Name: Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Lernen Sie die Patch-Elektrophysiologie zur Aufzeichnung afferenter Neuronenaktivität beim Schwimmen von Danio rerio. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring sensorischer Antworten auf Motorbefehle.

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Wir danken dem National Institute of Health (DC010809), der National Science Foundation (IOS1257150, 1856237) und dem Whitney Laboratory for Marine Biosciences für J.C.L. Wir danken ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Liao Lab für anregende Diskussionen.

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<li>Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+properties+of+primary+afferent+neurons+in+the+posterior+lateral+line+system+of+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).</li>
<li>Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+potentials+from+hair+cells+of+the+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor potentials from hair cells of the lateral line.</a> Science. 167 (3914), 76-79 (1970).</li>
<li>Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connectomics+of+the+zebrafish%27s+lateral+line+neuromast+reveals+wiring+and+miswiring+in+a+simple+microcircuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit.</a> eLife. 7, 33988(2018).</li>
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<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
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<li>Trapani, J. G., Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+from+zebrafish+lateral-line+hair+cells+and+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons.</a> Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).</li>
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<li>Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+larvae+evade+predators+by+sensing+water+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das beschriebene experimentelle Protokoll bietet das Potenzial, endogene Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen. Insbesondere beschreibt es einen In-vivo-Ansatz zur Durchführung simultaner extrazellulärer Aufnahmen von lateralen line afferenten Neuronen und ventralen motorischen Wurzeln in Larvenzebrafischen. Spontane affente Aktivität wurde zuvor bei Zebrafischen ohne Berücksichtigung einer möglichen gleichzeitigen motorischen Aktivi...

Affente Neuronen mechanosensorischer Systeme übertragen während des Hörens und Gleichgewichts Informationen von Haarzellen an das Gehirn. Die Elektrophysiologie kann die Empfindlichkeit afferenter Neuronen durch direkte Aufnahmen aufdecken. Während das Patchen ganzer Zellen aus Haarzellen eine Herausforderung sein kann, ist die Aufzeichnung von nachgeschalteten afferenten Neuronen einfacher und ermöglicht die Beurteilung von Aktionspotentialen als Reaktion auf kontrollierte Stimulationen1,2,3. Stimulierende Haarzellen führen zu ihrer Ablenkung, die mechanosensorische Strukturen verändert und so eine Zunahme der Aktionspotentiale (Spikes) in verschiedenen Neuronenauslöst 4,5,6. In Abwesenheit äußerer Reize steigen afferent neuronen auch spontan aufgrund von Glutamatlecks aus den Haarzellen auf die afferenten postsynaptischen Terminals7,8und tragen nachweislich zur Aufrechterhaltung der Empfindlichkeit bei9,10. Die Patch-Clamp-Aufzeichnung der afferenten Aktivität ermöglicht die Beobachtung der Empfindlichkeit und Signaldynamik von Haarzellen, die mit Techniken mit geringerer zeitlicher Auflösung nicht möglich sind, wie z.B. in der Mikrophonik11,12 oder funktionellen Calcium-Bildgebung13,14,15. Das folgende Protokoll ermöglicht die Aufzeichnung afferenter Aktivität gleichzeitig mit motorischen Befehlen, um sofortige Veränderungen der Haarzellempfindlichkeit aufzudecken.
