Name: Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Lernen Sie die Schwanzveneninjektion zur Modellierung von Hirnmetastasen bei entzündlichem Mammakarzinom in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung metastatischer Prozesse und die Entwicklung neuer Therapien.

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Wir danken Christine F. Wogan, MS, ELS, von MD Anderson's Division of Radiation Oncology für die wissenschaftliche Bearbeitung des Manuskripts und Carol M. Johnston von MD Anderson's Division of Surgery Histology Core für die Hilfe bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Wir danken dem Veterinärmedizin- und Chirurgiezentrum von MD Anderson für die Unterstützung der Tierversuche. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien unterstützt: Susan G. Komen Career Catalyst Research Grant (CCR16377813 an BGD), American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-19-126-01 an BGD) und das State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Teilweise auch unterstützt durch den Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 des National Cancer Institute, National Institutes of Health, an das MD Anderson Cancer Center der University of Texas.

Die hier beschriebene Methode wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des MD Anderson Cancer Center genehmigt und entspricht den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Der schematische Arbeitsablauf mit allen Schritten ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Vorbereitung der Zellen
ANMERKUNG: Die MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+)-Zelllinie, die in Dr. Woodwards Labor24 erzeugt wurde, wurde stabil mit einem Luciferase-grün fluoreszierenden Protein (Luc-GFP)-Plasmid transduziert.
<ol><li>Kulturtransduzierte Zellen in Hams F-12-Medien wurden mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 1 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Insulin und 1 % Antibiotikum-Antimitotikum ergänzt.</li>
	<li>MDA-IBC3-Luc-GFP-Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem T-75-Kolben bis zum Konflutieren aufplatten. Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bevor die Zellen konfluierend genug sind, um zu passieren.</li>
	<li>Entnehmen Sie die Zellen, indem Sie Medien entfernen, jeden Kolben mit 10 ml 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) waschen und 2 ml 0,25%ige Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzufügen. 3-5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.</li>
	<li>Geben Sie 5 ml des vollständigen Mediums in den Kolben, um die Zellen zu sammeln, und überführen Sie den gesamten Inhalt in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen (optimiert auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, abhängig von der Gesamtzahl der benötigten Zellen). Zentrifugieren Sie bei 290 x g für 5 min zu Pelletzellen. HINWEIS: Das vollständige Medium besteht aus Hams F-12-Medium, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 1 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Insulin und 1 % Antibiotikum-Antimitotikum ergänzt wird.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie dann die Zellen mit 10 ml 1x DPBS. Bei 290 x g 5 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren und den Überstand vorsichtig zu entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml frischem 1x DPBS und mischen Sie sie gut, indem Sie sie auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Um Einzelzellsuspensionen herzustellen, filtrieren Sie die Zellen durch sterile 40-μm-Zellsiebe.</li>
	<li>Berechnen Sie die Zelldichte mithilfe eines automatisierten Zellzählers. HINWEIS: Um Fehler bei der Zählung zu reduzieren, erstellen Sie verschiedene Zellverdünnungen und zählen Sie sie separat und berechnen Sie den Durchschnittswert, um die Konzentration der Zellen (Anzahl der Zellen/ml) zu bestimmen.<ol><li>Sammeln Sie 2 μl Zellsuspension + 8 μl 1x DPBS, um eine 1:5-Verdünnungsprobe herzustellen.</li>
		<li>Sammeln Sie 1 μl Zellsuspension + 9 μl 1x DPBS, um eine Verdünnungsprobe im Verhältnis 1:10 herzustellen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 μl 0,4%ige Trypanblaufärbung hinzu. Mischen Sie die Probenmischung gut, indem Sie sie einige Male auf und ab pipettieren.</li>
