Name: Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie die quantitative FRET-Methode zur Messung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie. Dieser Ansatz ermöglicht die Echtzeit-Analyse molekularer Prozesse.

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Wir danken dem Neuroscience Imaging Service der Stanford University School of Medicine für die Bereitstellung von Ausrüstung und Raum für dieses Projekt. Diese Forschung wurde durch intramurale Mittel des Stanford Cancer Institute und der Abteilung für gynäkologische Onkologie Stanford sowie durch GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 des Nationalen Büros für Forschung, Entwicklung und Innovation, Ungarn, unterstützt.

1. Plasmid-Konstruktion
<ol><li>Verwenden Sie zur Erzeugung der eGFP-mCherry1-Fusionssonde einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor (siehe Materialtabelle) mit mCherry110, der unter Verwendung der Restriktionsstellen AgeI und BsrGI eingefügt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Oligonukleotide, um eGFP11 ohne Stoppcodon als SalI-BamHI-Fragment zu amplifizieren: N-terminaler Primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' und C-terminaler Primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.</li>
	<li>Setzen Sie dieses SalI-BamHI-Fragment in die multiple Klonierungsstelle des N1-Vektors ein, um einen RNPPV-Linker (fünf Aminosäuren) zwischen dem grün und rot fluoreszierenden Protein einzuführen. HINWEIS: Dieser Linker ergibt eine mittlere FRET-Effizienz für das GFP-Cherry-Donor-Akzeptor-Paar von etwa 0,25 -0,3 (Abbildung 1A). Die Wahl von steifen12 - undhelikalen 13-Linkern unterschiedlicher Länge zur maßstabsgetreuen gemessenen FRET-Effizienz wurde an anderer Stelle diskutiert, ist aber für unseren Zweck des Fusionsproteins nicht erforderlich. Der Einfachheit halber nennen wir die fluoreszierenden Proteine "GFP" und "Cherry".</li>
</ol>2. Zellkultur und Transfektion
<ol><li>Verwenden Sie eine beliebige Zelllinie, z. B. NRK-Zellen, für FRET-Experimente in Medien, z. B. Dulbeccos modifizierte Eagle-Medien (DMEM), ohne Phenolrot, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Aus dem gleichen Grund wird die Verwendung von phenolrotfreiem Trypsin empfohlen.</li>
	<li>Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, trennen Sie die Zellen mit 1 ml 0,05 % Trypsin-EDTA, zählen Sie die Anzahl der in Suspension befindlichen Zellen mit einer Neubauer-Kammer und säen Sie etwa 10.000 Zellen pro Vertiefung eines Deckglases mit 8 Well-Kammern. Verwenden Sie alternativ aus einer konfluenten Zellkultur, die in einem T25-Kolben gezüchtet wurde, 1 Tropfen Zellsuspension aus einer 2-ml-Pipette oder 3 Tropfen aus einer 5-ml-Zellsuspension aus einer konfluenten Kultur, die in einem T-12,5-Zell-Kulturkolben gezüchtet wurde.</li>
	<li>Züchten Sie Zellen in 8-Well-Kammern (0,8 cm 2 / Well) mit #1,0 Deckglas für die Fluoreszenz-Lebendzellmikroskopie unter Standard-Zellkulturbedingungen (37°C und 5% CO2).</li>
	<li>24 h nach der Beschichtung werden die Zellen mit einem geeigneten handelsüblichen Transfektionsmedium (siehe Materialtabelle) mit GFP, Kirsche, GFP/Kirsch-Mischung (1:1-Mischung, d. h. 0,8 μg und 0,8 μg GFP- und Kirschplasmid-DNA) und der GFP-Kirsch-Chimäre transfizieren.<ol><li>Verwenden Sie für die Transfektion 5 μl des Transfektionsreagenzes in 45 μl DMEM und 1,6 μg Plasmid-DNA. Rühren Sie um, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig betätigen.</li>
		<li>Nach 15-minütiger Inkubation der Mischung bei Raumtemperatur 1-2 μl der Transfektionsreagenzmischung in jede Vertiefung des 8-Well-Objektträgers geben. Legen Sie das gekammerte Deckglas wieder in den Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Lassen Sie 20 Stunden nach der Transfektion verstreichen, bevor Lebendzell-Bildgebung durchgeführt wird, um eine ordnungsgemäße fluoreszierende Proteinexpression, Faltung und Reifung, insbesondere des roten Fluorophors, zu ermöglichen.</li>
</ol>3. FRET-Bildgebung