Zebrafische (Danio rerio) verwenden Haarzellen, die in Neuromasten enthalten sind, die das Seitenliniensystem bilden, um Wasserbewegungen relativ zu ihrem Körper zu erkennen, die in neuronale Signale übersetzt werden, die für die Navigation unerlässlich sind16,17,18, Raubtiervermeidung, Beutefang19,20und Schulung21. Der Wasserfluss kann auch durch die Bewegungen des Schwimmens22 , 23,24, Atmung22 , 25,26und Fütterung27selbst erzeugt werden. Diese Verhaltensweisen umfassen sich wiederholende Bewegungen, die Haarzellen ermüden und die Wahrnehmung beeinträchtigen können. Daher ist es entscheidend, dass das Seitenliniensystem zwischen externen (exafferenten) und selbst erzeugten (reafferenten) Strömungsreizen unterscheidet. Eine Folgeentladung schwächt selbst erzeugte Strömungssignale während der Fortbewegung bei Zebrafischen ab. Dieses hemmende prädiktive motorische Signal wird über absteigende Neuronen an die sensorischen Rezeptoren weitergeleitet, um den Eingang zu modifizieren oder die Verarbeitung des reafferenten Feedbacks zu unterbrechen28,29. Bahnbrechende Arbeiten, die zu unserem frühen Verständnis dieses Feedforward-Systems beitrugen, stützten sich auf In-vitro-Präparate, bei denen die Konnektivität und die endogene Aktivität des neuronalen Schaltkreises nicht aufrechterhalten wurden28,30,31,32,33,34,35. Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Erhaltung eines intakten neuronalen Schaltkreises, in dem die endogene Rückkopplungsdynamik aufrechterhalten wird, wodurch ein besseres Verständnis der Folgeentladung in vivo ermöglicht wird.
Das hier beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Aktivität von afferenten Neuronen und Motoneuronen in Larvenzebrafischen gleichzeitig überwacht werden kann. Die Charakterisierung der afferenten Signaldynamik vor, während und nach motorischen Befehlen liefert Einblicke in die endogene Rückkopplung des zentralen Nervensystems in Echtzeit, die die Empfindlichkeit der Haarzellen während der Fortbewegung moduliert. Dieses Protokoll beschreibt, welche Materialien vor Experimenten vorbereitet werden müssen und beschreibt dann, wie Zebrafischlarven gelähmt und vorbereitet werden können. Das Protokoll wird beschreiben, wie eine stabile lose Patch-Aufzeichnung von afferenten Neuronen und extrazellulären ventralen Wurzelaufnahmen (VR) von Motoneuronen erstellt werden kann. Repräsentative Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden können, werden von einer beispielhaften Person präsentiert und die Analyse wurde an mehreren Replikaten des experimentellen Protokolls durchgeführt. Die Vorverarbeitung der Daten erfolgt mithilfe von benutzerdefinierten Skripten in MATLAB. Insgesamt ist dieses experimentelle In-vivo-Paradigma bereit, ein besseres Verständnis des sensorischen Feedbacks während der Fortbewegung in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem zu liefern.

<table><tbody><tr><td>100 mL Becherglas</td><td>PYREX</td><td>1000</td><td>Gefäß für Ätzmittel</td></tr><tr><td>10x Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10xW</td><td>niedrige Vergrößerung zur Positionierung von Larven und Aufnahmeelektrode</td></tr><tr><td>40x Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td>höhere Vergrößerung für die Positionierung der Elektrodenspitze und die Einrichtung einer Patch-Klemme</td></tr><tr><td>abfload.m</td><td></td><td>Ergänzende Codierungsdatei</td><td>Speziell geschriebenes MATLAB-Skript zum Konvertieren von elektrophysiologischen Rohaufzeichnungen in .mat-Dateien</td></tr><tr><td>AffVR_preprocess.m</td><td></td><td>Ergänzende Codierungsdatei</td><td>Speziell geschriebenes MATLAB-Skript zur Vorverarbeitung von Aufzeichnungsdaten</td></tr><tr><td>BNC-Koaxialkabel</td><td>ThorLabs</td><td>2249-C-12</td><td>zum Verbinden von Verstärker- und Digitizer-Kanälen; erfordert 4</td></tr><tr><td>Borosilikatglas-Kapillaren mit Filament</td><td>Warner Instrumente</td><td>G150F-3</td><td>Innendurchmesser: 0,86, Außendurchmesser: 1,50; Kapillarglas zur Bildung von