Name: Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Erfahren Sie die großtechnische Herstellung von GMP-Exosomen aus Synovialflüssigkeit-mesenchymalen Stammzellen mittels 3D-Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht effiziente Produktion für Arthritis-Forschung und klinische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

National Natural Science Foundation of China (Nr. 81972116, Nr. 81972085, Nr. 81772394); Schlüsselprogramm der Naturwissenschaftlichen Stiftung der Provinz Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong International Cooperation Project (No.2021A0505030011); Shenzhen Science and Technology Projects (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (No.2021A1515010985); Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201612079); Sonderfonds für den Bau von Krankenhäusern auf hohem Niveau in der Provinz Guangdong.

Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People's Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs
<ol><li>Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.<ol><li>Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-Sehne außerhalb der Patella in die Gelenkhöhle mit einer 7 # Nadel.</li>
		<li>Extrahieren Sie 10 ml der Gelenkflüssigkeit. Die Einstichstelle mit dem Transfusionsstift abdecken und 5 min drücken.</li>
	</ol></li>
	<li>Der SF-Überstand ist nach der Zentrifugation bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C zu verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 10 mL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS), zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C und verwerfen Sie das PBS.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet mit 10 ml humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von 5 x 104 Zellen/ml (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Suspension dann in einer 100-mm-Schale.</li>
	<li>Die Schale wird bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5%CO2 inkubiert.</li>
	<li>Nach 48 h die nicht adhärenten Zellen durch Mediumwechsel entfernen und mit 1x PBS waschen. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage für 2 Wochen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellkulturüberstände.</li>
	<li>Identifizieren Sie SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie.<ol><li>Aufschluss der dritten Generation (P3) von SF-MSCs, Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie das Zellpellet. HINWEIS: Eine Passage wird als Subkultur der Zellen zu einer anderen Kulturschale erkannt. Die aus SF isolierten und auf Schalen ausgesäten Primärzellen werden als Durchgang Null (P0) bezeichnet. Bei etwa 75% Zusammenfluss werden die Zellen verdaut und vom Geschirr getrennt, auf anderen Schalen ausgesät und als P1 gekennzeichnet.</li>
		<li>400 μL Blockierpuffer (1% BSA in 1x PBS) in das Zellpellet (5 x 104) geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) stehen lassen.</li>
		<li>Bei 1.000 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in 100 μL 1x PBS resuspendieren.</li>
		<li>1 μL monoklonaler fluoreszierender Antikörper CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (Verdünnungsverhältnis 1:100) (siehe Materialtabelle) pro Röhrchen zugeben und bei RT für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Zweimal mit 1x PBS waschen und den Überstand entsorgen. Sammeln Sie das Zellpellet und resuspendieren Sie es in 100 μL 1x PBS.</li>
		<li>Detektieren Sie auf einem Durchflusszytometer bis zu 10.000 Zellen mit Filtern von 525/50 und 585/40, um die Fluorophore zu erkennen.</li>
	</ol></li>
</ol>2.3D Bioreaktor-Zellkultur
<ol><li>Mikroträger-Vorbereitung<ol><li>Die trockenen 0,75 g Mikroträger quellen lassen (siehe Materialtabelle) und hydratisieren Sie 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 ml/g Mikroträger) für mindestens 3 h bei RT.</li>
		<li>Dekantieren Sie den Überstand und waschen Sie die Mikroträger für 5 min in frischem DPBS (50 ml/g Mikroträger). Entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch frisches 1x DPBS (50 ml/g Mikroträger).</li>
		<li>Sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi). Lassen Sie die sterilisierten Mikroträger absetzen, dekantieren Sie den Überstand.</li>
		<li>Spülen Sie die Mikroträger kurz im Kulturmedium (50 ml/g Mikroträger) bei RT. Lassen Sie die Mikroträger absetzen, verwerfen Sie den Überstand.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusionsbioreaktor<ol><li>Sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren (121 °C, 15 min, 15 psi).</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs und weisen Sie dem Bioreaktor, der mit GMP-fähigem MSC-Kulturmedium (250 ml) perfundiert ist, 2,5 x 107 SF-MSCs und Mikroträger zu.</li>
		<li>Den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C geben. Drehen Sie den Bioreaktor mit einer Drehzahl von 15 U/min. Wechseln Sie das Kulturmedium alle 6 Tage.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger für die weitere Analyse nach der Kultur für 14 Tage.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identifizierung von Exosomen und Sicherheitsnachweis
<ol><li>Ultrazentrifugation<ol><li>Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Entsorgen Sie die Zelltrümmer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Überstände bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C und sammeln Sie den Überstand; Verwerfen Sie die größeren Vesikel (apoptotische Körper und einige größere Mikrovesikel).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Überstand erneut bei 10.000 x g für 30 min bei 4 °C, um größere Vesikel zu entfernen; Sammeln Sie die Pellets und resuspendieren Sie sie in 40 ml 1x PBS.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die resuspendierten Pellets bei 120.000 x g für 70 min bei 4 °C, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets, die Exosomen enthalten, in 500 μL 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) HINWEIS: Für jeden Durchlauf wurden 500 μL der Probe mit einer Durchflussrate von 30 μL/min in die Kammer injiziert. Führen Sie die Analyse bei 24,4 °C-24,5 °C durch.<ol><li>Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem 1x PBS auf 1 ml mit 107-10 9 /ml Partikeln verdünnt und in das Nanopartikel-Tracking-Analysesystem injiziert (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.</li>
