Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Aktin ist der Hauptbestandteil des Zytoskeletts und reguliert kritisch mehrere Aspekte der zellulären Morphologie und Physiologie, einschließlich in Neuronen. Aktin tritt im Gleichgewicht zwischen seinen beiden Formen auf, monomerem globulärem G-Aktin oder polymerem filamentösem F-Aktin. Der Polymerisationsstatus von Aktin wird auf mehreren Ebenen streng reguliert, sowohl durch Aktin-bindende Proteine als auch durch seine eigene post-translationale Regulation.

An den interneuronalen synaptischen Kontakten sind dynamische Veränderungen der F-Aktinspiegel ein wichtiges regulatorisches Ereignis, das die Signalgebung und Plastizität sowohl an prä- als auch an postsynaptischen Terminals steuert. Es überrascht nicht, dass die Aktin-Dysfunktion mit mehreren neuropathologischen Zuständen verbunden ist. Jüngste Fortschritte haben zu einer Fülle von Kenntnissen über Aktin in der neuronalen Physiologie und Pathophysiologie geführt.

Vieles ist jedoch noch unbekannt und muss fokussiert werden. In dieser Hinsicht haben sich fluoreszierende Analoga von Phalloidin als wichtiges Werkzeug in der Aktinforschung erwiesen. Dieses Phallotoxin bindet spezifisch an filamentöses Aktin und kann daher als direktes Maß für die Mengen an F-Aktin und seine Veränderung in pathophysiologischen Zuständen verwendet werden.

Diese Studie präsentiert einen schnellen und effizienten fluorometrischen Assay zur Bewertung des Aktinpolymerisationsstatus in ex-vivo biologischen Proben, wie Großhandelshomogenaten und biochemisch isolierten synaptischen Terminals aus Hirngeweben. Bemerkenswert ist, dass der Assay auf andere Zell- und Gewebetypen und die damit verbundenen physiologischen Phänomene angewendet werden kann. Die Rezepte der in dieser Studie verwendeten Puffer entnehmen Sie bitte dem ausführlichen Text.

Hirngewebeproben von Ratten oder menschlichen Probanden wurden in einem Potter-Elvehjem-Glasrohr homogenisiert und auf Eis in 10 Volumina Homogenisierungspuffer gestößet. Für die Synaptomenpräparation wurde das Homogenat zuerst mit langsamer Geschwindigkeit und dann mit einer höheren Geschwindigkeit gesponnen, um eine rohe synaptosomale mitochondriale Fraktion zu erhalten. Angereicherte Synaptosomen aus dieser rohen Fraktion wurden nach einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten erhalten.

Für die synaptoneurosomale Zubereitung wurden Homogenate nacheinander durch zwei 100-μm- und einen 5-μm-Filter geleitet. Die Proteinschätzung wurde mit Bradford-Reagenz durchgeführt und die Proben wurden in Krebspuffer in einer Konzentration von zwei bis drei Milligramm pro ml Protein in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern verdünnt. Die Stimulation isolierter synaptischer Terminals, entweder Synapptosomen oder Synaptoneurosomen, wurde durch einen kurzen Anstieg des extrazellulären Kaliums um 30 Sekunden bei 37 Grad durchgeführt.

Dazu wurde den Proben ein molares Kaliumchlorid in einer Endkonzentration von 15 Millimolar zugesetzt. Homogenate werden nicht restimuliert und depolarisierte synaptische Fragmente wurden mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert, indem das erforderliche Volumen von 25% Glutaraldehyd-Stammlösung zugesetzt wurde. Die Proben wurden für zwei, drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Fixiermittel wurde durch Zentrifugation bei 20.000 G für fünf Minuten entfernt. Die Proben wurden dann zur Permeabilisierung durch Resuspension in Krebspuffer mit 0,1% Triton X-100 und 1 mg pro ml Natriumborhydrid für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Permeabilisierungspuffer wurde durch Zentrifugation wieder entfernt und das Pellet wurde oberflächlich mit Krebspuffer gewaschen und in Krebspuffer mit 1X Alexa Fluor 647 Phalloidin, entsprechend 500 Mikroeinheiten Phalloidin, resuspendiert.

Die Bindung durfte 10 Minuten bei Raumtemperatur bei Dunkelheit erfolgen. Überschüssiges ungebundenes Phalloidin wurde fünf Minuten lang durch Zentrifugation bei 20.000 G aus den Proben entfernt, und die Pellets wurden oberflächlich mit Krebs-Puffer gewaschen und wieder in Krebs-Puffer mit 0,32 molarer Saccharose resuspendiert, um den Auftrieb von Synaptosomen oder Synaptoneurosomen aufrechtzuerhalten. Fluoreszierende Phalloidin-gebundene Proben wurden in einer 96-Well-Schwarzplatte zum fluorometrischen Ablesen in einem Plattenleser abgegeben.

Die Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden auf 645 Nanometer bzw. 670 Nanometer festgelegt. Für jede Reihe von Experimenten haben wir unterschiedliche Mengen an Alexa Fluor 647 Phalloidin in Krebs-Puffer mit 0,32 molarer Saccharose aufgenommen. Um etwaige Probenverluste während der Waschschritte zu berücksichtigen, wurden die Proben von der schwarzen auf die transparente 96-Well-Platte übertragen.

Anschließend wurde die Erfassung der Proben auf 440 Nanometern untersucht. Die Retention von fluoreszierendem Phalloidin ist direkt proportional zur Menge an Aktinfilamenten oder F-Actin-Spiegeln in den Proben. Die Linearität der Phalloidinbindung wurde im Bereich von 50 bis 200 Mikrogramm Proteinen beobachtet.

Als Proof of Principle haben wir auch die Wirksamkeit unseres Assays in Modellen zur F-Aktin-Depolymerisation unter Verwendung pharmakologischer Disruption von Aktinfilamenten durch Latrunculin A sowie Stimulation der F-Aktinbildung durch KCl-vermittelte Stimulation isolierter synaptischer Terminals getestet. Die Fluoreszenzemission von gebundenem Phalloidin kann als Einheit von gebundenem Phalloidin ausgedrückt werden, die aus der linearen Standardkurve erzeugt wird, und ist relativ zu den Kontrollproben. Für Abbildung 4 werden die F-Actin-Spiegel als Mikroeinheiten des gebundenen Phalloidins ausgedrückt.

Auf der anderen Seite werden für Abbildung 5 F-Aktinspiegel in den depolarisierten synaptischen Fragmenten relativ zu den kontrollunepolarisierten Proben ausgedrückt. Wir beschreiben einen robusten, zeiteffizienten und hochdurchsatzigen Assay zur Analyse von Aktinfilamenten oder F-Actin und seinen Veränderungen in physiologischen und pathophysiologischen Zuständen, die für ein 96-Well-Plattenformat geeignet sind. Der Assay ist viel schneller als bestehende alternative Protokolle und kann als wesentliches Werkzeug in Aktin-bezogenen Studien dienen, entweder allein oder in Kombination mit bestehenden immunhistochemischen und Western Blotting basierten Assays.