		<li>Pipettieren Sie vorsichtig 10 μl der Probe in den halbmondförmigen Probenladebereich der Objektträger der Zählkammer. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Inneren befinden. Warten Sie 30 Sekunden, damit sich die Zellen in der Kammer absetzen können, bevor Sie zählen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen mit 1x DPBS auf eine Dichte von 5 x 105 oder 1 x 106 Zellen pro 100 μl. Überführen Sie die Zellsuspension in 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Injektion in die Schwanzvene. Legen Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
</ol>2. Injektion der Schwanzvene
<ol><li>Verwenden Sie 4 bis 6 Wochen alte weibliche athymische SCID/Beige Mäuse.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 30-G-Spritze vor, um 100 μl Zellsuspension zu entnehmen. Entfernen Sie alle Luftblasen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in eine Nagetierhalterung (Durchmesser ca. 1 Zoll), um die Injektion in die Schwanzvene zu erleichtern und Verletzungen durch Bewegung während des Injektionsvorgangs zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie Alkoholwattepads (aus 70% Ethanol), um den Schwanz der Maus 3-4 Mal sanft abzuwischen und halten Sie ihn 5-10 Sekunden lang, um die Schwanzvene deutlicher sichtbar zu machen.</li>
	<li>Führen Sie die Spritze in einem Winkel von 15-30° in den Schwanz der Maus ein. Schieben Sie die Zellsuspension langsam in die Schwanzvene.</li>
	<li>Entfernen Sie die Spritze vorsichtig und halten Sie den Schwanz einige Sekunden lang mit dem Wattepad fest, um Blutungen zu stoppen.</li>
	<li>Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige zurück und kontrollieren Sie sie 2-4 Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass keine unerwünschten Wirkungen auftreten.</li>
</ol>3. Bewertung der Belastung durch Hirnmetastasen
<ol><li>Verdünnte D-Luciferin-Lösung herstellen. HINWEIS: Die Stammkonzentration beträgt 47,6 mM (15,15 mg/ml) und die Konzentration für den Gebrauch beträgt 1,515 mg/ml.<ol><li>Geben Sie 5 ml 1x DPBS in die D-Luciferin-Flasche.</li>
		<li>Geben Sie 2,5 ml der Lösung in jedes der beiden konischen 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Geben Sie weitere 5 ml 1x DPBS in die D-Luciferin-Flasche, um sie erneut zu spülen. Geben Sie 2,5 ml in jedes konische 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Geben Sie weitere 5 ml 1x DPBS in die Flasche und spülen Sie sie erneut aus. Wiederholen Sie den Spülvorgang zweimal.</li>
		<li>Geben Sie 1x DPBS in jedes 50-ml-Röhrchen zu insgesamt 66 ml (ca. 33 ml pro Röhrchen). In jedem Röhrchen sollten sich etwa 33 ml der Lösung befinden.</li>
		<li>Mischen Sie die Röhrchen gut und kombinieren Sie dann beide in einer sterilen Filtereinheit (150 mL PES-Filter 0,45 μm).</li>
		<li>Filtrieren Sie die Lösung und aliquotieren Sie die filtrierte Lösung dann in sterile bernsteinfarbene 1,7-ml-Mikroröhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachweis von Hirnmetastasen durch Luciferase-Bildgebung.<ol><li>Ttauen Sie D-Luciferin auf, indem Sie es auf Eis und Wirbel halten, bevor Sie es in die Mäuse injizieren.</li>
		<li>Reinigen Sie den Injektionsbereich mit Alkoholwattepads und injizieren Sie 100 μl D-Luciferin pro Maus intraperitoneal mit einer 0,5-ml-Insulinspritze, eine Spritze für jeden Käfig.</li>
		<li>Nach 10 Minuten betäuben Sie die Mäuse 5 Minuten lang mit Isofluran (2 % O 2 -2,5 % Isofluran) mit dem an die Kleintierinduktionskammer angeschlossenen Veterinärverdampfer.</li>
		<li>Schalten Sie das In-vivo-Bildgebungssystem ein. Während die Mäuse aus dem ersten Käfig unter Narkose sind, injizieren Sie den Mäusen im nächsten Käfig das D-Luciferin.</li>
		<li>Setzen Sie Mäuse in das In-vivo-Bildgebungssystem ein und erhalten Sie ventrale und dorsale Bilder. Wählen Sie eine Belichtungszeit von 2 Minuten und wählen Sie in der Feldansicht die Option E (ganzer Körper). Drücken Sie auf Acquire. Speichern Sie als Nächstes das Bild (Abbildung 2). HINWEIS: Wenn das Bild eine Sättigung der Lumineszenz aufweist, reduzieren Sie die Belichtungszeit.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachweis von Hirnmetastasen mittels GFP-Bildgebung.<ol><li>Vorbereitung des Hirngewebes.<ol><li>Etwa 8-10 Wochen nach der Injektion von Zellen oder wenn die Mäuse aufgrund von Hirnmetastasen moribund sind, euthanasieren Sie die Mäuse durch Inhalation einer Isofluran-Überdosis, gefolgt von einer Zervixluxation, in Übereinstimmung mit den von der IACUC genehmigten Protokollen.</li>
			<li>Nach der Euthanasie mit Isofluran und anschließender Zervixluxation besprühen Sie die Mäuse mit einer 70%igen Ethanollösung und entfernen Sie das Fell mit einer Schere vom Kopfbereich und den Ohren. Als nächstes machst du einen Schnitt im Halsbereich des Halses (achte darauf, dass du die Maus nicht enthauptest). Schneide den Schädel ab und ziehe ihn heraus. Als nächstes entfernst du vorsichtig das Gehirn.</li>