		<li>Analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit Software (siehe Materialtabelle), basierend auf der Verfolgung von mindestens 200 einzelnen Partikeln pro Lauf.</li>
	</ol></li>
	<li>Transmissionselektronenmikroskopie<ol><li>Fixieren Sie die Exosomen in 4% Paraformaldehyd (in kaltem 1x DPBS) für 5 min.</li>
		<li>Montieren Sie 5 μL der Exosomen auf Kupfergittern. In diesem Experiment beträgt die Konzentration der Exosomen 1 mg/ml, quantifiziert durch ein Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die Exosomen in 3% Phosphowolframsäure für 10 min auf Eis einbetten. Entfernen Sie die überschüssige Säure und trocknen Sie die Proben bei RT.</li>
		<li>Stellen Sie die Exosomenproben mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Western Blotting<ol><li>300 μL Lysepuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) und Proteaseinhibitor-Cocktail (siehe Materialtabelle) zu den Exosomen hinzufügen.</li>
		<li>Mischen Sie die Exosomen im Lysepuffer, indem Sie auf und ab pipettieren und 20 min auf Eis stehen lassen.</li>
		<li>Die Mischung bei 9.391 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>100 μL 4x Proteinladepuffer zugeben und 10 min bei 100 °C erhitzen.</li>
		<li>Laden Sie 15 μL Proteine in einer Konzentration von 10 mg/ml und laufen durch Gelelektrophorese (120 V, 70 min) und Elektroblotting bei 100 V, 60 min bei 4 °C.</li>
		<li>Nachweis der nicht-exosomenspezifischen Marker (Calnexin) und exosomalen Biomarker (CD9, CD63 und CD81) durch fluoreszierendes Western Blotting (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Sicherheitsprüfung<ol><li>Für den Nachweis von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis folgen Sie den Schritten 3.5.2-3.5.5.</li>
		<li>100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) werden auf eine Blutagarkulturplatte gesät (siehe Materialtabelle) und die Kulturplatte bei 37 °C für 24 h inkubiert.</li>
		<li>100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf eine Sabouraud-Agar-Mediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und bei 35 °C 48 h inkubiert.</li>
		<li>100 μL der Exosomenlösung (1 mg/ml) auf einer Lowenstein-Jensen-Kulturmediumplatte (siehe Materialtabelle) ausgesät und 3 Wochen bei 37 °C inkubiert.</li>
		<li>Erkennen Sie das Auftreten von Bakterien, Pilzen und Mycobacterium tuberculosis-Kolonien durch makroskopische Beobachtung. HINWEIS: Kriterien für die Bewertung der Sicherheit von Exosomen sind das Fehlen von Mikroorganismen auf der Kulturplatte.</li>
		<li>Führen Sie für den Mykoplasmennachweis die Schritte 3.5.7-3.5.9 aus.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Exosomen in 50 μL Pufferlösung, die im Kit enthalten ist, und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 3 min.</li>
		<li>Amplifizieren Sie das Mykoplasma in Exosomenlösung mit einem PCR-Mykoplasmen-Detektionskit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Nachweis der PCR-Produkte auf 1,5% Agarose-Gelelektrophorese (30 min, 120 V).</li>
	</ol></li>
</ol>4. In-vitro-Nachweis der Exosomenfunktion
<ol><li>Exosomen-Markierung<ol><li>100 μL Exosomen (1 mg/ml) mit 1 mM Dil (1000x) markieren (siehe Materialtabelle) und bei RT für 30 min inkubieren.</li>
		<li>Die Exosomen werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 x g für 70 min zurückgewonnen. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden von Cy3-miR-140 imitiert Exosomen<ol><li>Mischen Sie 1 μg/μL exosomales Protein und 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in einem Endvolumen von 400 μL Elektroporationspuffer (1,15 mM Kaliumphosphat (pH 7,2), 25 mM Kaliumchlorid und 21% (v/v) (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die Mischung wird mit einem Gentransfektionssystem in kalte 0,4 cm Elektroporationsküvetten und Elektroporat mit einer Kapazität von 300 V/100 μF überführt (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Halten Sie die Mischung unmittelbar nach der Elektroporation 30 Minuten lang bei RT, um sicherzustellen, dass die Exosomenmembran vollständig wiederhergestellt ist.</li>
		<li>Behandeln Sie die Mischungen mit einer Einheit RNase A (siehe Materialtabelle) für 20 Minuten, um die miRNA-Nachahmungen außerhalb der Exosomen zu eliminieren.</li>
		<li>Ultrazentrifugieren Sie das Exosomengemisch bei 120.000 x g für 90 min, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Exosomen in 500 μL 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Exosomen-Aufnahmetest<ol><li>Die Chondrozyten (1 x 107) werden in 35 mm konfokalen Schalen mit 1 ml DMEM/F12 mit 10% FBS ausgesät.</li>
		<li>Nach 24 h behandeln Sie die Chondrozyten 1 h lang mit DiI-markierten Exosomen (100 ng/ml) oder cy3-miR-140-beladenen Exosomen (100 ng/ml).</li>
		<li>Dreimal mit 1x PBS waschen und dann 10 min bei RT mit DAPI (10 ng/ml) etikettieren.</li>
		<li>Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie (CLSM) mit den entsprechenden Filtern (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Statistische Auswertung
<ol><li>Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter statistischer Software durch. ANMERKUNG: Die repräsentativen Daten in jeder Abbildung wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für den Vergleich zweier Gruppen mittels Statistiksoftware verwendet. Eine Einweg-ANOVA gefolgt von Tukey's Multiple wurde bei Vergleichen zwischen mehreren Gruppen durchgeführt. P-Werte <0,05 (*), <0,01 (**) oder <0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis%3A+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+bone%2C+cartilage+regeneration+remains+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li>
<li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine+and+Arthroscopy+Review%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li>
<li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li>
<li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%3A+a+proof-of-concept+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li>
<li>Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis%3A+state+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li>
<li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li>
<li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Lv, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li>
<li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+%283D%29+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt18. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. So wu...

Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt 1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist 3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht5. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren6. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen 7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können9. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.
Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapieuntersucht 12,13. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.

<table><tbody><tr><td>BCA-Assay-Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Proteinkonzentrationsassay</td></tr><tr><td>Blut-Agar-Platte</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>Bakterienkultur</td></tr><tr><td>CD105 Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>CD34 Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>CD45 Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>CD63 Antikörper</td><td>Abklonal</td><td>&nbsp; A5271</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>CD73 Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>CD81 Antikörper</td><td>ABklonal</td><td>&nbsp; A5270</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>CD9 Antikörper</td><td>Abklonal</td><td> A1703</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>CD90 Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Zentrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo</td><td></td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Konfokale Laser Scanning Fluoreszenzmikroskopie</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Microcarrier</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>EZ-PCR</td></tr><tr><td>Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>Mykoplasmen-Nachweis</td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie</td><td>Beckman</td><td></td><td>MSC-Identifizierung</td></tr><tr><td>Gene Pulser II System</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1652660</td><td>Gentransfektion</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Version 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Löwenstein-Jensen Kulturmedium</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>T0573</td><td>Mycobacterium tuberculosis-Kultur</td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 MSC-Kultur</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Nanopartikel-Tracking-Analyse</td></tr><tr><td>NTA 2.3 Software</td><td>Malvern</td><td></td><td>Datenanalyse</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>Fluoreszierendes Western Blotting</td></tr><tr><td>OptiPrep Elektroporationspuffer</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>Gentransfektion</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitoren Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Proteinase-Inhibitor</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>Entfernung von RNA</td></tr><tr><td>Sabouraud</td><td>Agarplatte Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>Pilzkultur</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>Das rotierende Zellkultursystem (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>3D-Kultur</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Exosomenzentrifuge</td></tr></tbody></table>

großtechnische herstellung von exosomen aus der synovialflüssigkeit mesenchymaler stammzellen durch 3d-bioreaktorkultur