<ol><li>Abbildung transfizierter Zellen in einer befeuchteten und beheizten Klimakammer bei 37 °C. Um das Zellmedium bei einem physiologischen pH-Wert zu puffern, verwenden Sie CO 2 -Gas, das auf 5 % Durchfluss eingestellt ist, oder fügen Sie 20 mM HEPES hinzu, um das Zellmedium CO2 -unabhängig zu machen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Stellen Sie die Anregung und Emission wie folgt ein, um das Signal zu optimieren und das Übersprechen zu minimieren.<ol><li>Verwenden Sie die 488-nm-Linie des Argon-Ionenlasers, um GFP anzuregen, und den diodengepumpten 561-nm-Festkörperlaser (oder den 543-nm-Helium-Neon-Laser, abhängig von den verfügbaren Laserlinien), um Cherry anzuregen.</li>
		<li>Stellen Sie Folgendes in der Software eines kommerziellen konfokalen Mikroskops ein. Stellen Sie den dichroitischen Spiegel auf 488/561 ein, indem Sie über das Pulldown-Menü klicken. Sammeln Sie Fluoreszenz mit 488-nm-Laserlicht zur Anregung in Kanal 1 durch ein Emissionsband von 505 - 530 nm (oder 505 - 550 nm) und in Kanal 2 mit einem Langpassfilter &gt;585 nm und verwenden Sie das 561-nm-Laserlicht zur Anregung in Kanal 3 mit einem Langpassfilter &gt; 585 nm (Typ-in-Wellenlängen). Es können auch Bandpassfilter wie z.B. 590 - 650 nm oder ähnliches verwendet werden, die den Vorteil haben, Raman-Streuung auszuschließen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimulieren Sie mit den beiden Lasern nacheinander und stellen Sie den Bildgebungsmodus nach jeder Zeile auf Switch ein, so dass sich die Anregung des 512 x 512-Pixel-Bildes nach jeder Zeile abwechselt (und nicht nach jedem Bild, was die Fähigkeit zur Erkennung von FRET aufgrund der Diffusion der markierten Proteine aufheben würde, während die Bilder mit unterschiedlichen Anregungen aufgezeichnet werden; Klicken Sie auf die Schaltfläche).</li>
	<li>Richten Sie eine Mini-Zeitserie von drei Bildern per Tastenklick ein, um zu erkennen, ob ein signifikantes Photobleaching auftritt, und reduzieren Sie möglicherweise die Laserleistung. Optimal ist ein Photobleaching von weniger als 1%. Eine hohe Laserintensität kann auch zu einer Absorptionssättigung führen, die den scheinbaren FRET-Wirkungsgradverringert 14. Laserleistungen von bis zu 10-20 μW, gemessen an der Objektivlinse, sind sicher in der Anwendung.</li>
	<li>Erstens, Bildzellen, die das GFP-Cherry-Fusionskonstrukt exprimieren. Stellen Sie die Parameter ein, die die zeitintegrierte Laserintensität pro Pixel in einem konfokalen Bild definieren, d. h. die Pixelverweilzeit in Mikrosekunden, die akusto-optische Durchstimmungsfilter-Transmission (AOTF) in Prozent und den Zoom.<ol><li>Bildzellen mit einem 63-fachen Ölobjektiv und einem auf 3-fach eingestellten Zoom. Dies bietet eine ausreichende Vergrößerung und Auflösung, um Zellen in ihrer Gesamtheit abzubilden. Streben Sie eine Pixelgröße von 70-80 nm an.</li>
		<li>Stellen Sie die Pixelverweilzeit für den 488-nm- und 561-nm-Laser auf 2-4 μs und AOTF-Übertragung ein, so dass die Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Ausbleichen und keine Pixel aufweisen, die eine Fluoreszenzintensitätssättigung aufweisen. Es ist vorteilhaft, die Laserleistung von 488 und 561 so einzustellen, dass die Signalpegel in Kanal 1 und Kanal 3 ähnlich sind.</li>
		<li>Stellen Sie die Verstärkung des Photomultipliers (Mittelungsmodus) auf 600-800 ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie sich mit diesen Einstellungen 15-20 Zellen vor, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren. 15-20 Zellen liefern gute Statistiken, während die Gesamtzeit einer FRET-Messsitzung auf wenige Stunden begrenzt bleibt, um die Stabilität des mikroskopischen Aufbaus zu gewährleisten.</li>
	<li>Bild mit den gleichen Einstellungen: Zellen, die GFP, Cherry, GFP und Cherry exprimieren, und nicht transfizierte Zellen. Suchen Sie nach exprimierenden Zellen im grünen bzw. roten Kanal.</li>
	<li>Stellen Sie dann 15-20 Zellen dar, die Proteine von Interesse koexprimieren, die an GFP bzw. Cherry gekoppelt sind. Vermeiden Sie bei der Suche nach exprimierenden Zellen eine lange Exposition der Zellen, um die fluoreszierenden Proteine nicht zu bleichen. Cherry hat eine geringere Photostabilität als GFP, und das Bleichen von Cherry, dem Akzeptor, beeinträchtigt die FRET-Analyse. ANMERKUNG: Die Absorptions- und Emissionsspektren von GFP und Cherry sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Nach einer Messung von 5-6 h ist es ratsam, die Bildgebung einiger Zellen, die die GFP-Cherry-Chimäre exprimieren, am Ende der Bildgebungssitzung zu wiederholen, um zu dokumentieren, dass der Aufbau stabil blieb und sich die nachgewiesenen FRET-Wirkungsgrade des GFP-Cherry-Fusionsproteins im Verlauf einer Bildgebungssitzung nicht signifikant veränderten.</li>
