Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Scipion bietet die Werkzeuge, um den gesamten Verarbeitungsablauf auf integrative Weise für eine einzelne Partikelanalyse in Kryo-EM zu erstellen, um eine hochauflösende Rekonstruktion der biologischen Probe zu erreichen. Dieses Framework ermöglicht es, den Verarbeitungsworkflow mit mehreren Bildverarbeitungspaketen zu erstellen, was Interoperabilität, Rückverfolgbarkeit, Reproduzierbarkeit und die Kombination von Informationen, die durch verschiedene Methoden übertragen werden, zu einer genaueren Ausgabe begünstigt. Scipion wächst ständig, einschließlich neuer Methoden und Verpackungen.

Darüber hinaus wurde es um Kryo-Elektronentomographie und Atommodellierung erweitert, so dass auch Workflows zur Verarbeitung dieser Daten erstellt werden können. Um ein Projekt in Scipion zu erstellen, klicken Sie auf Projekt erstellen, um das Projekt zu erstellen. Um die Mikroskopfilme zu importieren, wählen Sie Filme importieren aus.

Ein neues Fenster wird angezeigt. Geben Sie in diesem Fenster den Pfad zu den Daten ein und stellen Sie die Mikroskopspannung auf 300 Kilovolt, die sphärische Aberration auf zwei Millimeter, den Amplitudenkontrast auf 0,1, die Vergrößerungsrate auf 50.000, den Abtastratenmodus auf Vom Bild und die Pixelgröße auf 1,34 Angström. Wenn alle Parameter festgelegt sind, klicken Sie auf Ausführen.

Wenn die Methode abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Zusammenfassung und klicken Sie auf Ergebnisse analysieren. Es erscheint ein neues Fenster mit einer Liste der von der Methode generierten Ausgaben. Um die optische Flussmethode für die Filmausrichtung auszuführen, öffnen Sie die optische Ausrichtungsmethode xmipp3, wählen Sie die importierten Filme als Eingabefilme aus, und legen Sie den Bereich Frames auf ALIGN von 2 bis 13 fest.

Legen Sie unter Zusätzliche Parameter die Option Vorherige Filmausrichtung auf SUM-Frames verwenden auf Nein fest.Lassen Sie alle anderen Optionen auf ihre Standardwerte festgelegt, und führen Sie das Programm aus. Klicken Sie auf Ergebnisse analysieren, um die erhaltenen Mikroaufnahmen und die Trajektorie der geschätzten Verschiebungen zu überprüfen. Für jede Mikroaufnahme ist es möglich, die spektrale Leistungsdichte, die erhaltenen Trajektorien, um den Film sowohl in der kartesischen als auch in der Polarkoordinate auszurichten, und den Dateinamen der erhaltenen Mikroaufnahme zu überprüfen.

Beachten Sie, dass die Partikel der Probe in der Mikroaufnahme im Vergleich zu einem einzelnen Bild des Films viel besser sichtbar sind. Öffnen Sie für die Partikelkommissionierung die manuelle Kommissioniermethode xmipp3 und wählen Sie die zuvor erhaltenen Mikroaufnahmen als Eingangsmikrogramme aus. Klicken Sie auf Ausführen.

Ein neues interaktives Fenster wird angezeigt. Ändern Sie in diesem Fenster die Pixelgröße auf 150. Die ausgewählte Mikroaufnahme wird in einem größeren Fenster angezeigt.

Wählen Sie alle sichtbaren Partikel in einem Bereich aus. Wenn alle Partikel manuell ausgewählt wurden, klicken Sie auf Training aktivieren, um das Lernen zu starten. Die verbleibenden Bereiche der Mikroaufnahme werden automatisch ausgewählt.

Überprüfen Sie die ausgewählten Partikel. Um ein zusätzliches Partikel einzuschließen, klicken Sie auf ein Partikel von Interesse. Um falsche Partikel zu entfernen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt, und klicken Sie bei Bedarf auf die Partikel.

Wenn alle Partikel automatisch ausgewählt wurden, wählen Sie die nächsten vier Mikroaufnahmen nacheinander aus, um ein repräsentatives Trainingsset zu erstellen. Die Partikel in jeder ausgewählten Mikroaufnahme werden automatisch ausgewählt, wobei jede Mikroaufnahme überprüft wird, um Partikel nach Bedarf einzuschließen oder zu entfernen. Wenn ein Trainingssatz erfasst wurde, klicken Sie auf Koordinaten, um die Koordinaten aller ausgewählten Partikel zu speichern.

Öffnen Sie nach dem Erwerb des Trainingssatzes die automatische xmipp3-Kommissionierung, um die vorherige manuelle Kommissionierung im Xmipp-Partikelkommissionierlauf anzuzeigen, und stellen Sie die Mikrographen auf "Wie überwacht" ein. Klicken Sie auf Ausführen, um einen Satz von etwa 100.000 Koordinaten zu generieren. Um den Konsensansatz anzuwenden, öffnen Sie das Sphire-Kryolo-Picking und legen Sie die vorverarbeiteten Mikrographen als Eingabemikrographen im Kommissioniermodell auf den Standardwert fest.