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 (über 9...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit mit unserem 3D-Bioreaktor. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthritisbehandlung verwendet werden. Das Verfahren wird von Dr. Yujie Liang demonstriert.Beginnen Sie mit der Sammlung der menschlichen mesenchymalen Zellen oder MSCs, indem Sie die Synovialflüssigkeit bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 10 Milliliter PBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die resuspendierten Zellen bei 1 500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie PBS, bevor Sie das Pellet mit 10 Milliliter humanem MSC-Kulturmedium bei einer Zelldichte von fünf mal 10 bis zur vierten Zelle pro Milliliter resuspendieren und dann die Suspension in einer 100-Millimeter-Schale beschichten.Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält. Nach zwei Wochen sammeln Sie den Zellkulturüberstand, um mesenchymale Stammzellen der Synovialflüssigkeit oder SF-MSCs mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren. Um dies zu tun, verdauen Sie die dritte Generation der Passage drei von SF-MSCs durch Zentrifugation bei 1.000 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Dann verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet sammeln. Als nächstes fügen Sie dem Zellpellet 400 Mikroliter des blockierenden Puffers in der Konzentration von fünfmal 10 bis zum vierten hinzu und lassen Sie das Pellet 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie zuvor beschrieben und resuspendieren Sie dann das abgetrennte Pellet in 100 Mikrolitern 1X PBS.Fügen Sie einen Mikroliter des monoklonalen fluoreszierenden Antikörpers in einem Verdünnungsverhältnis von 1:100 pro Röhrchen hinzu, wie im Manuskript beschrieben, und stellen Sie das Röhrchen zur Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten ein. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen zweimal mit 1X PBS und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter 1X PBS. Anschließend detektieren Sie die Fluorophore in bis zu 10.000 Zellen auf einem Durchflusszytometer mit roten und FITC-Kanälen.Zur Herstellung der Mikroträger quellen und hydratisieren Sie 0,75 Gramm der Mikroträger in 1X DPBS in der Konzentration von 50 Milligramm pro Gramm für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie dann den Überstand, um die Mikroträger fünf Minuten lang in frischem DPBS zu waschen. Nach dem Ersetzen des Mediums durch frisches 1X DPBS bei 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm sterilisieren Sie die Mikroträger durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten bei 15 Pfund pro Quadratzoll.Lassen Sie dann die sterilisierten Mikroträger absetzen, bevor Sie den Überstand dekantieren. Die Mikroträger im Kulturmedium werden bei einer Konzentration von 50 Milligramm der Mikroträger pro Gramm bei Raumtemperatur gespült. Wenn die Mikroträger abgesetzt sind, verwerfen Sie den Überstand.Um den Perfusionsbioreaktor vorzubereiten, sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren, wie zuvor beschrieben. Wenn Sie fertig sind, zählen Sie die Anzahl der SF-MSCs, um 2,5 mal 10 den siebten SF-MSCs und Mikroträger dem Bioreaktor zuzuweisen, der mit 250 Milliliter des GMP-konformen MSC-Kulturmediums perfundiert ist. Stellen Sie den Bioreaktor in einen Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius bei einer Geschwindigkeit von 15 Umdrehungen pro Minute.Wechseln Sie das Kulturmedium alle sechs Tage. Nach 14 Tagen sammeln Sie die Zellkulturüberstände und Mikroträger zur weiteren Analyse. Zentrifugieren Sie den Zellkulturüberstand bei 300 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand, während Sie die Zelltrümmer entsorgen.Bei vier Grad Celsius zentrifugieren Sie den Überstand nacheinander bei 2.000 mal G für 10 Minuten und dann bei 10.000 mal G für 30 Minuten, um die größeren Vesikel zu verwerfen und das