Name: Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Generierung integrationsfreier iPSCs aus fetalen Fibroblasten mittels episomaler Plasmide und Nukleofektion. Diese Methode ermöglicht die Modellierung neurologischer Defizite beim Turner-Syndrom.

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Finanzielle Unterstützung für die oben genannte Forschung wurde von der Manipal Academy of Higher Education bereitgestellt. Die Charakterisierung der Linie wurde teilweise im Labor von M.M. Panicker am NCBS durchgeführt. Wir danken Anand Diagnostic Laboratory für die Unterstützung bei der Karyotypisierung.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die Erzeugung stabiler zellulärer Modelle zytogenetisch abnormalen fetalen Gewebes ist notwendig, um einen defekten Phänotyp aufrechtzuerhalten. Der iPSC-Weg ist die effektivste Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung defekter Eigenschaften20.
Pluripotente Stammzellen (PSC) zeigen Eigenschaften der Selbsterneuerung und Differenzierung in spezialisierte Zellen, die an frühe Spaltungsembryonen erinnern21. Daher können PSCs als hervorra...

Aneuploidien führen beim Menschen zu Geburtsfehlern/angeborenen Fehlbildungen und Schwangerschaftsverlust. ~ 50% -70% der Proben aus Schwangerschaftsverlusten zeigen zytogenetische Anomalien. Aneuploide Embryonen, die früh in der Schwangerschaft verloren gehen, können nicht einfach für experimentelle Analysen gewonnen werden, was die Notwendigkeit erhöht, andere Modelle zu entwickeln, die die menschliche Embryogenese genau repräsentieren. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die aus Zellen gewonnen wurden, bei denen genetische Störungen diagnostiziert wurden, wurden verwendet, um die repräsentativen genetischen Unregelmäßigkeiten und ihre Folgen für die fetale Entwicklung zu modellieren1,2,3,4. Diese iPS-Zellen ähneln Epiblastenzellen des sich entwickelnden Embryos und können die frühen Ereignisse der Embryonenbildung rekapitulieren. Sie ermöglichen das Verständnis und die Charakterisierung des Entwicklungsprogramms von Zelllinien und Mustern in frühen Säugetierembryonen. iPS-Zellen, die zuvor aus Hautfibroblasten und Amniozyten aus pränatalen diagnostischen Tests von Aneuploidie-Syndromen wie Monosomie X (Turner-Syndrom), Trisomie 8 (Warkany-Syndrom 2), Trisomie 13 (Patau-Syndrom) und partieller Trisomie 11 abgeleitet wurden; 22 (Emanuel-Syndrom) haben wertvolle Erkenntnisse über gescheiterte Entwicklungen geliefert4.
Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die durch weibliche Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine und metabolische Störungen, ein erhöhtes Risiko für Autoimmunerkrankungen und eine Prädisposition für Herz-Kreislauf-Erkrankungen gekennzeichnet ist5. Obwohl es das einzige überlebensfähige Monosomie-Syndrom ist, ist es auch tödlich für den sich entwickelnden Embryo, der spontane Abtreibungen verursacht6. Überlebende Individuen mit TS zeigen einen Grad der Veränderung von X-chromosomalem Material in ihren Zellen. Karyotypen reichen vom vollständigen Verlust eines X-Chromosoms (45,XO) bis hin zu Mosaiken wie 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, das Vorhandensein von Ringchromosomen, das Vorhandensein von Y-chromosomalem Material usw.5.
Die Diagnose des Syndroms erfolgt im Allgemeinen durch Karyotypisierung von Blut von symptomatischen Personen und Chorionzottenbiopsie (CVS), um frühe Aneuploidie-Syndrome zu erkennen. Da Aneuploidie-Syndrome für ~ 30% der spontanen Abtreibungen verantwortlich sind, ist es Routine, das Produkt der Empfängnis (POC) nach einer spontanen Abtreibung zu karyotypisieren. Diese fetalen Zellen, einschließlich der Chorionzotten, die die zytogenetische Anomalie besitzen, und die daraus abgeleiteten iPS-Zellen bieten eine wertvolle Quelle für biologisches Material zur Untersuchung der Aneuploidie-Syndrome4,6. TS iPS-Zellen wurden zuvor aus Amniozyten durch retrovirale Reprogrammierung4, Fibroblasten von Chorionzotten (erhalten durch pränatale Diagnostik) durch retrovirale Reprogrammierung6, aus mononukleären Blutzellen7 durch Sendai-Virus-Reprogrammierung und aus Hautfibroblasten von TS-Individuen durch lentivirale Reprogrammierung4 . Da das Hauptaugenmerk unseres