			<li>Legen Sie die gesammelten Gehirne in Gewebekassetten.</li>
			<li>Die Kassetten in einen Behälter mit kaltem 1x DPBS umfüllen. HINWEIS: Gehirnproben sollten nicht länger als 1 h in 1x DPBS aufbewahrt werden. Wenn mehrere Gehirnproben gleichzeitig entnommen werden sollen, sollten nur wenige Mäuse auf einmal eingeschläfert werden (10 pro Runde).</li>
		</ol></li>
		<li>Stereomikroskopische Bildgebung.<ol><li>Übertragen Sie das gesamte Gehirn auf einen 100 cm langen Deckel einer Taschentuchschale.</li>
			<li>Schalten Sie das Stereomikroskop und das UV-Licht an Position 3 mit Linse 0,5x ein, um die Visualisierung des gesamten Gehirns zu ermöglichen, wie in Abbildung 3A (rotes Quadrat) gezeigt.</li>
			<li>Drücken Sie auf Live-Ansicht (Abbildung 3A, grünes Quadrat).</li>
			<li>Fokussieren Sie den Blick, während sich das Gehirn in der ventralen Position befindet.</li>
			<li>Wählen Sie GFP (wenn Zellen GFP-markiert sind) oder TXRED (wenn Zellen RFP-markiert sind) (Abbildung 3A, gelbes Quadrat) in der Software, wählen Sie den richtigen Filter am Mikroskop aus und nehmen Sie ein Bild auf. HINWEIS: Halten Sie die SOLA-Lichtquelleneinstellung bei ca. 30 %; Wenn der GFP zu hell ist, reduzieren Sie, bis das richtige Signal beobachtet wird.</li>
			<li>Schalten Sie das helle Licht ein, ohne die Probe zu bewegen, und wählen Sie BF (Abbildung 3A, gelbes Quadrat). Machen Sie ein Foto.</li>
			<li>Wiederholen Sie die vorherigen Schritte mit dem Gehirn in dorsaler Position. HINWEIS: Je nach Größe kann die gleiche GFP-positive Hirnmetastasenläsion sowohl in ventraler als auch in dorsaler Position auftreten. Vermeiden Sie in einem solchen Fall eine doppelte Quantifizierung derselben Läsion. Speichern Sie die Bilder mit einer TIFF-Erweiterung (die alle Informationen in der Bilddatei beibehält).</li>
			<li>Speichern Sie die Bilder mit einer TIFF-Erweiterung (die alle Informationen in der Bilddatei beibehält).</li>
			<li>Wiederholen Sie die Schritte für alle Proben.</li>
			<li>Konvertieren Sie die TIFF-Bilder in JPEG, so dass die Dateien mit jedem Computer geöffnet werden können, auf dem die zugehörige Software nicht installiert ist (Datei | Importieren/Exportieren | Dateien konvertieren).</li>
			<li>Um das fluoreszierende Bild mit dem Hellfeldbild zusammenzuführen, öffnen Sie beide Bilder und gehen Sie zu Datei | Kanäle zusammenführen. Wählen Sie die richtigen Komponenten aus, grün für GFP und Hellfeld für BF, und drücken Sie OK. Speichern Sie das zusammengeführte Bild.</li>
			<li>Um die Fläche des Hirntumors zu quantifizieren, verwenden Sie das Fluoreszenzbild. Wählen Sie Messen | Manuelles Messen | Bereich. Wählen Sie die automatische Auswahl (Abbildung 3B, grünes Quadrat), bewegen Sie den Pfeil in den GFP-positiven Bereich und klicken Sie, um automatisch eine Auswahl zu erstellen. Klicken Sie erneut, um die Auswahl zu bestätigen, und dann werden alle Messungen angezeigt (Abbildung 3B, rotes Quadrat). Wenn mehr als ein GFP-positiver Bereich vorhanden ist, wiederholen Sie den Vorgang.</li>
		</ol></li>
		<li>Nachdem Gehirnbilder aufgenommen wurden, fahren Sie mit routinemäßigen Gewebefixierungsprotokollen unter Verwendung von 10% neutralem gepuffertem Formalin fort.<ol><li>Sobald die Gehirne fixiert sind, fahren Sie mit der histologischen Standardschnittung fort, gefolgt von Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, um das Vorhandensein von Hirnmetastasen zu bestätigen, und immunhistochemischer Färbung, um ausgewählte Marker nachzuweisen. HINWEIS: Die Immunzytochemie wurde im Pathology Core Laboratory am UT MD Anderson Cancer Center durchgeführt, das über ein standardisiertes Protokoll für die immunhistochemische Färbung bekannter Marker verfügt.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Das Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die Zellen sollten nicht länger als 1 Stunde auf Eis gelegt werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Alkoholwattepads sollten verwendet werden, um die Schwänze der Mäuse vor der Injektion abzuwischen, wobei darauf zu achten ist, dass nicht zu stark oder zu oft abgewischt wird, um die Schwanzhaut nicht zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Zellsuspension vorhanden sind, um zu verhindern, dass Mäuse an Blutgefäßembolien sterben. Halten Sie den ...