Pellet zu sammeln. Nach dem Resuspendieren des Pellets in 40 Milliliter PBS zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 120.000 mal G für 70 Minuten bei vier Grad Celsius. Dann resuspendieren Sie das gesammelte Pellet mit Exosomen in 500 Mikroliter PBS.Die frisch isolierten Exosomenproben werden mit sterilem PBS auf die Konzentration von 10 bis siebten bis 10 bis neunten Partikeln pro Milliliter verdünnt und 500 Mikroliter der Probe für jeden Durchlauf in die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA-System) bei 30 Mikrolitern pro Minute und 24,4 bis 24,5 Grad Celsius injiziert. Stellen Sie das Erfassungs- und Analysesystem manuell gemäß dem Protokoll des Herstellers ein. Visualisieren Sie die Partikel durch Laserlichtstreuung und erfassen Sie ihre Brownsche Bewegung auf digitalem Video.Als nächstes analysieren Sie die aufgezeichneten Videobänder mit einer Software und verfolgen mindestens 200 einzelne Partikel pro Lauf. Für das Western Blotting fügen Sie 300 Mikroliter des Lysepuffer- und Proteaseinhibitor-Cocktails zu den Exosomen hinzu, indem Sie auf und ab pipettieren. Dann lassen Sie sie 20 Minuten auf Eis stehen.Nach Zentrifugation der Mischung bei 9,391 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius wird die Proteinkonzentration im Überstand mit einem Proteinassay-Kit gemessen. Nach dem Assay erhitzen Sie die Probe mit 100 Mikrolitern 4X-Proteinladepuffer bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten. Als nächstes laden Sie 15 Mikroliter Proteine in einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter, um durch Gelelektrophorese bei 120 Volt für 70 Minuten und Elektro-Blotting bei 100 Volt für 60 Minuten bei vier Grad Celsius zu laufen.Erkennen Sie die nicht-exosomenspezifischen Marker wie Calnexin und die exosomalen Biomarker wie CD9, CD63 und CD81 durch fluoreszierendes Western Blotting. In der Studie wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass die kultivierten SF-MSCs negativ für CD34, CD45 und HLA-DR und positiv für CD73, CD90 und CD105 waren und die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten.Unter inverser Mikroskopie wurde festgestellt, dass sich die SF-MSCs auf Mikroträgern vermehren. Die SF-MSC vermehrte sich in der 3D-Kultur ab sechs Tagen schneller als die 2D-Kultur. Die Exosomen aus SF-MSCs der 2D- und 3D-Kultur wurden mittels Western Blotting identifiziert und die Exosomen exprimierten CD63, CD9 und CD81, während sie für Calnexin negativ waren.Die Nanozytenanalyse zeigte, dass der Durchmesser von 2D- und 3D-Exosomen etwa 120 Nanometer betrug. Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse zeigte die Morphologie von 2D- und 3D-Exosomen und zeigte annähernd kugelförmige Vesikel. Mittels NTA-Analyse wurde die Konzentration von 30 bis 160 Nanometer großen Partikeln analysiert.Nach 3D-Kultur betrug die Partikelkonzentration 4,0 mal 10 zu sechs pro Milliliter. Nach der 2D-Kultur betrug die Konzentration der gleich großen Partikel jedoch 2,5 mal 10 zu den sechs pro Milliliter. Darüber hinaus produzierte die 3D-Kultur mehr Exosomenprotein als die 2D-Kultur.Die repräsentative Analyse zeigt die Internalisierung von Dil-markierten Exosomen durch primäre Chondrozyten. Dil-markierte Exosomen, die in primäre Chondrozyten eingedrungen sind, können mit einem Peak nach drei Stunden gesehen werden. In-vitro-Verabreichungsstudie zeigte, dass Exosomen Sulfo-Cyanin3-markierte microRNA-140 an Chondrozyten abgeben können.Die Beschichtung der Zellen, das Starten der Reaktion im Bioreaktor und die des Überstands sind die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll. Die 3D-Kultur wird häufig für die großflächige Kultur adhärenter Zellen verwendet. Andere Methoden wie Spinflex können auch für die großtechnische Produktion von Exosomen verwendet werden.Unsere Methode verbessert die Ausbeute an Exosomen und ermöglicht so eine MSC-Exosom-basierte präklinische Anwendung.