</ol>4. Bildanalyse zur Erkennung absoluter FRET-Wirkungsgrade mittels Donor-Quenching und sensibilisierter Emission
HINWEIS: Hier finden Sie eine praktische Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Bestimmung der FRET-Effizienz mithilfe der beigefügten Tabelle (Ergänzende Datei 2). Theorie und Herleitung der vorgestellten Gleichungen finden Sie ausführlich in den vorangegangenen Veröffentlichungen 4,15,16,17. Mit den beschriebenen Einstellungen werden die folgenden Fluoreszenzintensitäten erfasst.
<ol><li>Messen Sie das Donorsignal I 1 in Kanal 1, dem Donorkanal, mit 488 nm Anregung und einer Emissionsbande von 505-530 nm. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq02.jpg"> wobei ID das ungelöschte Donorsignal in Kanal 1 ist, das in Abwesenheit eines Akzeptors gemessen würde, die mittlere FRET-Effizienz und B 1 das durchschnittliche Hintergrundsignal in Kanal 1 ist.</li>
	<li>Messen Sie das Akzeptorsignal I 3 in Kanal 3, dem Akzeptorkanal, mit 561 nm Anregung und Emission bei &gt;585 nm. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq03.jpg"> wobei IA das Akzeptorsignal und B 3 der Hintergrund in Kanal 3 ist.</li>
	<li>Messen Sie das FRET-Signal in Kanal 2, dem Übertragungskanal, mit 488 nm Anregung und Emission bei &gt;585 nm. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq04.jpg"> Dabei ist das Signal in Kanal 2 eine Summe aus vier verschiedenen Komponenten: (i) I D(1 - E)S1 ist der spektrale Überlauf vom gelöschten Donorsignal in den &gt;585-Detektionskanal (mit dem Übersprechfaktor S1), (ii) IAS2 ist das Akzeptorsignal aus der direkten Anregung durch 488-nm-Licht (mit dem Übersprechfaktor S2), (iii) IDEα ist die sensibilisierte Emission des Akzeptors durch FRET aus dem angeregten Donormolekül (α wird in 4.8. - 4.10. näher beschrieben), und (iv) B2 ist das Hintergrundsignal.</li>
	<li>Messen Sie die durchschnittlichen Hintergrundintensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 in nicht transfizierten oder simulierten Zellen; Beides ist mit vernachlässigbarem Unterschied in Ordnung. Verwenden Sie für alle Zellmessungen das Freihandwerkzeug, um Interessenregionen abzugrenzen und perinukleäre Vesikel mit erhöhter Autofluoreszenz zu vermeiden. Es ist wichtig, eine signifikante Autofluoreszenz dieser perinukleären Vesikel zu vermeiden.<ol><li>Geben Sie die Messungen in die Spalten X, Y und Z der bereitgestellten Tabelle ein. Die durchschnittlichen Hintergrundintensitäten in den 3 Kanälen werden in A2, B2 und C2 der Excel-Tabelle (Ergänzungsdatei 2) eingegeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen Sie die durchschnittlichen Intensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 von Zellen, die nur GFP oder Cherry exprimieren, und geben Sie die Messungen in die Spalten C, D, E und N, O, P ein.</li>
	<li>Um E, den FRET-Wirkungsgrad, zu berechnen, bestimmen Sie die Übersprechfaktoren S 1 und S2. Der spektrale Übersprechfaktor S1 wird aus Zellen berechnet, die nur GFP exprimieren <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq6v5.png"> in Spalte I. Geben Sie den Mittelwert für S1 in die Zelle D2 der Excel-Tabelle ein.</li>
	<li>Berechnen Sie den spektralen Übersprechfaktor S2 aus Zellen, die nur Cherry exprimieren <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq07.jpg"> in Spalte T. Geben Sie den Mittelwert für S2 in die Zelle E2 der Excel-Tabelle ein.