des Organismus wichtig sind, und der Erholung des Kälteschocks für verschiedene Schmetterlingsarten untersucht. Es wurde beobachtet, dass mit steigender Durchschnittstemperatur der Versuchstemperatur die Erholungszeit für Kälteschocks abnahm, was zu variabilen Taxa führte. In ähnlicher Weise wurde die umgekehrte Beziehung zwischen der mittleren Lichtintensität des Versuchs und der Erholungszeit des Kälteschocks beobachtet, was darauf hindeutet, dass sowohl die Temperatur als auch die Lichtverhältnisse zur Erholung der Schmetterlinge beitragen.181 wilde Schmetterlingsarten, die von drei Beobachtern über einen Bericht über einen Fünfmonatstag gesammelt wurden, zeigten eine deutliche Erholung von einem durch Kälteschock induzierten Kühlkata, was die taxonomische Breite unterstreicht, in der dieses Experiment erfolgreich angewendet werden kann. Die Umgebungsfeldbedingungen und experimentellen Bedingungen wurden aufgezeichnet, um die ökologische Relevanz der Durchführung physiologischer Assays unter Umgebungsbedingungen zu demonstrieren. Achten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls genau auf alle Personen im Netzkäfig, da Verhaltensänderungen subtil sein und schnell auftreten können.Die durch dieses Protokoll generierten Daten geben Aufschluss über die ökophysiologischen Eigenschaften der getesteten Organismen. Viele andere Merkmale tragen zur Physiologie des Organismus bei, wie Größe, Farbe und Phylogenie. Daten zu zusätzlichen Merkmalen werden die Messungen der Erholung von Kälteschocks weiter erklären und kontextualisieren und den ökologischen und lebensgeschichtlichen Kontext dieser Informationen ergänzen.Ich habe diese Methode verwendet, um die Ökophysiologie ganzer Schmetterlingsgemeinschaften in den kolumbianischen Anden zu charakterisieren. Da das Protokoll zugänglich, billig und einfach genug ist, um es in ländlichen Umgebungen zu implementieren, wurden in kurzer Zeit Daten von Hunderten von Personen gesammelt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir versuchen, die neuronalen Immunsystems Signalisierung für Kälte-Vorkonditionierung als Mittel, um neue Targets für therapeutische Entwicklung zu identifizieren, um Gehirn vor Verletzungen schützen Beginn zu definieren. Wir präsentieren Strategien für solche Arbeiten, die biologische Systeme, experimentelle Manipulationen sowie technische Fähigkeiten, die in hohem Maße reproduzierbar und empfindlich sind, erfordern.

Strategies for Study of Neuroprotektion von Cold-Vorkonditionierung

In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.

Intrazelluläre Rückfaltung Assay

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Der kalte Plantar-Assay (CPA) misst die Kältereaktion zwischen 30 °C und 5 °C und kann auch die Kälteanpassung messen. Dieses Protokoll beschreibt, wie der CPA zur Messung von Kälteüberempfindlichkeit, Analgesie und Anpassung bei Mäusen verwendet wird.

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Messungen der Droge Ziel Engagement sind von zentraler Bedeutung für effektive Medikamentenentwicklung und chemische Sonde Validierung. Hier zeigen wir ein Protokoll zur Messung der Droge-Ziel Engagement mit hohen Inhalt Bildgebung in einer Mikrotestplatte-kompatiblen Adaption des zellulären thermische Verschiebung Assays (CETSA).

Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Hier werden standardisierte Protokolle zur Beurteilung der Induktion der Wärmeschockreaktion (HSR) bei Caenorhabditis elegans mit RT-qPCR auf molekularer Ebene, fluoreszierenden Reportern auf zellulärer Ebene und Thermorecovery auf Organismusebene vorgestellt.

Standardisierte Methoden zur Messung der Induktion der Hitzeschockreaktion bei Caenorhabditis elegans

Thermische Grenzwerte können die Umwelt, die Organismen tolerieren, vorhersagen, was angesichts des raschen Klimawandels wertvolle Informationen ist. Hier werden Protokolle mit hohem Durchsatz beschrieben, um kritische thermische Minima und Wärmeabstoßzeiten bei Insekten zu bewerten. Beide Protokolle maximieren den Durchsatz und minimieren die Kosten der Assays.

High-Throughput-Tests kritischer thermischer Grenzwerte bei Insekten

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Das Protokoll beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, wiederholbaren, präklinischen Modells des Belastungshitzschlags (EHS) bei Mäusen, die frei von nachteiligen äußeren Reizen wie Elektroschocks sind. Das Modell bietet eine Plattform für mechanistische, präventive und therapeutische Studien.

Ein präklinisches Modell des Belastungshitzeinschlags bei Mäusen

In dieser Arbeit wird eine Methode zur schnellen RNA-Extraktion und zum Vergleich auf Transkriptebene zur Analyse der Genexpression im Bärtierchen Hypsibius exemplaris vorgestellt. Diese Hochdurchsatzmethode erfordert mittels physikalischer Lyse ein einzelnes Bärtierchen als Ausgangsmaterial und führt zu einer robusten Produktion von cDNA für die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR).

Eintierische, einröhrige RNA-Extraktion zum Vergleich der relativen Transkriptspiegel mittels qRT-PCR im Bärtierchen Hypsibius exemplaris

Erfahren Sie, wie Sie einen kostengünstigen Feldbasierten Assay zur Untersuchung der Kälteschockrückgewinnung bei Schmetterlingen unter Umgebungsbedingungen durchführen. Diese Methode ermöglicht physiologische und ökologische Einblicke.

Feldbasierter thermischer Physiologie-Assay: Kälteschockrückgewinnung unter Umgebungsbedingungen

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