Hirnmetastasen sind eine häufige und tödliche Komplikation systemischer Malignome. Die meisten Hirnmetastasen haben ihren Ursprung in Primärtumoren der Lunge, der Brust oder der Haut, die zusammen 67-80% der Fälle ausmachen 1,2. Die Schätzungen der Häufigkeit von Hirnmetastasen schwanken zwischen 100.000 und 240.000 Fällen, und diese Zahlen könnten unterschätzt sein, da eine Autopsie bei Patienten, die an metastasierendem Krebs gestorben sind, selten ist3. Patienten mit Hirnmetastasen haben eine schlechtere Prognose und ein geringeres Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten ohne Hirnmetastasen4. Die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten für Hirnmetastasen sind weitgehend palliativ und können die Überlebenschancen der meisten Patienten nicht verbessern5. Daher bleibt die Hirnmetastasierung eine Herausforderung, und es bleibt dringend, die Mechanismen des Fortschreitens von Hirnmetastasen besser zu verstehen, um wirksamere Therapien zu entwickeln.
Die Verwendung experimenteller Modelle lieferte wichtige Einblicke in spezifische Mechanismen der Metastasierung von Brustkrebs in das Gehirn und ermöglichte die Bewertung der Wirksamkeit verschiedener Therapieansätze 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Allerdings gibt es nur sehr wenige Modelle, die die Feinheiten der Entwicklung von Hirnmetastasen genau und vollständig rekapitulieren können. Mehrere experimentelle In-vivo-Modelle wurden durch Inokulation von Krebszellen in Mäuse auf verschiedenen Verabreichungswegen erzeugt, einschließlich orthotoper, Schwanzvenen-, intrakardialer, intrakardialer Arterien- und intrazerebraler Injektionen. Jede Technik hat Vor- und Nachteile, wie an anderer Stelle erläutert3. Keines dieser Mausmodelle kann jedoch den klinischen Verlauf der Hirnmetastasierung vollständig nachbilden.
Hirnmetastasen treten besonders häufig bei Patientinnen mit entzündlichem Brustkrebs (IBC) auf, einer seltenen, aber aggressiven Variante des primären Brustkrebses. IBC macht 1 % bis 4 % der Brustkrebsfälle aus, ist aber für unverhältnismäßig hohe 10 % der brustkrebsbedingten Todesfälle in den Vereinigten Staaten verantwortlich17,18. Es ist bekannt, dass IBC schnell metastasiert; Tatsächlich hat ein Drittel der IBC-Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose Fernmetastasen19,20. Spezifisch für Hirnmetastasen haben Patienten mit IBC eine höhere Inzidenz von Hirnmetastasen als Patienten mit Nicht-IBC21. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die MDA-IBC3-Zelllinie, die aus der malignen Pleuraergussflüssigkeit eines Patienten mit ER-/PR-/HER2+-IBC gewonnen wird, die IBC-Eigenschaften in Maus-Xenotransplantaten rekapituliert, eine erhöhte Neigung zur Entwicklung von Hirnmetastasen anstelle von Lungenmetastasen bei Mäusen aufweist, wenn sie über eine Schwanzvene injiziert wird, was diese Zelllinie zu einem guten Modell für die Untersuchung der Entwicklung von Hirnmetastasen macht16.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Verfahren zur Erzeugung von Hirnmetastasen durch Schwanzveneninjektion von MDA-IBC3-Zellen und zur Bewertung der Metastasenbelastung mittels Stereofluoreszenzmikroskopie und Luciferase-Bildgebung. Diese Methode wurde verwendet, um Schlüsselmediatoren der Metastasierung von Brustkrebs im Gehirn zu entdecken und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu testen 16,22,23. Der Nachteil dieser Technik ist, dass sie nicht alle Schritte des Metastasierungsprozesses des Gehirns rekapituliert. Zu den Hauptvorteilen gehören jedoch die Robustheit und Reproduzierbarkeit, die Einbeziehung der relevanten Metastasenbiologie der Intravasation, die Durchquerung der Lunge und die Extravasation in das Gehirn sowie die relative Einfachheit in Bezug auf die Technik.

