Name: Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie die Massenaufzucht und Markierung steriler männlicher Aedes aegypti für die sterile Insektentechnik. Diese effiziente Methode ermöglicht kleinen Bekämpfungsprogrammen den Einsatz in integrierten Vektorkontrollstrategien.

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Wir danken Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls und V. Aryaprema vom Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine, Florida, für die Partnerschaft bei der Entwicklung des SIT-Programms und Expertenwissen über die effektive operative Freisetzung steriler männlicher Aedes aegypti. Diese Forschung wurde vom USDA-ARS und dem Florida Department of Agriculture and Consumer Services (FDACS) unterstützt. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich dem Zweck der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch USDA oder FDACS.

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Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte angegeben.

Die Initiierung eines Kontrollprogramms mit SIT, das Strahlung verwendet, erfordert die Etablierung eines lokalen Stammes von Aedes aegypti. Dieser Schritt ist entscheidend und kann es SIT ermöglichen, sich wirklich von ähnlichen Steuerungstechnologien abzuheben. Durch die Entwicklung des Projekts aus einem lokalen Moskitostamm werden die erzeugten Männchen wahrscheinlich Verhaltensweisen haben, die es ihnen ermöglichen, sich an Umweltveränderungen und Hinweise anzupassen und wilde Weibchen in der Nähe zu lokalisieren und sich mit ihnen zu paaren. Darüber hinaus darf die Freisetzung bestrahlter lokaler Männchen keine negative öffentliche Meinung hervorrufen, verglichen mit beispielsweise der Freisetzung eines nicht-lokalen Stammes genetisch veränderter Moskitos, die beispielsweise neue Allele in die lokale Mückenpopulation einführen könnten.
Erhebliche Ressourcen aufzuwenden, um große Mengen von Moskitos zu züchten, nur um etwa die Hälfte von ihnen für Kontrollzwecke verwenden zu können, ist eine Einschränkung des Aedes aegypti SIT-Programms. Das Aufzuchtprotokoll sollte verfeinert werden, um die Reifung der Larven in definiertere Zeiträume zu verdichten, in denen die Puppen bereit sind. Dies würde es ermöglichen, mehr Puppen zum optimalen Zeitpunkt der Trennung zu sammeln. Zusätzliche zu verarbeitende Puppen erhöhen jedoch das Risiko, dass sich mehr Weibchen verpuppen, wenn die Puppen gesammelt werden, und erhöhen daher die Wahrscheinlichkeit, dass Weibchen mit Männchen in Petrischalen landen und möglicherweise freigelassen werden. Obwohl die Lebensdauer, das Blutfütterungsverhalten und das Eiablageverhalten bei bestrahlten weiblichen Aedes aegypti-Puppen bei Erwachsenen reduziert sind, ist es keine gute Strategie, Weibchen nebenbei neben bestrahlten Männchen freizulassen22. Daher sollte es eine Priorität bleiben, die Anzahl der Weibchen zu minimieren, die versehentlich getrennt, bestrahlt, markiert und mit Männchen freigelassen werden.
Der Erfolg eines SIT-Programms hängt letztendlich von einem erfolgreichen Partnerwettbewerb durch kolonieaufgezogene, bestrahlte Männchen ab. Die Erhaltung der männlichen Wettbewerbsfähigkeit beruht auf einer umfassenden experimentell abgeleiteten Auswahl der Dosis und der Maximierung des geschätzten Verhältnisses von sterilen und wilden Männchen in der Population. Die Dosisauswahl wird durch mehrere Schlüsselfaktoren bestimmt, darunter Langlebigkeit, Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit und Puppensterblichkeit. Es wurde beobachtet, dass männliche Moskitos eine asymptotische Fruchtbarkeitskurve aufweisen, die sich mit zunehmender Strahlung Null nähert (KJL, RLA, SCB unveröffentlichte Daten). Gleichzeitig nehmen die Langlebigkeit und Aktivität der männlichen Mücken exponentiell ab, wenn die Strahlendosis zunimmt (KJL, RLA, SCB unveröffentlichte Daten). Anstatt eine Dosis zu identifizieren, die bei Männern eine Sterilität von 99,9% ergibt, ist es daher vorzuziehen, sich auf einen niedrigeren Sterilitätsprozentsatz zu konzentrieren und gleichzeitig das Überleben zu unterstützen. Sobald ein Dosisbereich ermittelt ist, der die Langlebigkeit oder Puppensterblichkeit bestrahlter Männchen nicht von der von nicht bestrahlten Männchen unterscheidet, sollten zusätzliche Bewertungen der Fertilität durchgeführt werden, um eine Dosis zu ermitteln, die Männchen überwiegend steril, aber wettbewerbsfähig macht.
Gleichzeitig ist es wichtig, die Anzahl der männlichen Moskitos in der Population mit der der freigesetzten bestrahlten Männchen zu vergleichen. Dies kann erreicht werden, indem Männchen von verschiedenen Orten in und um das Zielfreisetzungsgebiet wiederholt vom selben Ort und vor, während und nach Beginn des SIT-Programms gesammelt werden. Eine Mark-, Release-, Recapture-Studie sollte durchgeführt werden, um das Verhältnis von wilden männlichen Moskitos zu freigesetzten Moskitos zu beurteilen. Eine Mark-, Release-, Recapture-Studie beruht auf der Freisetzung einer bekannten Anzahl markierter Moskitos von einem bestimmten Punkt und deren späterem Wiederfang an Punkten in unmittelbarer Nähe des ursprünglichen Freisetzungspunktes. Durch den Vergleich der Anzahl der zurückgefangenen Männchen und wilden Männchen in Entfernungen vom Freisetzungspunkt ist es möglich, die allgemeine Wildpopulation der Männchen in dem Gebiet zu schätzen, so dass wettbewerbsfähige Verhältnisse steriler Männchen freigelassen werden können23. Die Maximierung des Verhältnisses von sterilen: wilden Männchen kann durch Freilassung sterilerer Männchen und/oder durch Reduzierung der Wildpopulation durch klassische Kontrollmittel wie Quellenreduktion, unreife Kontrolle oder Adultizidbehandlungen erreicht werden.
Um die Wirksamkeit steriler männlicher Freisetzungen zu messen, können adulte Sammlungen chronologisch mit einem nicht-interventionellen Bereich verglichen werden. Wenn sterile Männchen freigelassen werden und die Anzahl der gesammelten Männchen und Weibchen in einem Gebiet im Verhältnis zu einem vergleichbaren Nicht-Interventionsgebiet abnimmt, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass die freigesetzten sterilen Männchen die lokalen fruchtbaren Männchen erfolgreich übertreffen. Dieser Effekt kann auch in Eiablagefallenbechern beobachtet werden, die sowohl an der Interventions- als auch an der Nichtinterventionsstelle eingesetzt werden. Eier können immer noch an der Interventionsstelle produziert werden, aber wenn weniger schlüpfen als die von der Nicht-Interventionsstelle, kann angenommen werden, dass sie nicht befruchtet werden, weil sich Weibchen mit sterilen Männchen paaren. Immer mehr Eiablage von unbefruchteten Eizellen könnte schließlich zu einer verminderten Eiablage führen, da Weibchen an der Interventionsstellenicht ersetzt werden 8,24.
Zukünftige Richtungen der SIT-Technologie und -Programme erweitern sich natürlich auf weitere medizinisch wichtige Mückenarten. Zum Beispiel kann diese Technologie leicht angepasst werden, um Aedes albopictus zu kontrollieren, angesichts der sehr ähnlichen Bionomik von Aedes aegypti und Aedes albopictus. Andere Krankheitsüberträgermückenarten von Interesse sind Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis und verschiedene Anopheles-Arten. Die Verbesserung der Wirksamkeit dieser Technologie hängt davon ab, die Kapazität der zu einem bestimmten Zeitpunkt produzierten männlichen Puppen zu erhöhen, was durch genetische Manipulation oder künstliche Selektion erreicht werden könnte, und die männliche Wettbewerbsfähigkeit zu verbessern, die durch Erhöhung der Männlichkeit, Fruchtbarkeit oder Langlebigkeit erreicht werden könnte.
Letztendlich sind SIT-Programme keine Wunderwaffe zur Bekämpfung von Moskitos. Sie sind stattdessen ein Werkzeug in einer Reihe anderer Kontrolltechniken, wie z. B. IVM-Programme, die Schwächen zwischen Techniken ausgleichen. Während beispielsweise die chemische Bekämpfung eine schnelle und kostengünstige Bekämpfung bietet, fördert sie auch die Entwicklung von Resistenzen und Nichtzielmortalität. und während SIT artspezifisch ist und wahrscheinlich keine Resistenz erzeugt, müssen SIT-Männchen auf Dauer produziert und freigelassen werden, um einwandernde Populationen von außerhalb des Vektorkontrollbezirks zu kontrollieren.