large-scale-preparation-synovial-fluid-mesenchymal-stem-cell-derived

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Ein Protokoll zur Etablierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs), die aus der Synovialflüssigkeit und dem Knochenmark von Minischweinen isoliert und nicht-invasiv mittels Spritzenaspiration entnommen wurden, wird vorgestellt. Die zelluläre Phänotypisierung wurde mittels Durchflusszytometrie nach Zellisolierung und in vitro Kultivierung von Knochenmark und Synovialflüssigkeiten, die aus MSCs gewonnen wurden, durchgeführt.

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Das therapeutische Potenzial von mesenchymalen Stamm-/Stromazellen (MSCs) ist gut dokumentiert, jedoch bleibt die beste Methode, die Zellen für Patienten vorzubereiten, umstritten. Darin kommunizieren wir Protokolle zur effizienten Erzeugung und Verabreichung von therapeutischen sphärischen Aggregaten oder "Sphäroiden" von MSCs, die unter xenofreien Bedingungen für experimentelle und klinische Anwendungen geprimt wurden.

Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Eine Exosom ist eine neue Generation von Drug Delivery Träger. Wir etabliert eine Exosom Isolierung Protokoll mit hoher Ausbeute und Reinheit für SiRNA Lieferung. Wir auch Eindringmittel gekennzeichneten unspezifische SiRNA in Exosomen gekapselt und die zelluläre Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Krebszellen untersucht.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Dieses Protokoll beschreibt alle Verfahren, von der Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe über die Entnahme von Überständen bis hin zur Extraktion extrazellulärer Vesikel (EVs) mittels Ultrazentrifugation.

Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

In dieser Studie wird ein Protokoll zur Herstellung von 3D-bio-gedruckten Gerüsten für die chronische Wundheilung vorgestellt. Extrazelluläre Vesikel werden aus mesenchymalen Stammzellen isoliert und mit der Hülle aus Carboxymethylcellulose und Alginat-Lyase in den Kern (Alginat) geladen. Dieses Design ermöglicht eine kontrollierte Degradation des Gerüsts und eine effiziente Freisetzung von Elektrofahrzeugen.

Optimierung der extrazellulären Vesikelabgabe mit einem 3D-biogedruckten Gerüst für die Behandlung chronischer Wunden

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Erfahren Sie die großtechnische Herstellung von GMP-Exosomen aus Synovialflüssigkeit-mesenchymalen Stammzellen mittels 3D-Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht effiziente Produktion für Arthritis-Forschung und klinische Anwendungen.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Weitere Videos entdecken