<table><tbody><tr><td>Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 & Mikro; L Pipettenspitze filtriert</td><td>Genesee Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische Pipetten</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>1%</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15 mL Bulk</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-Glutamin</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centufuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GIBICO Inc. USA</td><td>16000044</td><td>10%</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp; Sterile Zellsiebe (40 &mu; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td>5 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MDA-IBC3-Zelllinien</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Erzeugt von Dr. Woodwards Labor24</td></tr><tr><td>Luciferase&ndash; grün fluoreszierendes Protein (Luc&ndash; GFP) Plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroröhrchen klar steril 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 & micro; L Reach Barrier Tip, geringe Bindung, im Rack, steril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TC-behandelte Kolben (T75), 250 ml, Vent</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauer Farbstoff (0,4 %) zur Verwendung mit dem Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td><stark>Schwanzveneninjektion</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige</td><td>Envigo</td><td>SCID/beige Mäuse</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulinspritze mit der BD Ultra-Fine Needle 0,5mL 30Gx1/2" (12,7mm)BD</td><td></td> <td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs &nbsp; Broome-Style Nagetier-Rückhaltesysteme</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Bestellen Sie beiThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolLieferantenvielfalt Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70 % gebraucht</td></tr><tr><td><stark>Bildgebung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Niedrige Dosis&nbsp; U-100 Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-PES-Filtereinheiten 0,45 &Mikro; m</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>FB12566501 Filtersystem zur Sterilisation von D-Luciferin</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L8220-1g</td><td>Stammkonzentration = 47,6 mM (15,15 mg/ml); Einsatzkonzentration = 1,515 mg/ml</td></tr><tr><td>1,7 mL Mikroröhrchen bernsteinfarben</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC-14043-704-06</td><td>Flüssiges Anästhetikum zur Verwendung in Anästhesieverdampfern</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp;</td><td>PerkinElmer-Gerät</td><td></td><td>für die Luziferase-Bildgebung, bis zu 5 Mäuse gleichzeitig bildgebend, mit Anästhesiegerät</td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter mit Deckel&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekassetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Alkoholaufbereitung</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Bildgebung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop AZ100&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Modell AZ-STGE</td><td>Software NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formalin 10%</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC behandelte Schalen 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung der hirnmetastasierung durch injektion von entzündlichen brustkrebszellen in die schwanzvene