Die Übertragung von durch Moskitos übertragenen Krankheitserregern auf den Menschen verursacht jedes Jahr weltweit Millionen von Krankheitsfällen und Todesfällen. In Ermangelung wirksamer, zugelassener Impfstoffe für durch Moskitos übertragene Krankheiten wie Zika oder Dengue-Fieber besteht eine der wirksamsten Möglichkeiten, die Übertragung zu reduzieren, darin, die Populationen von Krankheitsvektormücken zu reduzieren. Ärgerlich ist, dass immer mehr Mückenarten, die traditionell von Pestiziden bekämpft werden, eine zunehmende Pestizidresistenz aufweisen1. Gleichzeitig haben Regierungsbehörden zuvor zugelassene Pestizide aggressiv abgemeldet oder verboten, und es werden nur wenige neue, wirksame chemische Kontrollmaßnahmen entwickelt 2,3. Diese Konstellation von Hindernissen für die Mückenbekämpfung hat die Erforschung alternativer nicht-chemischer Techniken zur Reduzierung von Moskitopopulationen motiviert.
Bestimmte Mückenarten stellen eine Herausforderung dar, um Fragen der Resistenz und Pestizidregistrierung zu kontrollieren. Aedes aegypti (L.) ist eine prominente Krankheitsvektormücke, die aufgrund des kryptischen perihäuslichen Lebensraums, der von dieser Art für unreife Entwicklung und adultes Ruhen genutzt wird, extrem schwierig durch traditionelles integriertes Vektormanagement zu kontrollieren ist 4,5. Zu den Herausforderungen im Zusammenhang mit der Nutzung des kryptischen Lebensraums um Wohnhäuser gehören die Schwierigkeit, diese Orte mit Pestizidsprühtechniken zu erreichen, sowie die potenzielle mangelnde Akzeptanz der Öffentlichkeit für den wiederholten Zugang zu Privateigentum für Vektorkontrollbehörden der öffentlichen Gesundheit, um die intensiven Überwachungs- und Kontrollaktivitäten durchzuführen, die für ein effektives integriertes Vektormanagement (IVM) für diese Art entscheidend sind.
Glücklicherweise wird SIT, ein Ansatz, der sich für die dauerhafte Bekämpfung anderer sehr anspruchsvoller Insektenarten6 als erfolgreich erwiesen hat, in einer bahnbrechenden Reihe von Experimenten und Betriebsversuchen in St. Augustine, Florida, auf das Aedes aegypti-Problem angewendet (KJL, RLA, SCB unveröffentlichte Daten). SIT wurde auf eine Reihe von Insektenarten, einschließlich Moskitos, angewendet und in der Tiefeüberprüft 7,8. SIT nutzt die Massenfreisetzung von paaraufgezogenen Männchen, die beispielsweise durch ionisierende Strahlung oder Chemikalien sterilisiert wurden, um die Partnerwahl natürlicher Populationen von Weibchen zu überwältigen. Sterilisierte Männchen, die sich mit wilden Weibchen paaren, machen die Eier aufgrund von Schäden an männlichen Gameten unfruchtbar und können, wenn sie in ausreichender Anzahl vorhanden sind, theoretisch die natürliche Aedes aegypti-Population zum Absturz bringen.
Ein SIT-Programm wurde initiiert, um zu versuchen, die Populationen von Aedes aegypti in einem städtischen Gebiet an der Atlantikküste Floridas zu reduzieren, wo diese Art kürzlich wieder besiedelt wurde und sich ausbreitet und ein Risiko für die öffentliche Gesundheit für die Übertragung von Viren wie Zika, Dengue oder Chikungunya darstellt. Um das Potenzial für die Kompatibilität mit wilden Weibchen zu maximieren, wurde eine neue Kolonie mit wild gefangenen Aedes aegypti aus der Zielpopulation gegründet, um Männchen für das Programm9 zu produzieren. Dies basierte auf der Hypothese, dass lokal abgeleitete, kolonieaufgezogene Männchen eher mit lokalen wilden Männchen um die Paarung mit lokalen wilden Weibchen konkurrieren würden. Damit die SIT wirksam ist, muss nicht nur eine überwältigende Anzahl steriler Männchen im Zielgebiet anwesend sein, sondern sie müssen auch in der Lage sein, lokale wilde weibliche Moskitos effektiv zu umwerben und sich mit ihnen zu paaren.
Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die optimale Anzahl steriler Männchen zu bestimmen (KJL, RLA, SCB unveröffentlichte Daten) sowie optimale Strahlendosen, die die Männchen unfruchtbar machen würden, ohne das Überleben, das Verhalten oder die Akzeptanz durch wilde Weibchen zu beeinträchtigen (KJL, RLA, SCB unveröffentlichte Daten). Diese Daten werden in verwandten Publikationen dieser Gruppe veröffentlicht, aber einige dieser Ergebnisse sind auch in diesem Protokoll erfasst und könnten als Ausgangspunkt für neue SIT Aedes aegypti-Kontrollprogramme anderswo verwendet werden. Diese Art erweitert ständig ihr Verbreitungsgebiet, und SIT-Programme sind vielversprechend, um kostengünstige, langfristige Lösungen zur Kontrolle dieser Population zu sein. Das Ziel dieses Protokolls ist es, sterilisierte, männliche, kolonieaufgezogene Aedes aegypti-Mücken für die systematische Freisetzung in Außenbereiche herzustellen, um die natürlichen Fortpflanzungszyklen lokaler Aedes aegypti-Populationen in einem operationellen Programm zur Kontrolle von Vektoren im Bereich der öffentlichen Gesundheit zu stören.
Während ähnliche Protokolle und Arbeitsabläufe für die Produktion transgener Aedes aegypti-Männchen veröffentlicht wurden und Produktionsabläufe für Aedes SIT oder Wolbachia-basierte Inkompatibilitätsprogramme an anderer Stelle veröffentlicht wurden, veranschaulicht dieses Protokoll, wie bestehende Protokolle für die Produktion, Trennung und Bestrahlung männlicher Puppen, die Kennzeichnung und Verpackung erwachsener Männchen und den Versand an die Freisetzungsstelle für dieses Programm angepasst wurden9. 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Die Markierungskomponente dieses Protokolls ist in einem ausgereiften operationellen SIT-Programm möglicherweise nicht erforderlich. Es wurde jedoch hier aufgenommen, weil es eine Möglichkeit ist, die Wirksamkeit zu überwachen und die Qualität des gesamten Prozesses in den ersten Jahren der Einrichtung des SIT-Programms zu kontrollieren. Moskitobekämpfungsprogramme werden in der Regel von lokalen Behörden durchgeführt, so dass sie in vielen Aspekten ihrer Organisation stark variieren können, von Größe und Finanzierungsbasis bis hin zur Feinabstimmung von Kontrolltaktiken, um den lokalen Erfolg zu maximieren. Daher sollte das hierin beschriebene Protokoll auf Kompatibilität mit verfügbaren Ressourcen bewertet werden.