Labors auf dem Verständnis von Entwicklungsstörungen liegt, haben wir TS iPSCs aus POC erzeugt, insbesondere die Chorionzottenkomponente einer spontanen Abtreibung8. Alle aus diesem fötalen Gewebe isolierten Zellen hatten einen 45XO-Karyotyp und ergaben iPS-Zellen mit dem gleichen Karyotyp. Diese iPS-Zellen sind einzigartig, da sie die ersten sind, die von einem abgetriebenen Fötus erzeugt werden und eine wertvolle Ressource zur Untersuchung von aneuploidiebedingten Schwangerschaftsfehlern darstellen. Dieser Artikel bietet eine detaillierte Methodik der Erzeugung von iPS-Zellen aus dieser einzigartigen Zellquelle durch episomale Reprogrammierung.
Die frühen Methoden der iPSC-Generierung verwendeten virale Transduktion und Transposons, um die Reprogrammierungsfaktoren zu liefern. Methoden zur Induktion von Zellen zur Pluripotenz haben sich von der Integration retroviralerVektoren 9,erregbaren lentiviralenVektoren 10,11 und Transposon-basierten Methoden12 zu nicht-integrierenden adenoviralenVektoren 13 und Sendai-Virus-basierten Vektoren14entwickelt. Retrovirale und lentivirale Reprogrammierung, obwohl effizient, beinhaltet die Integration der Reprogrammierungsfaktoren in die Wirtschromosomen, was zu Insertionsmutationen führt, die unvorhergesehene Auswirkungen in den iPS-Zellen haben. Darüber hinaus verhindert die virale Reprogrammierung die translationale Anwendung von iPS-Zellen. RNA-basierte Systeme15 und direkte Proteinabgabe16 wurden untersucht, um die potenziellen Risiken, die mit der Verwendung von Viren und DNA-Transfektionen verbunden sind, vollständig zu eliminieren. Diese Methoden haben sich jedoch als ineffizient erwiesen.
Im Jahr 2011 berichteten Okita et al. über eine verbesserte Effizienz der Reprogrammierung durch episomale Plasmide, die mit TP53-Unterdrückung über shRNA verstärkt wurden. Sie ersetzten cMYC auch durch nicht transformierendes LMYC (small cell lung carcinoma associated MYC), um die Sicherheit der hiPS-Zellen zu erhöhen. Diese episomalen Plasmide exprimieren 5 Reprogrammierungsfaktoren: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC und shRNA für TP5317,18. Diese Vektoren werden extrachromosomal beibehalten und gehen bei kontinuierlicher Kultur von den reprogrammierten Zellen verloren, wodurch die Linien innerhalb von 10-15 Passagen transgenfrei werden. Die Nukleofektion ist eine spezialisierte Form der Elektroporation, die Nukleinsäuren direkt in den Kern der Wirtszellen abgibt. Es ist eine effiziente Methode zur Abgabe der reprogrammierenden Plasmide in verschiedene Zelltypen. Episomale Plasmide sind kostengünstig und kompensieren die hohen Kosten der Nukleofektion. Diese Methode ist effizient und reproduzierbar unter optimierten Bedingungen und liefert stabile iPS-Zellen aus einer Vielzahl von somatischen Zellen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methode zur Erzeugung von iPS-Zellen aus Fibroblasten, die aus fetalem Gewebe durch Nukleofektion von episomalen Reprogrammierungsplasmiden isoliert wurden. Hier sind die detaillierten Protokolle für die Fibroblastenisolierung aus fetalen Chorionzotten, Plasmidreinigung, Nukleofektion, Pflücken von Kolonien von der Reprogrammierungsplatte und Etablierung stabiler iPS-Zellen.
Es ist wichtig, das Vorhandensein von Pluripotenzmerkmalen in den neu erzeugten iPS-Zellen zu bestätigen. Dazu gehören der Nachweis von pluripotenzbezogenen Faktoren (z. B. alkalische Phosphataseexpression, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-Cadherin; in der Regel mit Immunfluoreszenz- oder Genexpressionsassays gezeigt), die Identifizierung der drei Keimschichten durch In-vitro-Differenzierungstests zur Validierung ihres Differenzierungspotenzials, die Karyotypisierung zur Bestimmung des Chromosomengehalts, die STR-Typisierung zur Feststellung der Identität mit Elternzellen, die Überprüfung des Verlusts exogener Gene. und strengere In-vivo-Assays wie Teratombildung und tetraploide Komplementierung. Hier beschreiben wir Charakterisierungsprotokolle der Karyotypisierung, die alkalische Phosphatasefärbung lebender Zellen, den Nachweis von pluripotenzbezogenen Biomarkern durch Immunfluoreszenz, In-vitro-Differenzierungsassays und Methoden zum Nachweis des Verlusts exogener Gene19.