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der α-Faktor das Signal einer beliebigen Anzahl von angeregten GFP-Molekülen in Kanal 1 mit dem Signal einer gleichen Anzahl von angeregten Cherry-Molekülen in Kanal 2 in Beziehung setzt und definiert ist durch <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq08.jpg">   <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"> wobei Q A und QD die Fluoreszenzquantenausbeuten von Cherry und GFP sind; ηA und ηD die Detektionseffizienz der Akzeptor- und Donorfluoreszenz in den Kanälen 2 bzw. 1. ANMERKUNG: Der α Faktor konnte aus zwei Proben bestimmt werden, die bekannte absolute Mengen an GFP und Cherry ausdrücken. Es ist jedoch unmöglich, die genaue Menge an GFP und Cherry zu kennen, die in einer Zelle exprimiert wird. Daher haben wir den Faktor berechnet, indem wir Zellen verwendet haben, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren. Während hier die absolute Menge noch unbekannt ist, ist bekannt, dass das Verhältnis von Donor- und Akzeptormolekülen eins ist.</li>
	<li>Messen Sie die durchschnittlichen Intensitäten in den Kanälen 1, 2, 3 von Zellen, die das GFP-Cherry-Fusionsprotein exprimieren, und geben Sie die Messungen in die Spalten AE, AF, AG ein. Hintergrundintensitäten werden subtrahiert (in AH, AI, AJ).</li>
	<li>Berechnen Sie den α-Faktor (AJ-Säule) aus den Fluoreszenzintensitäten in Kanal 1, 2 und 3 des GFP-Cherry-Fusionsproteins wie folgt: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq10v6.png"></li>
	<li>Hintergrundkorrigierte Intensitäten, die in Kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) bzw. 3 (I 3 - B3) gemessen werden, werden mit der GFP-Cherry-Chimäre gemessen. Der spektrale Übersprechfaktor S1 wurde unter Verwendung von Zellen bestimmt, die nur GFP exprimieren (siehe 4.7.). εD und ε A sind die Extinktionskoeffizienten von GFP, dem Donor, und Cherry, dem Akzeptor, bei 488 nm und können aus der Literatur (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 und der Absorptionskurve von Kirsche (εKirsche ≈ 5560 M-1cm 1) bestimmt werden. Das Verhältnis <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq11.jpg"> wurde in Zelle G2 der Excel-Tabelle eingegeben. Geben Sie den Mittelwert für den α Faktor in J2 ein.</li>
	<li>Verwenden Sie den ermittelten α Faktor für die Berechnung des FRET-Wirkungsgrads E wie folgt (Spalte AK): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq12v6.png"></li>
	<li>Alternativ können Sie die FRET-Effizienz E für die Negativkontrollen bestimmen, d. h. die Koexpression von GFP und Cherry und die Expression von GFP allein, indem Sie die Messungen der Kanäle 1, 2 und 3 in der Excel-Tabelle in Spalte AD, AE und AF unter den GFP-Cherry-Fusionsproteinmessungen addieren. Bestimmen Sie die FRET-Effizienz zwischen den GFP- und Cherry-markierten Proteinen auf die gleiche Weise.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Intensität des ungelöschten Donors, I D als (I 1 - B 1)/(1 - E), und die Akzeptorintensität als I A = I 3 - B3; Diese Werte sind proportional zu den Expressionsniveaus der markierten Proteine.</li>
	<li>Bestimmen Sie das korrigierte Akzeptor-zu-Donor-Intensitätsverhältnis (Q) des GFP-Cherry-Fusionsproteins wie folgt (Spalte AL): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"></li>
	<li>Berechnen Sie für andere co-transfizierte Zellen das Akzeptor-zu-Donor-Molekülverhältnis N A/ND wie folgt: <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq14.jpg"> HINWEIS: Der Grund für die Bestimmung des N A / N-D-Verhältnisses und die Darstellung der mittleren zellulären FRET-Effizienz E im Vergleich zu NA /N D ist, dass ein Donormolekül Energie auf mehrere Akzeptoren übertragen kann, während ein Akzeptormolekül nur Energie von einem Donor zu einem bestimmten Zeitpunkt erhalten kann. Selbst wenn aufgrund der Stöchiometrie der Wechselwirkung nur ein Akzeptor mit einem Spender interagieren kann, wird erwartet, dass eine Erhöhung der Akzeptorkonzentration aufgrund des Gesetzes der Massenwirkung den Anteil der Spender im Komplex mit dem Akzeptor erhöht. Daher sollte bei einer festen (oder engen Reichweite) der Spenderexpression die FRET-Effizienz mit zunehmendem N A/ND steigen. Bei der Darstellung der FRET-Effizienz E versus N A/N D für die Co-Expression von GFP und Cherry, d.h. der negativen Sonde, sollte eine Erhöhung der N A/N D jedoch nicht zu einer Erhöhung der FRET-Effizienz führen (zumindest bei ausreichend niedrigen Akzeptorkonzentrationen, bei denen aufgrund der Nähe von Akzeptorfarbstoffen zu Donorfarbstoffen keine zufällige FRET auftritt).</li>
</ol>