<table><tbody><tr><td>1-1/8" Schraubenschlüssel (1" (1 Zoll) = 2,54 cm)</td><td>Craftsman</td><td>CMMT44707</td><td></td></tr><tr><td>1/2 Pint Kartonbecher (1/2 Pint = 236,5 mL)</td><td>Science Supplies WLE Corp</td><td>1/2 Pint</td><td></td></tr><tr><td>1/4" Schlauch - tygon</td><td>Hudson Extrusions</td><td>LLDPE1/8 X 1/4 BLK</td><td>zur Befestigung an CO2-Gasregler</td></tr><tr><td>1/8" Messing-Widerhaken mit MIP-Anschluss</td><td>B& K</td><td>BHB-85NLB</td><td>zum Befestigen an einem CO2-Gasregler</td></tr><tr><td>1000 mL Messbecher aus Kunststoff mit Griff</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223-1000</td><td></td></tr><tr><td>3000 mL Messbecher aus Kunststoff mit Griff</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223-3000</td><td></td></tr><tr><td>Becher aus großem Käfig für Erwachsene</td><td>Bioquip</td><td>1450D</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratorfläschchen</td><td>Bioquip</td><td>2809V</td><td></td></tr><tr><td>Rinderleberpulver</td><td>MP Biomedicals</td><td>290039601</td><td></td></tr><tr><td>Bierhefe</td><td>MP Biomericals</td><td>02903312-CF</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Regler</td><td>Randor</td><td>64003038 CO2-Tank</td><td></td></tr><tr><td>(20# Kanister)</td><td>Praxair</td><td>CDBEVCARB20</td><td></td></tr><tr><td>Auffangbecken</td><td>Treasure Gurus</td><td>KI-ENAMELBOWL</td><td>für Separator</td></tr><tr><td>Wattebällchen - groß</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Feinkostbecher mit Deckel - 470 mL</td><td>Pactiv DELItainer</td><td>PCTYSD2516</td><td></td></tr><tr><td>Feinkostbecher mit Deckel - 1900 mL</td><td>Berry Global</td><td>T60764</td><td></td></tr><tr><td>DoseReader 4</td><td></td><td></td><td>ND0.5 und ND1.0 QA-Filter Set Standards</td></tr><tr><td>Dosimetriefolie</td><td>Far West Technology, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Millipore</td><td>AP10045S0</td><td></td></tr><tr><td>Taschenlampenaspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809D</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette - feine Feder</td><td>Bioquip</td><td>4748 oder 4750</td><td>federleichte</td></tr><tr><td>GAFchrome</td><td></td><td></td><td>radiochrome Folie</td></tr><tr><td>Gammator M</td><td>Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ</td><td></td><td>Cäsium-137 Bestrahlung</td></tr><tr><td>Mechanischer Handsauger</td><td>Clarke Mosquito</td><td>13500</td><td></td></tr><tr><td>Lammfellkondome</td><td>Trojan</td><td>Naturalamb</td><td></td></tr><tr><td>Große CO2-Kammer</td><td>Sterilite</td><td>Walmart #&nbsp; </td><td></td>568789514</tr><tr><td>Larvenaufzuchtpfannen</td><td>Blue Ridge Thermoforming</td><td>&nbsp; 01-FG-400-3N-ABS</td><td>Abmessungen: 22,375 x 17,5 x 3 (Zoll)</td></tr><tr><td>Magnete - 20# Zug</td><td>Master Magnetics</td><td>MHHH20BX</td><td></td></tr><tr><td>Markierungsfarbe</td><td>Dayglo</td><td>ECO-11</td><td>Aurora Pink</td></tr><tr><td>Markierungsfarbe</td><td>Dayglo</td><td>ECO-17</td><td>Saturn</td></tr><tr><td>Yellow Mesh</td><td>Falk</td><td></td><td>T301</td></tr><tr><td>Weidepipetten</td><td>Thermo Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen - groß</td><td>VWR International</td><td>25384-090 CS</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen - klein (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Brand</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Puppenseparator</td><td>J.W. Hock</td><td>1512</td><td></td></tr><tr><td>Roter Gummischlauch</td><td>Welch</td><td>331040-5</td><td></td></tr><tr><td>Freigabebehälter</td><td>Science Supplies WLE corp</td><td>1 Gallone</td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder - Kreuz #19</td><td>Alliance</td><td>ALL37196</td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder - Breitengrad #64</td><td>Skillcraft</td><td>NSN0589974</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Ohaus</td><td>H-4737</td><td></td></tr><tr><td>Saatgutkeimpapier - Schwerer Lagerbestand 76#</td><td>Ankerpapier</td><td>#76</td><td></td></tr><tr><td>Versandkühler - 16 x 13 x 12,5"</td><td>MrBoxonline.com</td><td>Husky Schaumstoffkühler Kit</td><td></td></tr><tr><td>Sieb #20</td><td>Advantech</td><td>20BS8F</td><td></td></tr><tr><td>Sieb #30</td><td>Advantech</td><td>30BS8F</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Käfig - Bug Dorm</td><td>MegaView</td><td>Bug Dorm-1</td><td></td></tr><tr><td>Kleine CO2-Kammer</td><td>Mainstays</td><td>Walmart #&nbsp; </td><td></td>562922221</tr><tr><td>Soufflebecher Deckel</td><td>SOLO</td><td>41165277456</td><td></td></tr><tr><td>Soufflebecher - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)</td><td>SOLO</td><td>41165024104</td><td></td></tr><tr><td>Sponge</td><td>ocelo</td><td>MMM7274FD</td><td></td></tr><tr><td>Squeeze</td><td>bottle Dynalon</td><td>3UUP6</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Meiji Techno</td><td>EMZ-5</td><td></td></tr><tr><td>Stockinette</td><td>BSN Medical</td><td>30-1006</td><td></td></tr><tr><td>Extrudierter Polystyrolschaum</td> <td>aus Styropor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tropisches Fischflockenfutter</td><td>Tetra</td><td>4,52 Pfund</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkammer - Exsikkator</td><td>BelArt</td><td>T9FB892757</td><td></td></tr><tr><td>Wägeschiffchen</td><td>Globe Scientific</td><td>3621</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher aedes aegypti-moskitos für die freisetzung in einem operationellen sterilen insektentechnikprogramm