Aufzeichnungselektroden</td></tr><tr><td>burst_detect</td><td></td><td>ergänzende Codierungsdatei</td><td>benutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die zum Ausführen von AffVR_preprocess</td></tr><tr><td>m Computer</td><td>N/A</td><td>N/A</td> erforderlich ist Jeder <td>Computer sollte funktionieren</td></tr><tr><td>DC-Netzteil</td><td>Tenma</td><td>72-420</td><td>wird zum elektrischen Ätzen von Dissektionsstiften verwendet</td></tr><tr><td>Digitalisierer für Elektrophysiologie</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>Axon DigiData 1440A</td><td>ermöglicht die Erfassung von Patch-Clamp-Datenfilamenten</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Company</td><td>FB255B</td><td>2,5-mm-Box-Filament für Mikropipettenzieher-Feinpinzetten</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artikel-Nr. 11295-10</td><td>zur Manipulation von Larven und zum Einsetzen von Stiften</td></tr><tr><td>mit festem Tisch DIC Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Mikroskop zur Visualisierung und Erstellung von Patch-Clamp-Aufzeichnungen</td></tr><tr><td>Flexible, konische Pipettenspitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-169</td><td>Flexible Spitzen ermöglichen das Einführen in die Aufzeichnungselektrode, um extrazelluläre Lösung an der Spitze abzugeben</td></tr><tr><td>FluoroDish</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>FD3510-100</td><td>Aufnahmeschüssel mit Deckglasboden</td></tr><tr><td>KimWipe</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td>Arbeitstuch zum Ableiten von überschüssiger Flüssigkeit von Larven</td></tr><tr><td>Kwik-Gard</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>710172</td><td>selbstmischendes Sylgard-Elastomer</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2020b</td><td>Befehlszeilensoftware für die Vorverarbeitung</td></tr><tr><td>von Daten Mikroelektrodenverstärker</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Patch-Clamp-Verstärker für Zweikanal-Aufnahmen</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830 Microforge</td><td>zum Polieren von Mikromanipulator für Aufnahmeelektroden</td></tr><tr><td> Steuergerät</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000-eR/T</td><td>4-Achsen-Drehknopf-Koordinator zur Steuerung des Mikromanipulators</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td>zum Einziehen von Kapillarglas in die Aufzeichnungselektroden</td></tr><tr><td>Mikroskop-Steuergerät</td><td>Siskiyou</td><td>MC1000e</td><td>positioniert das Mikroskop um den festen Tisch und die Vorbereitung</td></tr><tr><td>motorisierter Mikromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td>MX7600</td><td>positioniert den Kopftisch und die daran befestigte Aufnahmeelektrode für die Patch-Clamp-Aufzeichnung</td></tr><tr><td>MultiClamp Commander</td><td>Molecular Devices</td><td>2.2.2</td><td>kann von Axon heruntergeladen werden MultiClamp 700B Commander Download-Seite</td></tr><tr><td>Optischer Lufttisch</td><td>Newport Corporation</td><td>VH3036W-OPT</td><td>Breadboard-Isolationstisch zum Schwimmen des Mikroskops und zur Minimierung von Vibrationen während der Aufnahme</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Devices</td><td>10.7.0</td><td>zum Download von Axon pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung & Analyse-Software Download-Seite</td></tr><tr><td>Permanenttintenmarker</td><td>Sharpie-Bestellung</td><td>von amazon.com</td><td>zur Markierung der Vorderkantenseite der VR-Elektrode, um die richtige Ausrichtung beim Einführen in den Pipettenhalter zu gewährleisten</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Falcon</td><td>35-3001</td><td>zum Eintauchen von Larven in einen paralytischen</td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U hält die</td><td>Aufzeichnungselektrode und verbindet sie mit dem Kopftisch</td></tr><tr><td>pneumatischer Schallkopf</td><td>Fluke Biomedical Instruments</td><td>DPM1B</td><td>zur Steuerung der Aufzeichnungselektrode Innendruck</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>Ätzmittel