<table><tbody><tr><td>0,15 % Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>4', 6 Diamidino-2-phenylindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase Lebendfärbung</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>AP Färbung</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td><td></td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II Komplettmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Medium spezifisch für fetale Chorionzotten-Zellkulturen</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Plasmidaufreinigung</td></tr><tr><td>Anti Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Kontaminationskontrolle</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-OCT3/4</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>611202</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>560073</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor[FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Pluripotenzmittel</td></tr><tr><td>Knochenmorphogenetischer Faktor 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Rinder Serumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Blockierung</td></tr> von <tr><td>Kollagen Mensch Typ IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354245</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Kollagenasemischung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Verdau von fetalen Chorionzotten</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Restriktionsaufschluss</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Fixiermittel für die Karyotypisierung</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>Heparinnatrium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Insulinlösung human</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>Insulintransferrin Selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15210040</td><td>Mitotic Arrest für die Karyotypisierung</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>Luria Bertani</td><td>Agar HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Plasmidreinigung</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Differenzierungsassays</td></tr><tr><td>MEM Nichtessentielle Aminosäuren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Fixiermittel für die Karyotypisierung</td></tr><tr><td>Myosin-Ventrikuläre Schwerkette &alpha;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>NHDF Nukleofektor-Kit</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nukleofektion</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixierung von Zellen</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td><td>Addgen</td><td>27077</td><td>Episomale Reprogrammierung Plasmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Episomale Reprogrammierung Plasmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Episomale Reprogrammierung Plasmid</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td> Thermo Fisher Scientific,</td><td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotenz und Embryoid Körpermedium</td></tr><tr><td>Phalloidin- Tetramethylrhodamin B Isothiocyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 Tablette PBS gelöst in 200 ml entionisiertem Wasser und sterilisiert durch Autoklavieren Lagerung: Raumtemperatur. PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS. Lagerung: Raumtemperatur.</td></tr><tr><td>Plasmid-Aufreinigungs-Kit - Midi-Vorbereitung</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Plasmid-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid-Lösung</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Hypotonische Lösung für die Karyotypisierung</td></tr><tr><td>QIAamp DNA-Blut-Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Genomische DNA-Isolierung</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Hepatozyten-Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Hypotone Lösung zur Karyotypisierung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Permeabilisierung</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>Subkultur von &nbsp; fötale Chorionzotten-Fibroblasten</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Präparation von PBST</td></tr><tr><td>&beta; III Tubulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Immunzytochemie</td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Differenzierungsassays</td></tr></tbody></table>

generierung induzierter pluripotenter stammzellen aus dem turner-syndrom (45xo) fetaler zellen zur nachgelagerten modellierung neurologischer defizite im zusammenhang mit dem syndrom