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

Die Bekämpfung menschlicher Krankheiten wie Dengue-Fieber, Zika und Chikungunya beruht auf der Kontrolle ihres Vektors, der Aedes aegypti-Mücke , da es keine Prävention gibt. Die Bekämpfung von Moskitovektoren kann sich auf Chemikalien stützen, die auf die unreifen und erwachsenen Stadien angewendet werden, was zur Mortalität von Nichtzielen beitragen und vor allem zu Insektizidresistenzen im Vektor führen kann. Die sterile Insektentechnik (SIT) ist eine Methode zur Kontrolle von Schädlingspopulationen durch die Freisetzung sterilisierter erwachsener Männchen, die sich mit wilden Weibchen paaren, um nicht lebensfähige Nachkommen zu produzieren. Dieser Artikel beschreibt den Prozess der Herstellung steriler Männchen für die Verwendung in einem operationellen SIT-Programm zur Bekämpfung von Aedes aegypti-Moskitos . Hier sind die Schritte beschrieben, die im Programm verwendet werden, einschließlich der Aufzucht und Pflege einer Kolonie, der Trennung männlicher und weiblicher Puppen, der Bestrahlung und Markierung erwachsener Männchen und des Versands von Aedes aegypti-Männchen an die Freisetzungsstelle. Diskutiert werden auch verfahrenstechnische Vorbehalte, Programmbeschränkungen und zukünftige Ziele.

Eine wachsame und angemessene Mückenaufzucht besteht aus einer ausgewogenen Verfügbarkeit von Männchen und Weibchen in Koloniekäfigen, der Aufrechterhaltung von frischer Saccharoselösung und Honig sowie einer gleichbleibend hochwertigen Blutfütterung. Diese Bedingungen sorgen für dicht gepackte Eierblätter, die optimal für die Verwendung in SIT-Larvenaufzuchtpfannen geeignet sind. Die richtige Lagerung und Verwendung von getrockneten Eierblättern, wie z. B. eine systematische Etikettierung, um die Verwendung vom ältesten zum neuesten zu erleichtern, unterstützt ein gleichmäßiges Schlüpfen in allen Pfannen. Das Befüllen aller Larvenaufzuchtpfannen mit Wasser vor dem Schlüpfen kann die Zeit, für die sich die Eierblätter in den Schlupfbehältern befinden, verkürzen und eine gesunde Entwicklung fördern. Die Pflege der Larvenpfannen vom Schlüpfen bis zur Verpuppung erfordert ein sorgfältiges Engagement des Koloniepersonals, da einige Pfannen je nach Entwicklungsstadien und Umweltvariablen mehr oder weniger Nahrung oder zusätzliches Wasser benötigen. Wenn es Probleme mit dem Entwicklungsstadium bis zum geplanten Tag der Puppengeschlechtstrennung gibt, sollten Anpassungen früher im Prozess vorgenommen werden, z. B. früher oder später schlüpfen, Nahrung anpassen oder die Temperatur des Inkubators ändern.
Der Aufzuchtprozess in diesem Protokoll führt nicht dazu, dass alle Eier rechtzeitig geschlüpft sind, um sich zu Puppen zu entwickeln, die bestrahlt und zu Kontrollzwecken verwendet werden können. Zwischen 20 und 50% der in der Kolonie aufgezogenen Moskitos sind immer noch Larven, wenn die Puppen getrennt werden müssen. Diese Larven werden jedoch nicht verschwendet, sondern 24 h reifen gelassen, um zusätzliche Puppen zu bilden, die mit weiblichen Puppen aus der Trennung des Vortages kombiniert und wieder in Koloniekäfige recycelt werden können. In den Koloniekäfigen dürfen Puppen zu Erwachsenen heranreifen, sich paaren, Blut ernähren und Eier produzieren, die das SIT-Projekt unterstützen.
Das Trennen von Puppen, das Eingießen von Puppen in Petrischale, die Bestrahlung und die Unterbringung in erwachsene Käfige nach der Bestrahlung müssen an einem Tag erfolgen; Daher sollte ausreichend Zeit eingeplant werden, um alle Schritte komfortabel zu bearbeiten. Die Montage und Vorbereitung von Freigabebehältern sollte vor dem Markierungsprozess erfolgen. Wenn Versandkartons von der Freigabestelle zurückgegeben werden, sollten Freigabebehälter inspiziert und für ihre nächste Verwendung vorbereitet werden. Das Entsorgen nasser Wattebällchen, das Auslüften von Nasstrennbehältern, das Reinigen von Petrischale, das Ersetzen von Netzen und das Entfernen von elastischen Bändern aus dem Behälter, während sie nicht verwendet werden, verlängern die Lebensdauer der Freisetzungsbehälter erheblich.