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Die Metastasierung im Gehirn ist eine häufige und verheerende Manifestation vieler Krebsarten. Allein in den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr etwa 200.000 Patienten mit Hirnmetastasen diagnostiziert. Bei der Verbesserung der Überlebenschancen von Patientinnen mit primärem Brustkrebs und systemischen Malignomen wurden erhebliche Fortschritte erzielt. Die düstere Prognose für Patienten mit klinischen Hirnmetastasen unterstreicht jedoch die dringende Notwendigkeit, neue Therapeutika und Strategien gegen diese tödliche Krankheit zu entwickeln. Der Mangel an geeigneten experimentellen Modellen war eine der größten Hürden, die den Fortschritt unseres Verständnisses der Biologie und Behandlung von Hirnmetastasen behinderten. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Xenotransplantat-Mausmodell der Hirnmetastase, das durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten Zelllinie aus entzündlichem Brustkrebs (IBC), einer seltenen und aggressiven Form von Brustkrebs, erzeugt wird. Die Zellen wurden mit Glühwürmchen-Luciferase und grünem Fluoreszenzprotein markiert, um die Hirnmetastasierung zu überwachen, und die Metastasenbelastung durch Biolumineszenz-Bildgebung, Fluoreszenzstereomikroskopie und histologische Auswertung quantifiziert. Mäuse entwickeln robust und konsistent Hirnmetastasen, was die Untersuchung von Schlüsselmediatoren im Metastasierungsprozess und die Entwicklung präklinischer Tests neuer Behandlungsstrategien ermöglicht.