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Chromosomale Aneuploidien verursachen schwere angeborene Fehlbildungen, einschließlich Fehlbildungen des zentralen Nervensystems und fetalem Tod. Das pränatale genetische Screening ist rein diagnostisch und klärt den Krankheitsmechanismus nicht auf. Obwohl Zellen von aneuploiden Föten wertvolles biologisches Material sind, das die chromosomale Aneuploidie trägt, sind diese Zellen kurzlebig, was ihre Verwendung für nachgelagerte Forschungsexperimente einschränkt. Die Generierung von modellen für induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ist eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur ständigen Erhaltung aneuploider Merkmale. Sie erneuern sich selbst und differenzieren sich zu spezialisierten Zellen, die an die Embryonalentwicklung erinnern. Daher dienen iPS-Zellen als hervorragende Werkzeuge, um frühe Entwicklungsereignisse zu untersuchen. Das Turner-Syndrom (TS) ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, endokrine, metabolische, autoimmune und kardiovaskuläre Störungen und neurokognitive Defekte. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von Fibroblasten aus TS (45XO) fetalem Gewebe, die Erzeugung von integrationsfreien TSiPS-Zellen durch Abgabe von episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Nukleofektion mit anschließender Charakterisierung. Die reprogrammierenden TSiPS-Zellen wurden zunächst durch lebendzellige alkalische Phosphatase-Färbung gescreent, gefolgt von umfangreichen Untersuchungen nach Pluripotenz-Biomarkern. Ausgewählte Kolonien wurden mechanisch seziert, mehrmals durchquert und stabile, sich selbst erneuernde Zellen für weitere Experimente verwendet. Die Zellen exprimierten Pluripotenz-Transkriptionsfaktoren OCT4, NANOG, SOX2, Zelloberflächenmarker SSEA 4 und TRA1-81, die typisch für pluripotente Stammzellen sind. Der ursprüngliche 45XO-Karyotyp wurde nach der Neuprogrammierung beibehalten. Die TSiPS-Zellen waren in der Lage, embryoide Körper zu bilden und sich in Zellen von Endoderm, Mesoderm und Ektoderm zu differenzieren, die linienspezifische Biomarker exprimieren ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Die exogenen episomalen Plasmide gingen spontan verloren und wurden nach Passage 15 in Zellen nicht nachgewiesen. Diese TSiPS-Zellen sind eine wertvolle zelluläre Ressource für die Modellierung defekter molekularer und zellulärer Neuroentwicklung, die neurokognitive Defizite im Zusammenhang mit dem Turner-Syndrom verursachen.

Generierung von integrationsfreien iPS-Zellen aus einem spontan abgetriebenen Fötus mit 45XO-Karyotyp Wir isolierten Fibroblasten aus FCV mit einem Turner-Syndrom (TS)-spezifischen 45XO-Karyotyp und nukleofizierten sie mit episomalen Reprogrammierungsplasmiden, um TSiPS-Zellen zu erzeugen, die für die nachgeschaltete Modellierung des Syndroms, insbesondere der damit verbundenen neurologischen Defizite, verwendet werden können (Abbildung 1a&amp; b). Für di...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von integrationsfreien iPS-Zellen aus fetalen Gewebefibroblasten durch Abgabe episomaler Plasmide durch Nukleofektion, gefolgt von der Beschreibung von Methoden zur iPSC-Charakterisierung und neuronalen Differenzierung.

Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Das Turner-Syndrom ist eine seltene Erkrankung, die mit einem ganz oder teilweise fehlenden X-Chromosom einhergeht. Das Syndrom ist gekennzeichnet durch Unfruchtbarkeit, Kleinwuchs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurokognitive Defekte. In einigen Fällen verursacht es den Tod des Fötus.Obwohl somatische Zellen von aneuploiden Föten biologisch wertvoll sind, sind sie kurzlebig, was ihre Verwendung in der Forschung einschränkt. Die Erzeugung von iPSC ist somit eine effektive Methode der Zellvorbereitung zur dauerhaften Erhaltung der aneuploiden Merkmale. Sie sind selbsterneuernd und können sich in spezialisierte Zelltypen differenzieren, die an die frühe Embryonalentwicklung erinnern.Die Verabreichung von nicht-integrierenden episomalen Reprogrammierungsplasmiden durch Kernfiktion ist eine effiziente und reproduzierbare Methode zur Erzeugung vollständig reprogrammierter und stabiler iPSCs. Diese Methode kann auch auf Zellen angewendet werden, die schwer zu programmieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir die Regeneration von iPS-Zellen aus fetalem Material mit Aneupliod.Die gesammelten fetalen Chorionzotten in eine sterile Petrischale geben. Waschen Sie es mehrmals mit PBS, das 1X antibiotische antimykotische Lösung enthält. Entfernen Sie das PBS vollständig durch Pipettieren.1 ml Kollagenasemischung in die Zotten geben und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren oder bis das Gewebe zerfällt. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die Kollagenase durch Zugabe von Medien, die 10% fötales Rinderserum enthalten. Den Inhalt der Petrischale in ein 15-ml-Röhrchen geben.Zentrifugieren Sie den Digest, um die zerfallenen Zotten und freigesetzten Zellen zu sammeln. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig. Plattenzerstörte Zotten zusammen mit freigesetzten Zellen in einem T25-Kulturkolben und AmnioMAX-Medien und wachsen, bis eine konfluente Fibroblastenkultur erhalten wird.Erweitern Sie Fibroblasten und Kultur, um Bestände für die Verwendung in nachfolgenden Transfektions- und Charakterisierungsexperimenten vorzubereiten. Bereiten Sie Alkalikulturen vor, die die reprogrammierenden Plasmide enthalten. Isolieren Sie die Plasmide mit Midi-Plasmid-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Suspendieren Sie jede Palette in einem geeigneten Volumen von DNAse RNAse freiem Wasser, um eine Endkonzentration von 1 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Überprüfen Sie die Plasmide mit dem ECoR1 Restriction Digestion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Trypsinisieren Sie die Chorionzotten fibroblasten.Neutralisieren und zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln. Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 5 ml OPTI-MEM erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und entfernen Sie 1 Million Zellen für die Nukleofektion.Zentrifuge, um die Zellpalette zu erhalten. Führen Sie eine Nukleofektion mit dem Amaxa NHDF Neukleofaktor-Kit durch. Herstellung eines Neukleofaktor-Reagenzes durch Mischen von 0,5 ml Ergänzung und 2,25 ml Nukleofaktorlösung, die im Kit enthalten ist.Entfernen Sie 100 Mikroliter Nukleofaktorlösung und fügen Sie 1 Mikrogramm jedes Plasmids hinzu. Suspendieren Sie vorsichtig 1 Million Zellen in dieser Mischung. Übertragen Sie die Zell-DNA-Suspension in die Küvette und stellen Sie sicher, dass die Probe den Boden der Küvette ohne Luftblasen bedeckt.Verschließen Sie die Küvette und stecken Sie sie in die Halterung. Wählen Sie das Nukleofaktorprogramm D-23 für hohe Effizienz und wenden Sie es an. Entfernen Sie die Küvette aus der Halterung und fügen Sie 1 ml AmnioMAX-Medien hinzu.Geben Sie den Inhalt vorsichtig in eine mit Gewebekultur behandelte Petrischale mit der im Kit enthaltenen Pipette. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Halten Sie die Zellen in AmnioMAX-Medien für 10 Tage und wechseln Sie dann für 20 Tage auf Pluripotenzmedium.Für die iPSC-Expansion sezieren Sie manuell die embryonalen stammzellähnlichen Kolonien, die in der Reprogrammierungsschale mit einer gezogenen Glaspipette gebildet werden. Vermehren Sie iPS-Zellen entsprechend und massieren Sie sie alle fünf bis sieben Tage. Die iPCSs waren positiv auf pluripotenzmarker alkalische Phosphatase.Erzeugen Sie embryoide Körper, indem Sie die iPSC-Kolonien in kleine Stücke schneiden und sie in Petrischalen mit geringer Bindung im embryoiden Körpermedium plattieren. Die Ektodermdifferenzierung wird induziert, indem am vierten Tag embryoide Körper im Ektoderm-Differenzierungsmedium plattiert werden. In ähnlicher Weise wird die Mesodermdifferenzierung induziert, indem tag acht embryoide Körper im Mesoderm-Differenzierungsmedium plattiert werden.Zur Induktion der Endodermdifferenzierung werden iPS-Zellen in einer Monoschicht im Endodermdifferenzierungsmedium kultiviert. Morphologische Veränderungen in Fibroblasten wurden im Zuge der Reprogrammierung beobachtet. Sie exprimieren eine epithelzellähnliche Morphologie und bildeten kompakte Kolonien.Die Zellen hatten auch ein Verhältnis von Zellkern zu Zytoplasma, typisch für pluripotente Zellen in Kultur. Die iPSCs besaßen einen 45 XO-Trägertyp und waren positiv für die Pluripotenzmarker OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 und E-CADHERIN. Die Zellen wurden auf repräsentative Keimschichtmarker angefärbt.Das Turner-Syndrom entwickelt somit neurokognitive Defizite. Neuronen, die vom Turner-Syndrom iPSC abgeleitet sind, können ein ausgezeichnetes Modell sein. Dies wird in einer Petriplatte modelliert, um die neue Linie des normalen dissoziativen Turner-Syndroms zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Die Stemgent Dox Inducible Maus TF Lentivirus Set kann embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs), um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) neu zu programmieren. Hier haben wir das Protokoll für DOX-induzierbare Expression von Maus Umprogrammierung Transkriptionsfaktoren Oct4 zu demonstrieren, Sox2, Klf4 und c-Myc iPS Kolonien, die ausdrückliche gemeinsamen mES Pluripotenz Marker zu generieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung embryonalen Maus-Fibroblasten mit einem Vier Transcription Factor, induzierbare Doxycycline Lentivirale Transduktionssystems