Angesichts der weltweiten Realität der COVID-19-Viruspandemie wurde dieses Protokoll, bei dem es sich in der Regel um eine Mehrpersonenoperation handelt, so modifiziert, dass für jeden Schritt eine Person allein in einem Labor arbeiten kann. Die Schritte im Prozess, die am meisten durch ein Ein-Personen-Szenario behindert werden, sind die Geschlechts-, Markierungs-, Wiege- und Kolonieaufzucht-Wartungsschritte. Die Trennung von Puppen nach Geschlecht durch eine Person sollte ausreichen, wenn mehrere Separatoren gleichzeitig in verschiedenen Räumen arbeiten. In einer Pandemiesituation, in der soziale Distanzierung am Arbeitsplatz stattfindet, ist die Ausrüstung mehrerer Stationen erforderlich, um Schritte vom Geschlecht bis zum Packen durchzuführen. Abhängig von der Geschwindigkeit des Bedieners dauert eine Person ~ 4 Stunden, um 15.000 Moskitos zu sexen, und dann weitere 1-2 Stunden, um sie zu markieren, zu wiegen und zu verpacken. Ein Zwei-Personen-Szenario verringert die Zeit, in der Moskitos zur Markierung betäubt werden, und reduziert die Gesamtarbeitszeit. Doch selbst in einem Zwei-Personen-Szenario kann die Zuteilung der vollen 2,0 g Moskitos pro Freisetzungskäfig aufgrund der begrenzten Arbeitszeit während der Sedierung der Moskitos schwierig sein. Obwohl der Prozess der Reinigung und Aufbereitung von Larven- und adultem Aufzuchtmaterial extrem zeit- und arbeitsintensiv ist, kann er so unterteilt werden, dass einzelne Bediener während einer Pandemie unabhängig und sicher arbeiten können.
Die Freilassung adulter, markierter, bestrahlter Aedes aegypti-Männchen liegt außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls, wird hier jedoch kurz vorgestellt. Der Prozess der Freisetzung markierter, bestrahlter, männlicher Mücken beginnt mit der Bestimmung einer gleichmäßigen Freisetzungsverteilung der Freisetzungsbehälter auf der Grundlage von Gewichten (und damit abgeleiteter Anzahl steriler Männchen), wie in Tabelle 3 berichtet. Nachdem die Sendungen an den Vektorkontrollbezirk geliefert wurden, werden die Boxen geöffnet und die Freisetzungsbehälter auf Probleme mit der Sterblichkeit oder dem Zustand der Freisetzungsbehälter untersucht. Moskitos in den Freisetzungsbehältern können sich dann 1-2 h lang an Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit gewöhnen, bevor sie in den Behandlungsbereich transportiert werden. Freisetzungsstellen im Behandlungsgebiet werden nach intensiver Überwachung auf Hot Spots wilder Populationen von Aedes aegypti identifiziert. Der Zeitpunkt, die Häufigkeit und die Dichte der Freisetzungen werden durch die Bionomik der Art sowie durch Meteorologie, öffentliche Unterstützung und Laboraufzuchtfähigkeiten ausgeglichen.
Da bestimmte Freisetzungsbehälter auf bestimmte Freisetzungsstellen abgestimmt sind, muss das Etikett vor dem Öffnen des Freisetzungsbehälters durch Schneiden des Netzes auf der Oberseite überprüft werden, so dass der Bediener das Netz verformen kann, so dass ein Teil der Männchen entweichen kann. Diese fraktionierte Freisetzungsmethode wird an jedem zugewiesenen Freigabepunkt für den Behälter wiederholt, bis alle frei fliegenden Männchen freigelassen wurden. Dieser Vorgang wird dann für jeden Freigabecontainer an seinem jeweils zugewiesenen Freigabeort wiederholt, bis alle Container verarbeitet wurden. Optional können nach der Freisetzung der Moskitos alle toten oder behinderten Moskitos, die nicht frei gegangen sind, in Petrischalen gesammelt und beschriftet werden, um von Hand gezählt oder gewogen zu werden, um die geschätzte Anzahl freigesetzt zu korrigieren. Eine laufende und umfassende Überwachung von adulten, eiförmigen und unreifen Stadien von wilden Aedes aegypti im Zielgebiet und möglicherweise an Kontrollstellen ohne Intervention wird durchgeführt, um die Wirksamkeit der SIT-Operation zu bewerten.