Legen Sie den Konfidenzwert auf 0,3 und die Feldgröße auf 150 fest, und klicken Sie dann auf Ausführen. Die Methode sollte auch etwa 100.000 Koordinaten generieren. Öffnen Sie als Nächstes das xmipp3 Deep Consensus Picking und legen Sie die Eingabekoordinaten so fest, dass sie die Ausgabe der automatischen Sphire-Kryolo- und xmipp3-Kommissionierung, den vortrainierten Modelltyp auswählen und die Option Training überspringen und direkt mit vortrainiertem Modell überspringen auf Ja einschließen, und klicken Sie dann auf Ausführen.

Klicken Sie am Ende der Ausführung auf Ergebnisse analysieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf das Augensymbol. Es öffnet sich ein zweites neues Fenster mit einer Liste aller Partikel.

Die Z-Score-Werte in der Spalte geben Einblick in die Qualität jedes Partikels, da ein niedriger Wert auf eine schlechte Qualität hinweist. Um die Partikel vom höchsten zum niedrigsten Z-Score zu ordnen, klicken Sie auf Xmipp Z-score deep learning und wählen Sie die Partikel mit einem Z-Score höher als 0,75 aus. Klicken Sie dann auf Koordinaten, um eine neue Teilmenge mit ca. 50.000 Koordinaten zu erstellen.

Um die Auflösung lokal zu berechnen, öffnen Sie xmipp3 local MonoRes und stellen Sie die Eingangslautstärke auf den Ausgang des letzten Verfeinerungsschritts, der Halblautstärke auf Ja und den Auflösungsbereich von 1 bis 10 Angström. Wenn die Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf Ausführen. Wenn die Auflösung berechnet wurde, klicken Sie auf Ergebnisse analysieren und wählen Sie Auflösungshistogramm anzeigen und Farbige Segmente anzeigen aus.

Die Auflösung in den verschiedenen Teilen des Volumens wird angezeigt. Die meisten Voxelle der zentralen Teile der Strukturen sollten Auflösungen um drei Angström darstellen, während die schlechtesten Auflösungen in den äußeren Regionen der Strukturen beobachtet werden. Ein Histogramm der Auflösungen pro Voxel mit einem Peak um oder unter drei Angström wird ebenfalls gezeigt.

Um eine Schärfung anzuwenden, öffnen Sie die xmipp3 localdeblur-Schärfung, wählen Sie die Ausgabe des letzten Verfeinerungsschritts als Eingabezuordnung aus, und legen Sie die Auflösungszuordnung auf die erhaltene MonoRes-Zuordnung fest. Nachdem der Befehl ausgeführt wurde, doppelklicken Sie auf der Registerkarte Zusammenfassung auf den Satz von Volumes, die als Ausgabe generiert wurden. Die in jeder Iteration generierten Volumes können überprüft werden.

Es wird auch empfohlen, das Volume mit anderen Tools wie UCSF Chimera zu öffnen, um die Eigenschaften des Volumes in 3D besser beobachten zu können. In dieser Abbildung kann eine Fourier-Schalenkorrelation von drei Angströmen beobachtet werden, die sehr nahe an der Nyquist-Grenze liegt. Wie abgebildet, weisen die rekonstruierten 3D-Volumenscheiben einen hohen Detaillierungsgrad und klar definierte Strukturen auf.

Nach lokaler Analyse erreichen die meisten Zentralvoxel eine Auflösung unter drei Angströmen. Die äußeren Bereiche der lokalen Auflösungsscheiben weisen jedoch eine niedrigere Auflösung auf, die mit der in diesen Bereichen beobachteten Unschärfe übereinstimmt. Nach der Nachbearbeitung können die höheren Frequenzen des 3D-Kartenvolumens beobachtet werden, wodurch mehr Details aufgedeckt und die Darstellung verbessert werden.

Wenn die erreichte Auflösung hoch genug ist, können sogar einige der biochemischen Teile der Struktur beobachtet werden. Wenn die erhaltene Struktur eine niedrige Auflösung hat und nicht in der Lage ist, sich zu einer besseren zu entwickeln, kann ein verschwommenes Volumen mit einer niedrigen Fourier-Schalenkorrelation, Einer Auflösungskurve und einem Histogramm der lokalen Schätzung beobachtet werden. Nach der Kommissionierung kann die 2D-Klassifizierung überprüft werden, um die Partikelqualität zu bewerten.

In dieser Klassifizierung sind die Partikel beispielsweise verrauscht, unzentriert oder gekoppelt, was darauf hinweist, dass die Kommissionierung falsch war. Ein weiterer Checkpoint kann während der anfänglichen Volumenschätzung durchgeführt werden. In diesem Beispiel wurde eine fehlerhafte Schätzung mit einer falschen Einstellung für die Methode erstellt.

Sobald eine 3D-Karte mit einer ausreichenden Auflösung erstellt wurde, besteht der nächste Schritt darin, ein atomares Modell für die Karte vorzuschlagen. Dies kann innerhalb von Scipion mit den Modellierungs-Plugins erfolgen. Diese Technik kann verwendet werden, um biologische Makromoleküle zur Bewertung ihrer molekularen Wechselwirkungen und biologischen Ensemblefunktion als Grundlage für das Wirkstoffdesign erfolgreich zu rekonstruieren.