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Dieses Protokoll beinhaltet detaillierte Verfahren zur Isolierung von Urinzellen von Muskeldystrophie-Patienten; ihre effiziente und schnelle Reprogrammierung durch Sendai-Virus-Transduktion.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen von Muskeldystrophie-Patienten: Effiziente Integration freie Neuprogrammierung der Urin-abgeleiteten Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie neurale Vorläuferzellen von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen unterschieden werden können, um eine robuste und replikative neuronale Zellpopulation zu erhalten, die zur Identifizierung der Entwicklungswege verwendet werden kann, die zur Krankheitspathogenese bei vielen neurologischen Erkrankungen beitragen.

Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

In dieser Studie erzeugen wir induzierte pluripotente Stammzellen aus Fruchtwasserzellen der Maus unter Verwendung eines nicht-viralen Transposon-Systems.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Neuprogrammierung menschlicher hautabgeleiteter Fibroblasten in induzierte neuronale Vorläuferzellen (iNPCs) und deren anschließende Differenzierung in induzierte Astrozyten (iAs). Diese Methode führt zu einer schnellen und reproduzierbaren Generierung von iNPCs und iAs in großen Mengen.

In-vitro-Modellierung für neurologische Erkrankungen mit direkter Konvertierung von Fibroblasten in neuronale Progenitorzellen und Differenzierung in Astrozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Rekapitulation der durch das Down-Syndrom (DS) beeinträchtigten Neurogenese unter Verwendung von humanen DS-iPSCs. Das Protokoll identifizierte einen biphasischen Zellzyklusdefekt als Ursache für eine gestörte Neurogenese beim Down-Syndrom. Es bietet eine robuste Plattform für das Verständnis zellulärer und molekularer Mechanismen, die der abnormalen Neurogenese im Zusammenhang mit DS zugrunde liegen.

In vitro Modellierung der Down-Syndrom-Neurogenese mit human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Vorderhirn-spezifische Astrozyten erleichtert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Gliazellen bei der Pathogenese von neurologischen Entwicklungsstörungen, wie dem Fragile-X-Syndrom, und die Modellierung anderer Hirnerkrankungen.

Generierung und Charakterisierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten, denen das fragile X-Boten-Ribonukleoprotein fehlt

Erfahren Sie die Generierung integrationsfreier iPSCs aus fetalen Fibroblasten mittels episomaler Plasmide und Nukleofektion. Diese Methode ermöglicht die Modellierung neurologischer Defizite beim Turner-Syndrom.

Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom (Video) | JoVE Journal

Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus dem Turner-Syndrom (45XO) fetaler Zellen zur nachgelagerten Modellierung neurologischer Defizite im Zusammenhang mit dem Syndrom

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