Die sterile Insektentechnik (SIT) wird verwendet, um spezifische, medizinisch wichtige Moskitopopulationen zu kontrollieren, die gegen chemische Kontrollen resistent sein können. Hier beschreiben wir eine Methode der Massenaufzucht und Vorbereitung steriler männlicher Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen SIT-Programm, das auf die Aedes aegypti-Mücke abzielt.

Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Der einzigartige Wert dieses Protokolls besteht darin, dass zwei Mitarbeiter, die leicht verfügbare Geräte in kleinen Laborräumen verwenden, genügend sterile Malmücken produzieren können, um ein 50 Hektar großes operatives SIT-Programm zu unterstützen. Die Effizienz und die niedrigen Kosten dieser Technik machen es zugänglich, hartnäckig auch für kleine Moskitokontrollbezirke, um ihr integriertes Vektorkontrollprogramm zu erweitern. Das Verfahren demonstrieren ich und Barbara Bayer, biowissenschaftliche Laboranten aus der Forschungsabteilung.Um erwachsene Aedes aegypti aus Puppen zu züchten, bereiten Sie 60 x 60 mal 60 Zentimeter große zusammenklappbare Aluminium-Aufzuchtkäfige mit 0,84 x 0,84 Millimeter Lochgröße Glasfasergitter und einer Stockinette-Hülle an einer vertikalen Wand jedes Käfigs vor. Stellen Sie einen 1.900-Milliliter-Plastikbecher mit Aedes aegypti-Puppen im Verhältnis eins zu eins in jeden Aufzuchtkäfig und binden Sie den Ärmel zu, wobei die Becher in Käfigen für etwa vier Tage bei 28 bis 30 Grad Celsius mehr als 50% relativer Luftfeuchtigkeit in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 oder 14:10 Uhr stehen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchen. 24 Stunden nachdem Sie die Puppen in die Aufzuchtkäfige gelegt haben, legen Sie einen Behälter mit 10% iger Saccharoselösung mit einem Schwammdocht in jeden Käfig und hängen Sie einen in Honig getränkten 10 x 2 Zentimeter großen Schwamm an einem Drahthaken auf, um den erwachsenen Moskitos Feuchtigkeit und Nahrung zu geben.48 bis 72 Stunden, nachdem die meisten Erwachsenen in den nächsten drei bis vier Wochen alle zwei bis drei Tage aufgetaucht sind, füllen Sie das eine Lammfellkondom mit 50 bis 100 Milliliter defibriniertem Rinderblut pro Käfig und erwärmen Sie die Kondome in einem heißen Wasserbad auf etwa 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Kondome vorsichtig mit dem Handtuch abgeklopft haben, legen Sie die teilweise getrockneten Kondome für 30 bis 60 Minuten in einzelne mit Papier ausgelegte Petrischalen in die Käfige. Stellen Sie 48 bis 72 Stunden nach jeder Blutfütterung einen 1.900 Milliliter Eiablagebecher mit 800 Milliliter gefiltertem Puppenwasser und versehen mit einem 8 bis 10 mal 30 Zentimeter großen Blatt Samenkeimpapier, das bündig entlang des inneren Umfangs des Bechers in jeden Käfig passt.Um die Aedes aegypti-Larven aus Eiern zu züchten, verwenden Sie ein Eiablagepapier mit 5.000 bis 10.000 vorhandenen Eiern und schneiden Sie einen drei bis sieben Zentimeter langen Abschnitt senkrecht zur Eiablagelinie. Legen Sie das Stück in einen neuen 460-Milliliter-Behälter, der zur Hälfte mit Leitungswasser und einer Prise pulverisierter Fischfutterflocken gefüllt ist. Decken Sie den Behälter mindestens eine Minute lang ab und rühren Sie ihn kräftig, bevor Sie den gesamten Inhalt in eine Larvenaufzuchtschale gießen, die drei Liter Leitungswasser und 50 Milliliter braune Gülle enthält.Markieren Sie die Pfanne mit dem Startdatum, den Stamminformationen und dem Fütterungsplan. Sobald der ungefähre Schwellenanteil der Larven in den Larvenpfannen erreicht ist, gießen Sie den Inhalt jeder Pfanne durch ein Sieb der Größe 20 bis 40 und waschen Sie die Puppen und Larven mit einer Quetschflasche Leitungswasser aus dem Sieb in ein drei Liter abgestuftes Plastikbecherglas. Um die männlichen Puppen von den Larven und weiblichen Puppen zu trennen, teilen Sie den Inhalt jedes Becherglases auf mehrere 1,9-Liter-Kunststoffbehälter auf und stellen Sie einen starren, flachen Vier-Liter-Sammelbehälter unter die Schleuse am Boden eines Puppenseparators.Füllen Sie zwei drei Liter abgestufte Kunststoffbecher etwa zu drei Vierteln mit Leitungswasser und gießen Sie das Wasser durch den Raum zwischen den Glasplatten des Separators, während Sie die oberen und unteren Knöpfe so einstellen, dass das Wasser kontinuierlich durch den Separator fließen kann. Sobald stehendes Wasser gleichmäßig in etwa 1,25 Zentimeter Höhe von der Basis der Platten gesammelt hat, markieren Sie die Startpositionen an den unteren Knöpfen des Separators mit Klebeband und beginnen Sie, die Behälter von Puppen und Larven in den Separator zu gießen, während die unteren Knöpfe kontinuierlich gegen den Uhrzeigersinn ein bis zwei Zentimeter von den Startpositionen entfernt gedreht werden. Wenn die meisten oder alle Larven durch die Schleuse in den Auffangbehälter gespült