NMR-basiertes Fragment-Screening mit minimaler Probe, aber maximalem Automatisierungsmodus

Wir führen Kernspinresonanzuntersuchungen durch. So können wir die Strukturen von Proteinen, RNA und DNA in Lösung bestimmen. Diese Biomoleküle sind die Bestandteile, sind die Bestandteile unserer Zellen, und unsere Protokolle, die wir hier vorstellen, befassen sich mit dem Screening kleiner Moleküle und ihrer Bindung an diese Ziele.

Aus diesen Molekülen können unsere medizinische Chemie und Strukturbiologie neue Medikamente gegen Krankheiten ableiten. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass wir die volle Kontrolle über die Qualität der molekularen Ziele, wie z.B. der Proteine, haben, und wir haben die volle Kontrolle über die Qualität der niedermolekularen Fragmente und Medikamente, und wir können auch Proteine auf die Bindung eines breiten Spektrums von Affinitäten untersuchen, was im Vergleich zu anderen Methoden ein Vorteil ist. Um Siebproben für die NMR-Messung vorzubereiten, verwenden Sie einen Probenvorbereitungsroboter, um 768 Verbindungen auf acht 96-Well-Platten zu verteilen, um 64 Mischungen mit 12 Fragmenten bis zu einer Endkonzentration von 4,2 Millimolar pro Mischung zu erhalten.

Übertragen Sie das zu untersuchende biomolekulare Zielmolekül, das in einem geeigneten Screening-Puffer verdünnt ist, in die entsprechende Anzahl von Barcode-Drei-Millimeter-NMR-Hochdurchsatz-Probenwechslöhrchen, und verwenden Sie den Roboter, um 10 Mikroliter jeder Ligandenmischung in jedes Röhrchen des Zielbiomoleküls zu übertragen. Lassen Sie den Roboter dann die Lösungen gründlich mischen. Für die NMR-Erfassung wird die Probe in das Spektrometer geladen.

Öffnen Sie die Spektrometer-Software und wählen Sie dann den Parametersatz und die Pulssequenzen für ligandenbasierte Experimente aus. Wählen Sie für alle aufgeführten Experimente die Anregungsformung als Wasserunterdrückung aus. Wählen Sie für das Fluor-19-Screening sowohl 1D- als auch T2-Experimente aus.

Wählen Sie die spektrale Breite auf 220 Teile pro Million, die Anregungsfrequenz auf 140 Teile pro Million und die Analysezeit zwischen einer und fünf Stunden. Für T2 sollte die CPMG-Zeit zwischen 5 und 100 Millisekunden liegen. Zeichnen Sie die T1r- und T2-Experimente auf.

Zeichnen Sie die Sättigungsübertragungsdifferenz als Pseudo-2D auf. Um die beiden einzelnen 1D-Spektren zu verarbeiten, verwenden Sie die Funktion ProcStd des AU-Programms, mit oder ohne die Relax-Option. Der WaterLOGSY ist ein einzelner 1D, der mit einem negativen Signal für das Lösungsmittelsignal phasengesteuert werden sollte.

Um die Wasserstoff-Screening-Daten zu analysieren, befolgen Sie die Anweisungen für das fragmentbasierte Screening-Tool, um die biomolekularen Magnetresonanz-NMR-Daten aus Screening-Kampagnen zu speichern, so dass jedes Screening-Gemisch sein eigenes Verzeichnis hat, in dem ein Unterverzeichnis die verschiedenen an der Probe gemessenen Experimente enthält. Speichern Sie die Referenzspektren, wobei alle Daten aus den Proben ohne das biomolekulare Ziel, aber mit den Mischungen und der einzelnen Verbindung in verschiedenen Verzeichnissen gespeichert sind. Erstellen Sie einen direkten Pfad zu dem Verzeichnis, das die erfassten Daten enthält, und wählen Sie das NMR-Verzeichnis aus, in dem alle Gemische ein eigenes Verzeichnis haben sollen.

Stellen Sie sicher, dass die CSV-, Fragment-, XML-Dokument- und BAC-Dateien auch in das NMR-Verzeichnis der Daten kopiert werden. Um das fragmentbasierte Raster für eine gerasterte Probe zu verwenden, ziehen Sie das Symbol für das fragmentbasierte Raster in die Mitte des Analysefensters. Das Symbol sollte angezeigt werden, wenn die zuvor gespeicherten Datensätze in das Symbol kopiert wurden.