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<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270(2015).</li>
<li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li>
<li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung der genetisch gekoppelten Eins-zu-Eins-Fluoreszenzprotein-Kalibrierungssonde zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung des Nachweises der sensibilisierten Emission des Akzeptors und des Quenchings des Donormoleküls durch konfokale Mikroskopie. Diese Methode kann angewendet werden, um Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu bewerten. Die räumliche Auflösung kann weiter verbessert werden, ind...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Die mikroskopische Analyse des Förster-Resonanz-Energietransfers (FRET) ermöglicht die Beurteilung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen in lebenden Zellen. Es liefert räumliche und zeitliche Informationen, einschließlich Informationen darüber, wo in der Zelle und in welchem subzellulären Kompartiment die Interaktion stattfindet und ob sich diese Interaktion im Laufe der Zeit ändert.
Theodor Förster legte 1948 die theoretischen Grundlagen der FRET1. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem angeregten Donor zu einem Akzeptormolekül und hängt vom Abstand der Moleküle und der relativen Orientierung ihrer Übergangsdipole sowie von der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. Die Energieübertragungsrate ist umgekehrt proportional zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstands. Somit kann FRET verwendet werden, um die molekulare Nähe im Bereich von 1-10 nm zu messen.
FRET konkurriert mit anderen De-Anregungsprozessen des Donormoleküls und führt zur sogenannten Donor-Quenching und sensibilisierten Emission des Akzeptors. Donor-Quenching ist eine Verringerung der Anzahl der emittierten Donorphotonen, während sensibilisierte Emission eine Erhöhung der emittierten Akzeptorphotonen ist. Viele mikroskopische FRET-Analysen verwenden Fluoreszenzintensitätsmessungen, einschließlich Akzeptor-Photobleiche 2, Donor-Photobleiche2 oder FRET-sensibilisiertes Photobleichen des Akzeptors3.
Hier werden ein Schritt-für-Schritt-Versuchsprotokoll und ein mathematischer Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission4,5 vorgestellt, einer Methode, die oft als ratiometrische FRET bezeichnet wird. Es wurden viele Protokolle zur Annäherung an die sensibilisierte Emission veröffentlicht, nur wenige haben den absoluten FRET-Wirkungsgrad 6,7,8,9 quantifiziert. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung (i) des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine und (ii) der Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Während das Übersprechen durch die Bildgebung von Zellen beurteilt werden kann, die nur eines der Fluorophore exprimieren, ist die Beurteilung der relativen Detektionseffizienz der Donor- und Akzeptorfluoreszenz komplizierter. Es erfordert die Kenntnis mindestens des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die zu den gemessenen Signalen führen. Die Anzahl der in lebenden Zellen exprimierten Fluorophore variiert jedoch von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Der sogenannte α-Faktor charakterisiert die relativen Signalstärken eines einzelnen angeregten Donor- und Akzeptormoleküls. Die Kenntnis des Faktors ist eine Voraussetzung für quantitative ratiometrische FRET-Messungen in Proben mit variablen Akzeptor-zu-Donor-Molekül-Verhältnissen, wie sie bei der Bildgebung lebender Zellen mit fluoreszierenden Proteinen auftreten. Die Verwendung eines 1-zu-1-Donor-Akzeptor-Fusionsproteins als Kalibriersonde ermöglicht die Bestimmung des α Faktors und dient gleichzeitig als Positivkontrolle. Diese genetisch gekoppelte Sonde wird von Zellen in unbekannten Gesamtmengen, aber in einer festen und bekannten relativen Menge von eins zu eins exprimiert. Das folgende Protokoll beschreibt, wie die 1-zu-1-Sonde aufgebaut und zur Quantifizierung der FRET-Effizienz verwendet wird. Eine Tabelle, die alle Formeln enthält, finden Sie in der Beilage und kann von den Lesern verwendet werden, um ihre eigenen Maße in die jeweiligen Spalten einzugeben, wie unten beschrieben.
Während das Protokoll das GFP-Cherry-Donor/Akzeptor-Paar verwendet, kann der vorgestellte Ansatz mit jedem anderen FRET-Paar durchgeführt werden. Die Zusatzdatei 1 enthält Details zu cyan-gelben Paaren.