wurden, unterbrechen Sie den Wasserfluss und verwenden Sie ein Sieb der Nummer 30, um den Auffangbehälter von den Larven zu befreien.Wenn alle Larven entfernt wurden, gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe erneut ein, damit die männlichen Puppen in den Sammelbehälter gespült werden können. Dann gießen Sie die männlichen Puppen aus dem Behälter in ein Sieb Nummer 20 und verwenden Sie eine Ein-Liter-Quetschflasche mit Leitungswasser, um die Puppen aus dem Sieb in einen separaten 1,9-Liter-Behälter zu waschen. Wenn alle männlichen Puppen gesammelt wurden, gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe so ein, dass die weiblichen Puppen gesammelt werden können.Mit dem Sieb Nummer 20 werden die weiblichen Puppen in einen neuen 1,9-Liter-Behälter überführt, wie gerade demonstriert. Dann gießen Sie das Wasser und stellen Sie die Knöpfe wieder ein, bis alle unreifen Moskitos aus dem Separator gespült wurden. Die gesammelten männlichen Puppen mit einem Sieb abseihen und den Kot mit möglichst wenig Wasser in ein Ein-Liter-Messglas waschen.Gießen Sie die Puppen vorsichtig in Petrischale, die mit feuchtem Filterpapier in einer einzigen Schicht ausgekleidet sind. Entfernen Sie stehendes Wasser vom Petrischalenboden mit einer frischen Drei-Milliliter-Weidepipette, um Puppenbewegungen während der Arbeit zu verhindern. Bündeln Sie Petrischalen und Stapel, bevor Sie sie in einem beschrifteten 3,8-Liter-wiederverschließbaren Beutel versiegeln, der in die Bestrahlungskammer passt.Um quantifizierte Chargen von erwachsenen bestrahlten männlichen Moskitos zu markieren, entfernen Sie alle Nahrungsquellen aus dem Aufzuchtkäfig und legen Sie einen Käfig für fünf bis sieben Minuten in eine große Kohlendioxidkammer, wobei Sie die Seiten des Behälters klopfen, um alle an den Wänden haftenden Moskitos zu entfernen. Am Ende der Expositionszeit die Moskitos in ein Aspirator-Fläschchen geben und die Moskitos erneut betäuben, bevor Sie die Moskitos in eine mit weißem Papier bedeckte Arbeitsfläche schütteln. Alle Männchen vorsichtig von der Arbeitsfläche in eine neue Durchstechflasche absaugen und die Belichtung und Entnahme wiederholen, bis alle erwachsenen Männchen aus allen Aufzuchtkäfigen entnommen wurden.Generieren Sie irgendwann während des Geschlechtssortierprozesses eine Durchstechflasche mit nur 25 erwachsenen männlichen Moskitos. Wenn alle Männchen gesammelt wurden, wiegen Sie jede abscheuliche Moskitos in einem getarnten Wiegeboot auf einer Waage und gießen Sie die gewogenen Moskitos schnell in einen 240-Milliliter-Kartonbehälter, der 50 Milligramm einen Markierungsfarbstoff enthält. Neigen und drehen Sie den Behälter eine volle Umdrehung im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, bis alle Moskitos leicht beschichtet sind, und gießen Sie die Moskitos in ein neues Wiegeboot, dann falten Sie das Wiegeboot in zwei Hälften, damit die Moskitos durch die Stockinette-Hülle in den Freisetzungsbehälter geleitet werden können.Wenn ungefähr zwei Gramm männliche Moskitos in den Freisetzungsbehälter gegeben wurden, binden Sie die Stockinette-Hülle zu und markieren Sie das Etikettierband auf der Lünette des Freisetzungsbehälters mit der Farbfarbe, der Behälternummer und dem Gesamtgewicht der Moskitos. In diesem repräsentativen männlichen erwachsenen Aedes aegypti-Mückenaufzucht-, Bestrahlungs- und Marketingexperiment konnten zwei Gramm männliche erwachsene Moskitos aus drei Aufzuchtkäfigen und zusammen mit zwei Fläschchen mit 25 Männchen aus zwei Käfigen gesammelt werden, um das durchschnittliche Gewicht pro Mücke berechnen zu können. Insgesamt wurden 25 Weibchen aus zwei der Chargen weggeworfen.Eine rechtzeitige und beobachtende Fütterung während der Woche der Larvenaufzucht ist entscheidend für die Erzeugung gut entwickelter Puppen für die Trennung. Dies erzeugt eine klare Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen, was zu einem geringen Vorkommen von Weibchen in den Markierungsschritten führt. Neben der Verwendung in operationellen SIT-Programmen können diese sterilen Männchen auch ausgiebig in Experimenten verwendet werden, die den Paarungswettbewerb, das Überleben und die Verbreitung von bestrahlten im Vergleich zu wilden, nicht bestrahlten Männchen untersuchen.Die Modifikation der Technik auf weibliche Mücken ermöglicht es uns, die Auswirkungen der unbeabsichtigten Freisetzung bestrahlter Weibchen im Hinblick auf Fruchtbarkeit und Vektorkompetenz zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigt Nijole Jasinskiene der angewandten Methode, um transgene Aedes aegypti Mücken, die Überträger für Dengue-Fieber sind zu generieren. Die Techniken für die richtige Vorbereitung Mikroinjektion Nadeln, Entfeuchtungsmittel Embryonen, und die Durchführung der Mikroinjektion werden aufgezeigt.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.