Das Fenster mit den Optionen für das fragmentbasierte Screening sollte automatisch geöffnet werden. Wählen Sie eine CSV-Cocktaildatei aus, die die Namen der Mixe, die Namen der einzelnen Fragmente und die Aufteilung jedes Fragments in die Mixe enthält. Definieren Sie einen Referenz-Ligandenspektrenordner mit allen gemessenen Spektren der einzelnen Fragmente und definieren Sie einen Referenz-Blanko-Experimentordner, der in der Regel die Datensätze der Mischungen ohne das untersuchte Target enthält.

Um die untersuchten Spektren und Spektrendarstellungsfarben zu definieren, öffnen Sie den Reiter Spektrentypen und stellen Sie den Spezifikationstyp entsprechend den Prozessdaten ein. Definieren Sie auf der Registerkarte Anzeigelayout die Spektren, die entsprechend den Spezifikationstypen verglichen werden sollen. Klicken Sie dann auf OK, um das Projekt zu starten.

Während die Daten verarbeitet werden, öffnet sich ein separates Fenster mit der Tabelle, in der alle Cocktailmischungen und die Liganden jeder Mischung zusammengefasst sind. Doppelklicken Sie auf eine Zelle, um die entsprechenden Datensätze zu öffnen. Stellen Sie vor der Zuweisung von Bindemitteln sicher, dass die Referenzpeaks miteinander übereinstimmen und die gleiche chemische Verschiebung aufweisen.

Wenn Unterschiede festgestellt werden, öffnen Sie die Registerkarte Prozess, und verwenden Sie die Option serielle Verarbeitung, um diese zu korrigieren. Für die erste Analyse der Fluor-19-Gemische öffnen Sie die Registerkarte Analysieren und wählen Sie die Funktion integrieren aus. Stellen Sie sicher, dass für jedes Fragment im Gemisch ein eindeutiger Integrationsbereich für das entsprechende Fluor-19-Signal definiert ist.

Exportintegrationsbereiche speichern, um die Integrationsdatei für die zukünftige Verwendung zu exportieren, und alle verwendeten Integrationsdateien im entsprechenden Installationsverzeichnis speichern. Öffnen Sie für Fluor-19-Daten einen Datensatz mit oder ohne das untersuchte Ziel, und klicken Sie auf der Registerkarte "Analysieren" auf "Integrationsbereiche importieren und lesen", um die entsprechende Integrationsdatei in das aktuelle Spektrum zu laden. Klicken Sie dann auf Speichern und zurück, um eine Liste der integrierten Regionen auf der Registerkarte Integrale zu suchen, und kopieren Sie diese Informationen in eine Tabelle für die nachgelagerte Analyse.

Die molekulare Struktur oder Konstitution der Liganden in der Fragmentbibliothek wird wie demonstriert mit Hilfe einer Molecular Confidence Software analysiert und die Ergebnisse werden als grafische Ausgabe dargestellt. Eine orange Farbe zeigt an, dass das Fragment eine Inkonsistenz in der Struktur oder Konzentration aufweist. Grün eingefärbte Vertiefungen zeigen an, dass das Fragment konsistent ist.

In dieser repräsentativen Analyse wurden 103 Fragmente, die eine oder mehrere Fluorgruppen aus der hauseigenen Bibliothek enthielten, in fünf Mischungen zu je 20 bis 21 Fragmenten aufgeteilt. Fluor-19-Transversalrelaxationsexperimente wurden für jedes Gemisch gemessen, das CPMG-Pulsfolgen anwendete. Schwellenwerte sind nützlich, um Bindemittel, schwache Bindemittel oder Nicht-Bindemittel in der Mischung zu definieren, wie sie in diesen typischen Thiaminprotein-Tyrosinkinase-A- und RNA-Spektren beobachtet werden.

In dieser repräsentativen Analyse zeigte der erste Treffer eine T2-Abnahme von etwa 50 % und eine chemische Verschiebung von mindestens sechs Hertz. Der WaterLOGSY zeigte keine signifikante Veränderung des Signals, um als positiv gewertet zu werden. Da jedoch zwei von drei Experimenten positiv verliefen, wurde dieses Fragment als Treffer gewertet.

Für den zweiten Treffer zeigte der T2 eine Abnahme der Signalintensität um etwa 80 %. Auch für den WaterLOGSY wurde eine deutliche Signaländerung beobachtet. Die chemische Verschiebung reichte in diesem Experiment nicht aus, aber da die beiden vorherigen Kriterien positiv waren, wurde sie dennoch als Treffer gewertet.

Das Endziel solcher Methoden ist es, neue Medikamente oder hochaffine Inhibitoren von beispielsweise Enzymen zu entwickeln, und dabei übernimmt die medizinische Chemie und synthetisiert diese neuen Moleküle, aber die Strukturbiologie, die Techniken, die Sie hier anwenden, können die medizinische Chemie leiten und diesen Ansatz viel schneller machen.