<table><tbody><tr><td>0,5% Trypsin-EDTA ohne Phenolrot (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Clontech mCherry N1 Vektor</td><td>Addgene</td><td>3553</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ohne Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 8-Well-Kammern #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung von proteininteraktionen in lebenden zellen mit fret-sensibilisierter emission

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist die strahlungslose Übertragung von Energie von einem angeregten Donor auf ein Akzeptormolekül und hängt vom Abstand und der Ausrichtung der Moleküle sowie dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsspektren ab. FRET ermöglicht es, die Interaktion von Proteinen in der lebenden Zelle im Laufe der Zeit und in verschiedenen subzellulären Kompartimenten zu untersuchen. In der Literatur wurden verschiedene intensitätsbasierte Algorithmen zur Messung von FRET mittels Mikroskopie beschrieben. Hier werden ein Protokoll und ein Algorithmus zur Quantifizierung der FRET-Effizienz bereitgestellt, die sowohl auf der Messung der sensibilisierten Emission des Akzeptors als auch der Abschreckung des Donormoleküls basieren. Die Quantifizierung der ratiometrischen FRET in der lebenden Zelle erfordert nicht nur die Bestimmung des Übersprechens (spektraler Spillover oder Bleed-Through) der fluoreszierenden Proteine, sondern auch die Detektionseffizienz des mikroskopischen Aufbaus. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie diese kritischen Parameter zu bewerten sind.