zum Ätzen von Präparierstiften</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Tygon</td><td>14-169-1A</td><td>Schlauch zum Anschluss des pneumatischen Schallkopfs an den Pipettenhalter</td></tr><tr><td>spike_detect</td><td></td><td>ergänzende Codierungsdatei</td><td>benutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die für den Betrieb AffVR_preprocess</td></tr><tr><td>Stereomikroskops</td> Carl <td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>erforderlich ist, wird zur Visualisierung von Stiftspitzen und während der Vorbereitung von Larven</td></tr> verwendet gerade <tr><td>Rasierklinge</td><td>Canopus</td><td>Bestellung von amazon.com</td><td>schneidet den Wolframdraht bei der Herstellung von Sezierstiften</td></tr><tr><td>swimbout_detect</td><td></td><td>ergänzende Codierungsdatei</td><td>benutzerdefinierte MATLAB-Funktion, die für den Betrieb der</td></tr><tr><td>AffVR_preprocess-Spritze</td> erforderlich ist <td>Becton Dickinson Compoany</td><td>309602</td><td>gefüllt mit extrazellulärer Lösung zur Injektion in Aufzeichnungselektroden</td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z135003-500EA</td><td>unsterile Einwegpipette zum Übertragen von Larven</td></tr><tr><td>Tricain, Methansulfonat</td><td>Syndel</td><td>12854</td><td>Pharmazeutisches Anästhetikum zur Einschläferung von Larven mit hoher Dosierung.</td></tr><tr><td>Wolframdraht</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>715500</td><td>0,002 Zoll, 50,8 &mu; m Durchmesser; zur Herstellung von Präparierstiften</td></tr><tr><td>Vakuumfiltrationseinheit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCGVU11RE</td><td>sterile Einweg-Vakuumfiltrationseinheiten zur Sterilisation extrazellulärer Lösungen für die Elektrophysiologie Elektrodenringer Spannungsklemme</td></tr><tr><td>Stromklemme Kopftisch</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>geliefert mit MultiClamp 700B Verstärker als linker und rechter Kopftisch &</td></tr><tr><td>alpha;-Bungarotoxin</td><td>ThermoFisher</td><td>B1601</td><td>zur Immobilisierung der Larven vor der Aufnahme</td></tr></tbody></table>

aktivität von posterioren lateral line afferent neuronen beim schwimmen im zebrafisch

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sensorische Systeme sammeln Hinweise, die für die Steuerung des Verhaltens unerlässlich sind, aber Tiere müssen entschlüsseln, welche Informationen biologisch relevant sind. Die Fortbewegung erzeugt reafferente Hinweise, die Tiere von relevanten sensorischen Hinweisen der Umgebung entwirren müssen. Wenn beispielsweise ein Fisch schwimmt, wird der aus Körperandulationen erzeugte Fluss von den mechanorezeptiven Neuromasten erkannt, die aus Haarzellen bestehen, aus denen das Seitenliniensystem besteht. Die Haarzellen übertragen dann flüssige Bewegungsinformationen vom Sensor über die sensorisch afferenten Neuronen an das Gehirn. Gleichzeitig wird die Folgeentladung des Motorbefehls an die Haarzellen weitergeleitet, um eine Reizüberflutung zu verhindern. Die Berücksichtigung der hemmenden Wirkung prädiktiver motorischer Signale während der Fortbewegung ist daher bei der Bewertung der Empfindlichkeit des Seitenliniensystems von entscheidender Bedeutung. Wir haben einen elektrophysiologischen In-vivo-Ansatz entwickelt, um gleichzeitig die aktivität des hinteren lateralen Line afferenten Neurons und der ventralen motorischen Wurzel bei Zebrafischlarven (4-7 Tage nach der Befruchtung) zu überwachen, die mehrere Stunden dauern können. Extrazelluläre Aufnahmen von afferenten Neuronen werden mit der Loose Patch Clamp-Technik erreicht, die Die Aktivität einzelner oder mehrerer Neuronen erkennen kann. Ventrale Wurzelaufnahmen werden durch die Haut mit Glaselektroden durchgeführt, um die Aktivität von Motoneuronen zu erkennen. Unser experimentelles Protokoll bietet das Potenzial, endogene oder evozierte Veränderungen des sensorischen Inputs über motorisches Verhalten in einem intakten, sich verhaltenden Wirbeltier zu überwachen.