Massenproduktion von gentechnisch veränderten Aedes aegypti für Feldfreisetzungen in Brasilien

Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infiziert werden in natürlichen Populationen zu unterdrücken, die Übertragung von Arboviren freigesetzt. Wir beschreiben Methoden nach hinten Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen im Labor für Experimente und Feld Freigabe, Vorsichtsmaßnahmen zum Labor Anpassung und Auswahl zu minimieren.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Die Wirksamkeit der Volksgesundheit Pestizide targeting Ärgernis und Krankheit-Vektor Insekten ist nicht einheitlich in verschiedenen ökologischen Zonen. Hier präsentieren wir ein System von Techniken, die mit Gefangenen Insekten als Wächter für Pestizid Wirksamkeit abzuleiten elektronische Karten der Standardauswertung von Pestiziden über mehrere Umgebungen hinweg zu unterstützen.

Wirksamkeit von Pestiziden gegen Krankheit Vektor Mücken im Bereich Visualisierung

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Beschrieben wird eine zeit- und platzsparende Methode zur Zählung von Eiern und zur Bestimmung der Brutraten einzelner Mücken anhand von 24 Brunnengewebekulturplatten, die den Umfang und die Geschwindigkeit von Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests erheblich erhöhen können.

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Ein Protokoll zur Kultur des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis. Der Parasit wird von einer Generation von Aedes aegypti-Mücken zur nächsten durch horizontale Übertragung im Larvenstadium geleitet, gefolgt von vertikaler Übertragung im Erwachsenenstadium. Lebende Sporoplasmen überleben langfristig in infizierten Eiern.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.

Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos

Die hier berichteten Protokolle veranschaulichen drei alternative Möglichkeiten, die Leistung von gentechnisch veränderten Moskitos zu bewerten, die für die Vektorkontrolle in laboreigenen Kleinkäfigversuchen bestimmt sind. Jedes Protokoll ist auf die spezifische Modifikation des Mückenstamms (Gene Drive oder Non-Gene Drive) und die Art der gemessenen Parameter zugeschnitten.

Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie gängige Lebensparameterdaten bei Aedes aegypti-Mücken gemessen werden, einschließlich Fruchtbarkeit, Flügelgröße, Fertilität, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit adulter Mücken. Diese Messungen können verwendet werden, um die Fitness transgener Stechmücken zu beurteilen.

Quantifizierung der Fitnesskosten bei transgenen Aedes aegypti-Mücken

Lernen Sie die Massenaufzucht und Markierung steriler männlicher Aedes aegypti für die sterile Insektentechnik. Diese effiziente Methode ermöglicht kleinen Bekämpfungsprogrammen den Einsatz in integrierten Vektorkontrollstrategien.

Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm

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