Abbildung 1 zeigt die Bilder, die im Donorkanal, Kanal 1 (488, 505-530 nm), im Übertragungskanal Kanal 2 (488, &gt;585 nm) bzw. im Akzeptorkanal, Kanal 3 (561, &gt;585 nm), erhalten wurden. Repräsentative Bilder von Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche exprimieren, GFP und Kirsche co-exprimieren und das GFP-Kirsch-Fusionsprotein exprimieren. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Cherry-Fusionsprotein ...

Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

Bewertung von Proteininteraktionen in lebenden Zellen mit FRET-sensibilisierter Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Dieses Protokoll beschreibt einen Schritt-für-Schritt-experimentellen Prozess und einen mathematischen Algorithmus zur Quantifizierung von FRET unter Verwendung von Donor Quenching und akzeptorsensibilisierter Emission. Die Quantifizierung der FRET-Effizienz in der lebenden Zelle erfordert die Bestimmung des Übersprechens der fluoreszierenden Proteine und der relativen Emissions- und Detektionseffizienz der Fluorophore im mikroskopischen Aufbau. Crosstalk kann durch bildgebende Zellen beurteilt werden, die nur ein Fluorophor exprimieren.Die Beurteilung der Detektionseffizienz eines Donor- oder Akzeptormoleküls erfordert die Kenntnis des Verhältnisses der Anzahl der Donor- und Akzeptormoleküle, die das Messsignal erzeugen. Die Anzahl der Fluorophore, die in lebenden Zellen exprimiert werden, variiert von Zelle zu Zelle und ist unbekannt. Die bei dieser Methode verwendete Kalibriersonde, ein Eins-zu-Eins-Donor-Akzeptor-Fusionsprotein, ermöglicht es, die relative Detektionseffizienz von Donor- und Akzeptormolekülen zu bestimmen.Verwenden Sie zunächst einen N1-Säugetierzellexpressionsvektor mit mCherry 1 zur Erzeugung der EGFP mCherry 1-Fusionssonde. Entwerfen Sie Oligonukleotide zur Amplifikation von EGFP ohne Stoppcodon als Zelle eines BAM-h1-Fragments. Der Fünf-Aminosäure-Linker zwischen dem grün und rot fluoreszierenden Protein sollte einen mittleren FRET-Mangel für das GFP-Kirsch-Donor-Akzeptor-Paar von 0,25 bis 0,3 ergeben.Verwenden Sie jede Zelllinie und jedes Medium ohne Phenolrot, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Sobald die Zellen zu 80 % konfluent sind, trennen Sie sie mit einem Milliliter 0,05 % Trypsin EDTA und säen Sie etwa 10.000 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit acht Vertiefungen, indem Sie drei Tropfen aus einer Fünf-Milliliter-Zellsuspension hinzufügen. Transfizieren Sie die Zellen 24 Stunden nach der Beschichtung mit einem geeigneten Transfektionsmedium.Inkubieren Sie die Zellen 20 Stunden lang, bevor Sie lebende Zellen bilden, um eine ordnungsgemäße Expression des fluoreszierenden Proteins, eine Faltung und Reifung zu ermöglichen. Stellen Sie die Zellen in einer befeuchteten und beheizten Klimakammer bei 37 Grad Celsius mit einem konfokalen Rastermikroskop dar. Um das Zellmedium bei physiologischem pH-Wert zu puffern, fügen Sie 20 millimolare HEPES hinzu, um das Zellmedium kohlendioxidunabhängig zu machen.Montieren Sie dann den Objektträger auf dem Mikroskop. Verwenden Sie die 488-Nanometer-Linie des Argon-Ionenlasers, um das GFP anzuregen, und den 561-Nanometer-Diodenlaser, um Kirsche anzuregen. Richten Sie den 488-Nanometer-Laser für die Anregung in Kanal eins durch ein Emissionsband von 505 bis 530 Nanometern und in Kanal zwei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern ein.Verwenden Sie den 561-Nanometer-Laser zur Anregung in Kanal drei mit einem Langpassfilter von über 585 Nanometern. Anregen Sie die beiden Laser nacheinander an und stellen Sie den Bildgebungsmodus so ein, dass nach jeder Zeile umgeschaltet wird, sodass sich die Anregung des 512 x 512 Pixel großen Bildes nach jeder Zeile abwechselt. Richten Sie eine Mini-Zeitreihe mit drei Bildern ein, um zu erkennen, ob ein signifikantes Photobleaching auftritt, und reduzieren Sie gegebenenfalls die Laserleistung.Erstens, Bildzellen, die das GFP-Kirschfusionskonstrukt exprimieren. Legen Sie die Parameter fest, die die zeitintegrierte Laserintensität pro Pixel in einem konfokalen Bild definieren. Verwenden Sie ein 63-faches Ölobjektiv und einen auf 3-fach eingestellten Zoom, um eine Zelle in ihrer Gesamtheit mit ausreichender Vergrößerung und Auflösung abzubilden.Streben Sie eine Pixelgröße von 70 bis 80 Nanometern an. Stellen Sie die Pixelverweilzeit auf zwei bis vier Mikrosekunden und die AOTF-Übertragung für den 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Laser ein, so dass die Bilder ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Bleichen und keine Pixel zeigen, die eine Sättigung der Fluoreszenzintensität anzeigen. Stellen Sie die Laserleistung von 488 und 561 so ein, dass die Signalpegel in Kanal eins und Kanal drei ähnlich sind.Stellen Sie die Verstärkung des Fotomultiplikators auf 600 bis 800 ein. Abbildung 15 bis 20 Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, Zellen, die GFP, Kirsche, GFP und Kirsche exprimieren, und nicht durchtrennte Zellen. Dann bilden Sie Zellen ab, die die interessierenden Proteine koexprimieren, die an GFP bzw. Kirsche gekoppelt sind.Um FRET zu berechnen, messen Sie das Donorsignal in Kanal eins, dem Donorkanal mit 488 Nanometern Anregung und einer Emissionsbande von 505 bis 530 Nanometern. Messen Sie dann das Akzeptorsignal in Kanal drei, dem Akzeptorkanal mit 561 Nanometer Anregung und Emission bei über 585 Nanometern. Messen Sie schließlich das FRET-Signal in Kanal zwei, dem Übertragungskanal mit 488 Nanometern Anregung und Emission bei über 585 Nanometern.Das Signal in Kanal zwei ist eine Summe aus vier verschiedenen Komponenten: dem spektralen Spillover vom gelöschten Donorsignal in den über 585 Detektionskanal mit einem Übersprechfaktor S1, dem Akzeptorsignal aus direkter Anregung durch 488 Nanometerlicht mit einem Übersprechfaktor S2, der sensibilisierten Emission des Akzeptors durch FRET aus dem angeregten Donormolekül, und das Hintergrundsignal. Es wurden Bilder im Spenderkanal, im Transferkanal und im Akzeptorkanal erhalten, wobei Zellen, die nur GFP exprimieren, nur Kirsche, GFP und Kirsche co-exprimieren, und das GFP-Kirschfusionsprotein gezeigt werden. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade, die in NRK-Zellen berechnet wurden, die GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, und solche, die GFP-Kirschen co-exprimieren, werden im Vergleich zum Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, dem Intensitätsverhältnis oder dem molekularen Verhältnis in jeder Zelle aufgetragen.Pixel-für-Pixel-FRET-Bilder von Zellen, die das GFP-Kirschfusionsprotein exprimieren, GFP und Kirsche als Negativkontrolle co-exprimieren und Rezeptoruntereinheiten des Ashwell-Morell-Rezeptors exprimieren, sind hier zu sehen. RHL1 und 2 des Leberlektins der Ratte wurden mit GFP und Kirsche auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran markiert. Die mittleren zellulären FRET-Wirkungsgrade von Zellen, die GFP RHL1 und Cherry RHL2 exprimieren, und GFP RHL1 Delta Stock und Cherry RHL2 werden im Vergleich zum Molekülverhältnis von Akzeptor zu Spender aufgetragen.Der vorgestellte quantitative FRET-Ansatz ermöglicht Folgendes. Nachweis von Proteininteraktionen im physiologischen Kontext der lebenden Zelle. Veränderungen der Proteininteraktionen im Laufe der Zeit.Unterschiede in den Wechselwirkungen in subzellulären Kompartimenten bis hinunter zur Pixel-für-Pixel-Ebene eines konfokalen Bildes. Und die Abhängigkeit des detektierten FRET-Signals vom molekularen Akzeptor-zu-Donor-Verhältnis, das in einer lebenden Zelle exprimiert wird.

assessing-protein-interactions-live-cells-with-fret-sensitized

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Das Video beschreibt die FLIM-FRET-Bildgebungstechnik zur Bestimmung der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Bakterien, die zytoplasmatische Proteine exprimieren, die mit fluoreszierenden Proteinen, einem Donor-eGFP und einem Akzeptor mCherry markiert sind. Die kombinierte Technik ermöglicht auch die Quantifizierung der interagierenden Proteine.

FLIM-FRET-Bildgebung zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien

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Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

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Protein-Protein-Interaktionen sind von entscheidender Bedeutung für biologische Systeme, und Studien der verbindliche Kinetik geben Einblicke in die Dynamik und Funktion von Proteinkomplexen. Wir beschreiben eine Methode, die die kinetischen Parameter von einem Proteinkomplex mit Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer und die gestoppt-Flow-Technik quantifiziert.

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Akt-Aktivierung und Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen zu quantifizieren. Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das wertvolle Einblicke in die Insulinsignalwege und die Stoffwechselregulation in Krebszellen liefert.

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