Nachdem Zebrafischlarven richtig immobilisiert und die hintere Seitenlinie afferentes Ganglion und VR-Aufzeichnung erreicht wurde, kann die Aktivität sowohl in afferenten als auch in Motoneuronen gleichzeitig gemessen werden. Die Anzeige der Aufzeichnungskanäle über lückenlose Aufzeichnungsprotokolle (Schritt 1.4) zur kontinuierlichen Überwachung der Afferent- und VR-Aktivität. In Echtzeit kann gleichzeitig mit der VR-Aktivität, die auf fiktive Schwimmkämpfe hinweist, eine Abnahme der spontanen afferenten Spitzenrate beo...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung von Veränderungen der afferenten Neuronenaktivität während motorischer Befehle in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem.

Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Dieses Protokoll ermöglicht es dem Forscher, die Aktivität und Reaktion einzelner sensorischer Neuronen auf eine kontrollierte Stimulation in intakten sich verhaltenden Wirbeln zu überwachen. Diese Patch-Elektrophysiologie ist eine schnelle und direkte Möglichkeit, die Spiking-Aktivität einzelner Neuronen in Echtzeit aufzuzeichnen. Und das bietet eine bessere Zeitauflösung und Empfindlichkeit zu geringeren Kosten als die meisten optischen Bildgebungstechniken.Die seitlichen Haarzellen sind homolog zu denen des menschlichen Innenohrs. Diese Technik ist also bereit, die Eigenschaften von Haarzellkreisläufen aufzudecken, die für menschliche Taubheit und Hörstörungen gelten. Elektrophysiologie ist ein Handwerk mit Feinmotorik, das gesehen und physisch nachgeahmt werden muss.Nur Textanweisungen lassen zu viel Raum für Fehlinterpretationen. Geben Sie zunächst eine dünne Schicht aus selbstmischendem Silikonelastomer wie Sylgard in eine Gewebekulturschale mit Deckglasboden, um eine Silikonelastomer-Bodenaufnahmeschale herzustellen. Um Sezierstifte herzustellen, stellen Sie einem 100-Milliliter-Becherglas von Etchant mit einem DC-Netzteil eine negative Ladung von fünf Volt zur Verfügung und befestigen Sie einen Wolframdraht an den positiv geladenen Ausgang.Tauchen Sie die Spitze des Drahtes wiederholt in das Etchant-Bad, bis sich die Spitze zu einem scharfen Punkt verengt. Schneiden Sie unter einem Stereomikroskop den Draht etwa einen Millimeter von der Spitze entfernt mit einer rasiermesserscharfen Klinge mit gerader Kante. Wiederholen Sie dies dreimal und stecken Sie dann die Stifte mit einer feinen Pinzette in die ausgehärtete Aufnahmeschale.Um Aufnahmeelektroden vorzubereiten, ziehen Sie Borosilikatglaskapillarröhren mit einem Mikropipettenzieher mit Boxfilament. Die Elektrode sollte eine Spitze mit einem Durchmesser von 30 Mikrometern und einer Verjüngung haben, mit der affelinete Neuronen aus der hinteren Seitenlinie aufgezeichnet werden. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern von einem bis fünf Mikrometern.Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um die Spitzen zu brechen. Polieren Sie die abgeschränkte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist. Der endgültige Spitzendurchmesser sollte zwischen 30 und 50 Mikrometern liegen.Immobilisieren Sie Zebrafischlarven und übertragen Sie sie mit einer großen Spitze in eine 35-Millimeter-Petrischale, um die Pipette zu übertragen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der umgebenden Lösung. Tauchen Sie larven Sie für etwa fünf Minuten in 10 Mikroliter 0,1% alpha-Bungarotoxin.Waschen Sie die gelähmte Larve mit extrazellulärer Lösung für 10 Minuten. Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die Larve aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Aufzeichnungsschale mit Silikonboden zu bewegen. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinspitzigen Zette über der Mitte dieser Silikonmatte, seitlich mit den vorderen und hinteren Enden des Körpers, die von links nach rechts verlaufen.Mit einer feinspitzigen Pinzette den Kantenstift orthogonal durch das dorsale Notochord der Larven direkt dorsal zum Anus einführen. Führen Sie den zweiten Stift durch das Notochord in der Nähe des Schwanzendes ein und führen Sie den dritten Stift durch den Notochord dorsal der Gasblase ein. Setzen Sie den vierten Stift durch das Otikvesikel ein, während Sie eine leichte Drehung bereitstellen, wenn der Stift in die Kapselung einführt.Wenn eine leichte Rotation angewendet wird, achten Sie auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem otischen Vesikel, um die Ansammlung von afferenten Somata freizulegen. Legen Sie die Stiftlarve unter das 10-fache Objektiv auf eine feste Stufe des DIC-Mikroskops und richten Sie die miozepalen Spalten der Muskelblöcke parallel zum linken Kopfstadiumvektor aus. Legen Sie den Erdungsdraht in die Badlösung und stellen Sie sicher, dass er mit der linken Kopfstufe verbunden ist.Füllen Sie die VR-Aufnahmeelektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung unter Verwendung einer flexiblen Gel-Loading-Pipettenspitze und führen Sie sie in den linken Kopftischpipettenhalter ein. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und senken Sie die Aufzeichnungspipette in die Schalenlösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Wandler erzeugt wird. Bringen Sie die Elektrodenspitze über ein Myoseptum zwischen den beiden Myomeren ventral zur Seitenlinie, bis die Spalte in der VR-Elektrodenspitzenöffnung zentriert ist Senken Sie die Pipette, bis die verzögerte Kante der Spitzenöffnung das Epithel sanft berührt.Manövrieren Sie die Pipette nach dem ersten Kontakt diagonal, um sicherzustellen, dass die Vorderkante Kontakt herstellt und eine Dichtung erzeugen kann. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten. Klicken Sie in der Patch-Clamp-Software auf die Schaltfläche Play in der Symbolleiste, um das VR-Signal zu überwachen.Stellen Sie sicher, dass die VR-Aufzeichnung erreicht wird, sobald die Motoneuronaktivität mit der stereotypen Burst-Signaldynamik von Wells beobachtet wird. Füllen Sie die afferenten Aufzeichnungselektrode mit 30 Mikrolitern extrazellulärer Lösung und führen Sie sie in den rechten Kopftischpipettenhalter ein. Senken Sie es dann in die Spüllösung, während Sie einen positiven Druck ausüben, der von einem pneumatischen Messumformer erzeugt wird.Suchen Sie die Elektrode und bringen Sie die Elektrodenspitze über die Probe. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferentielle Elektrodenspitze ab, bis sie die Position über dem Cleithrum hält. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache Eintauchen und lokalisieren Sie den Schnittpunkt des hinteren Seitenliniennervs und des Cleithrums.Bringen Sie die Elektrodenspitze über das afferenten Ganglion und senken Sie die Pipette, bis die Spitze das Epithel kontaktiert. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das affente Ganglion kontaktiert. Unterdruck mit dem pneumatischen Wandler ausüben und halten.Nachdem Sie in der Patch-Clamp-Software auf Play geklickt haben, stellen Sie sicher, dass die gesamte Zelle lose Patch-Aufnahme von afferenten Neuronen erreicht wird, wenn Spikes spontan etwa alle 100 bis 200 Millisekunden auftreten. Sobald sowohl die Aktivität unterschiedlicher Neuronen als auch der Motoneuronen erkannt wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen auf der Symbolleiste in Peak Clamp 10, um gleichzeitig lückenlose Aufnahmen in beiden Kanälen aufzunehmen. Führen Sie die Datenvorverarbeitung wie im Textmanuskript beschrieben durch.Mit diesem lückenlosen Aufzeichnungsprotokoll kann die Echtzeitaktivität von afferenten und VR-Neuronen gleichzeitig gemessen werden. Benutzerdefinierte Skripte mit Vorverarbeitung generieren Diagramme, um die Visualisierung der Spike-Erkennung mithilfe von Parametern wie Schwellenwert, Mindestdauer und minimalem Interspike-Intervall zu unterstützen. Isolierte Signale wurden durch Anpassung der Erkennungsvariablen für die Unter- und Obergrenze im Vorverarbeitungsskript erhalten.Die Erkennung ventraler Wurzelspitzen folgt identischen Parametern mit zusätzlichen Eingängen. Bursts innerhalb eines Motorbefehls werden durch mindestens zwei Spikes innerhalb von 0,1 Millisekunden definiert, die mindestens fünf Millisekunden dauern und durch mindestens drei Bursts mit Interburst-Intervallen von weniger als 200 Millisekunden abgegrenzt werden Vorverarbeitungsskripte überlagern Abschnitte unterschiedlicher Aktivität, die in einem genau definierten Zeitraum von Interesse eingegeben wurden. In diesem Fall zeigt die mittlere spontane Aktivität dramatische Veränderungen als Reaktion auf den Beginn der motorischen Aktivität, die auf der X-Achse als Zeit gleich Null dargestellt wird.Signifikante Unterschiede wurden in den afferenten Spike-Raten zwischen den Spike-Raten vor dem Schwimmen und den Spike-Raten sowohl der Schwimm- als auch der Post-Swim-Perioden festgestellt. Afferenten Spike-Raten waren negativ mit der Schwimmdauer korreliert. Es wird keine Korrelation zwischen relativer Spitzenrate und Schwimmfrequenz festgestellt.Tiergesundheit ist das Wichtigste, wenn Sie versuchen, dieses Verfahren zu versuchen. Es ist wichtig, den schnellen Blutfluss zu überwachen, um nicht nur das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten, sondern auch die Wahrscheinlichkeit eines neuronalen Aufzeichnungserfolgs zu erhöhen. Durch die Nutzung genetischer Werkzeuge, die in Zebrafischen verfügbar sind, kann dieses Elektrophysiologie-Protokoll durch transgene Linien ergänzt werden, um die Konnektivität anatomischer und funktioneller Schaltkreise in Haarzellsystemen und darüber hinaus leistungsfähig zu untersuchen.Diese vereinfachte Modifikation der Patch-Clamp-Technik ermöglicht es uns, zu überwachen, wie sensorische Systeme in vivo funktionieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Dieses Video beschreibt optogenetische Techniken, indem genetisch veränderte somatosensorische Neuronen aktiviert und die hervorgerufene Verhaltensreaktion mit einer Hochgeschwindigkeits-Videokamera aufgezeichnet werden.

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Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von elektrischen Signalen von den afferenten Neuronen in einer gelähmten Zebrafischlarve, indem eine Mikropipette in der Nähe des Ganglions der Seitenlinie positioniert und eine lose Dichtung für die Signalerfassung gebildet wird. Die extrazelluläre Lösung erhält während dieses Prozesses die neuronale Lebensfähigkeit.

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Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

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Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

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