Mit der Begründung, dass markierte Zellen die Überwachung und Visualisierung von Hirnmetastasen in präklinischen Mausmodellen erleichtern, markierten wir MDA-IBC3-Zellen mit Luc und mit GFP, um Hirnmetastasen zu überwachen und die Metastasenbelastung mit Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung und Fluoreszenzstereomikroskopie zu quantifizieren. Die Injektion der markierten MDA-IBC3-Zellen in die Schwanzvenen von immungeschwächten SCID/Beige-Mäusen führte zu einem hohen Prozentsatz von Mäusen, die Hirnmetastasen entwickelten ...

Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Wir haben die Schwanzvenenmethode verwendet, um Hirnmetastasen in Mausmodellen zu erzeugen, indem wir Zelllinien von Patientinnen mit entzündlichem Brustkrebs (IBC), einer hochaggressiven Form von primärem Brustkrebs, verwendet haben. Die Erzeugung von Hirnmetastasen in Mausmodellen erfolgt typischerweise durch intrakardiale oder intracarotis-arterielle Injektionen. Die Schwanzvenenmethode bietet jedoch einen Vorteil gegenüber diesen Techniken, da sie die Schritte der Besiedlung von Hirnmetastasen besser nachahmt und relativ einfach durchzuführen ist.Die Ärzte Xiaoding Hu und Emilly Villodre, die beide Ausbilder in meinem Labor sind, werden das Verfahren demonstrieren. Um Hirnmetastasen mittels GFP-Bildgebung acht bis 10 Wochen nach der Tumorzellinjektion nachzuweisen, desinfizieren Sie die Maus mit 70%igem Ethanol und entfernen Sie das Fell von Kopf und Ohren. Schneiden Sie den zervikalen Bereich des Halses ab.Schneiden Sie den Schädel heraus und entfernen Sie ihn, damit das Gehirn entnommen werden kann. Legen Sie das Gehirn in eine Gewebekassette und legen Sie die Kassette für nicht länger als eine Stunde in einen Behälter mit kaltem DPBS. Für die stereomikroskopische Bildgebung wird das Gehirn in einen 100 Zentimeter langen Gewebeschalendeckel unter ein mit UV-Licht ausgestattetes Stereomikroskop übertragen und das 0,5-fache Objektiv gewählt, um die Visualisierung des gesamten Gehirns zu ermöglichen.Drücken Sie die Live-Ansicht und fokussieren Sie die Ansicht, während sich das Gehirn in der ventralen Position befindet. Wählen Sie in der Software und im Mikroskop den entsprechenden Filter für den fluoreszierenden Marker in den Zellen aus und machen Sie ein Bild. Wechseln Sie, ohne die Probe zu verschieben, zur Hellfeld-Bildgebung und wählen Sie den Hellfeldfilter aus.Machen Sie ein Foto. Stellen Sie sich dann das Gehirn in der dorsalen Position vor, wie zuvor gezeigt. Um die Bilder des gesamten Gehirns zu analysieren, konvertieren Sie zunächst die Bilddateien von TIFF in JPEG, damit sie mit jedem Computer geöffnet werden können, der nicht über die zugehörige Software verfügt.Öffnen Sie als Nächstes ein Paar Hellfeld- und Fluoreszenzbilder und wählen Sie Datei- und Zusammenführungskanäle aus. Wählen Sie die richtigen Komponenten aus, klicken Sie auf OK und speichern Sie das zusammengeführte Bild. Um den Hirntumorbereich im Fluoreszenzbild zu quantifizieren, wählen Sie die automatische Auswahl.Verschieben Sie den Pfeil in den GFP-Positionsbereich und klicken Sie, um automatisch eine Auswahl zu erstellen. Klicken Sie dann erneut, um die Auswahl zu bestätigen. Alle Maße werden angezeigt.Wenn mehr als ein GFP-positiver Bereich beobachtet werden kann, wiederholen Sie die Messung mit dem nachfolgenden Bereich. Hirnmetastasen können bereits acht Wochen nach der Injektion mittels Luciferase-Bildgebung und Stereofluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden. Nach der Bildgebung können Teile der Hirnmetastasen formalinfixiert und für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung aufbereitet werden, um das Vorhandensein von Hirnmetastasenläsionen zu validieren, und für die immunhistochemische Färbung, um spezifische Proteinmarker von Interesse nachzuweisen.Bei der Anwendung dieses Protokolls ist es wichtig, die Lebensfähigkeit der Zellen aufrechtzuerhalten, indem die Zellen nicht länger als eine Stunde auf Eis gelegt werden, und Luftblasen in der Zellsuspension zu vermeiden, um die Bildung von Embolien und die Sterblichkeit von Mäusen zu verhindern. Nach der Injektion der Schwanzvene überwachen wir das Wachstum und die Progression der Hirnmetastasen mit Luciferase-Bildgebung. Nach der Euthanasie bestätigten Stereofluoreszenzmikroskopie und Histologie Metastasenläsionen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Injektion markierter Krebszellen mittels Schwanzveneninjektion in ein Mausmodell. Darüber hinaus überwachen wir die Metastasierung und das Wachstum von Brustkrebs mit Hilfe von Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von lebenden Tieren.

Schwanzveneninjektion: Eine Methode zur Verabreichung von Krebszellen für Metastasierungsstudien in einem Mausmodell

Quelle: Lim, M., et al. Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader. J. Vis. Exp. (2022)In diesem Video wird eine anästhesierte Maus einem chirurgischen Eingriff unterzogen, bei dem Krebszellen in die Arteria carotis communis (CCA) injiziert werden, um eine gezielte Abgabe an das Gehirn zu ermöglichen. Das Verfahren beinhaltet ein präzises Nähen und Manipulieren der Halsschlagadern, um die injizierten Zellen in Richtung der Arteria carotis...

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Es wurde ein chirurgisches Verfahren entwickelt, um Brusttumorzellen über eine Pfortaderinjektion in die Mausleber zu bringen. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung der späten Stadien der Lebermetastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt, einschließlich der Extravasation von Tumorzellen, der Aussaat, des Überlebens und des Metastasierungsauswuchses in der Leber.

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Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

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Die intravenöse Injektion von Krebszellen wird häufig in der Metastasenforschung eingesetzt, aber die metastasierende Tumorbelastung kann schwer zu analysieren sein. Hierin demonstrieren wir ein Schwanzvenen-Injektionsmodell der Metastasierung und beinhalten einen neuartigen Ansatz zur Analyse der resultierenden metastasierenden Lungentumorbelastung.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Die modellierung der intrakraniellen Hirnmetastasen wird durch die Unfähigkeit erschwert, die Tumorgröße und die Reaktion auf die Behandlung mit präzisen und zeitnahen Methoden zu überwachen. Die vorgestellte Methodik koppelt die intrakranielle Tumorinjektion mit einer Magnetresonanztomographie-Analyse, die in Kombination präzise und konsistente Injektionen, eine verbesserte Tierüberwachung und genaue Tumorvolumenmessungen kultiviert.

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