Name: Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Lernen Sie die Vitrifikation von Schafoozyten aus adulten und juvenilen Spendern nach in-vitro-Reifung. Diese Methode ermöglicht Kryokonservierung für Zuchtprogramme und Biodiversitätserhaltung.

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Die Autoren erhielten keine spezifische Förderung für diese Arbeit. Professor Maria Grazia Cappai und Dr. Valeria Pasciu sind dankbar für das Video-Voiceover und für den Aufbau des Labors während der Videoaufnahmen.

Das Tierprotokoll und die unten beschriebenen implementierten Verfahren entsprechen den an der Universität Sassari geltenden ethischen Richtlinien, der Richtlinie 86/609/EG der Europäischen Union und der Empfehlung der Kommission der Europäischen Gemeinschaften 2007/526/EG.
1. Vorbereitung von Medien zur Eizellmanipulation
<ol><li>Bereiten Sie das Medium für den Transport der gesammelten Eierstöcke vor, indem Sie die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco mit 0,1 g / L Penicillin und 0,1 g / L Streptomycin (PBS) ergänzen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Medium für die Eizellentnahme und -reifung vor, indem Sie 9,5 g Tissue Culture Medium (TCM) 199 in Pulver mit 1 L Milli-Q-Wasser, ergänzt mit Penicillin (0,1%) und Streptomycin (0,1%).<ol>
<li>Nach der Verdünnung 100 ml Medium filtern und bei 4 °C als Stock Maturation Medium (SMM) lagern, um es für eine Woche zu verwenden.</li>
		<li>Bereiten Sie das Auffangmedium (CM) vor, indem Sie die restlichen 900 ml mit 25 mM HEPES, 0,36 g/L Bicarbonat und 0,1 % (w/v) Polyvinylalkohol (PVA) (pH 7,3, Osmolalität 290 mOsm/kg) ergänzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie das Reifemedium mit SMM vor, das mit 0,021 g/L Bicarbonat, 10% wärmebehandeltem Östrusschafserum, 1 IE/ml FSH, 1 IE/ml LH, 100 μL Cysteamin und 8 mg/ml Pyruvat ergänzt wird. HINWEIS: Das Reifemedium in einem Volumen von 10 ml muss vor Gebrauch mindestens 4 h lang unter Standardbedingungen (in einer maximal befeuchteten Atmosphäre bei 39 °C in 5% CO2 in Luft) inkubiert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Basismedium (BM) für die Manipulation der Eizelle nach der In-vitro-Reifung vor, bestehend aus PBS ohne Ca++ und Mg++,ergänzt mit 20% fetalem Kalbserum (FCS).</li>
</ol>2. Eizellentnahme und Reifung
<ol><li>Erholen Sie die Eizellen von juvenilen (30-40 Tage Alter, Körpergewicht 6-10 kg) und erwachsenen Eierstöcken.</li>
	<li>Transport der gesammelten Eierstöcke vom kommerziellen Schlachthof zum Labor innerhalb von 1-2 h in PBS bei 27 °C.</li>
	<li>Nach dem Waschen in PBS frischem Medium die Eierstöcke in CM mit einer Mikroklinge in Scheiben schneiden, um den Follikelgehalt freizusetzen.</li>
	<li>Wählen Sie im Rahmen einer Stereomikroskopuntersuchung mit 60-facher Vergrößerung Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) für die In-vitro-Reifung aus, indem Sie diejenigen mit 4-10 Schichten von Granulosazellen, Eizellen mit einem gleichmäßigen Zytoplasma, homogener Verteilung der Lipidtröpfchen im Zytoplasma und mit einem Außendurchmesser von etwa 90 μm (Mittelwert) auswählen.</li>
	<li>Waschen Sie die ausgewählten COCs dreimal in CM und übertragen Sie sie schließlich in das Reifemedium. HINWEIS: Für juvenile Eizellen, um das Überleben nach der Vitrifikation zu verbessern, ergänzen Sie das Reifemedium mit 100 μM Trehalose.</li>
	<li>Für die In-vitro-Reifung werden 30-35 COCs in 600 μL Reifemedium in Petrischalen mit vier Wellen übertragen, die mit 300 μL Mineralöl bedeckt sind, und sie für 22 (adulte Eizellen)/24 (juvenile Eizellen) h in 5% CO2 in Luft bei 39 °C inkubieren.</li>
	<li>Nach der In-vitro-Reifung COCs von Kumuluszellen durch sanftes Pipettieren entwenden. Nach der Untersuchung mit einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung wählen Sie nur diejenigen aus, die die Extrusion am ersten Polkörper und damit in der Metaphase II (MII) -Stufe zeigen, um die Vitrifikation zu erhalten.</li>
</ol>3. Samenentnahme, Einfrieren und Auftauen
<ol><li>Bereiten Sie das Basismedium für die Kryokonservierung von Samen vor, bestehend aus Ram Extender (200 mM Tris; 70 mM Zitronensäure; 55 mM Fruktose; pH 7,2, Osmolalität 300 mOsm/kg) ergänzt mit Eigelb 20% (v/v).</li>
	<li>Sammeln Sie den Samen nur während der Schafzuchtsaison (Oktober-November).</li>
	<li>Erhalten Sie Ejakulate durch künstliche Vagina von erwachsenen Widdern (im Alter von 2-5 Jahren), die in einer Außenumgebung gehalten und mit einer Erhaltungsration mit Lebendgewicht gefüttert werden. Halten Sie Widder isoliert in separaten Stiften, aber mit Sichtkontakt untereinander.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Samenentnahme einmal pro Woche während der gesamten Brutzeit, um mindestens 8 Ejakulate von jedem Männchen zu erhalten.</li>
	<li>Transportieren Sie die Samenproben innerhalb von 5 minuten nach der Entnahme bei Umgebungstemperatur ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort. Bündeln Sie die Ejakulate von zwei bis drei Widdern und bewerten Sie die Spermienkonzentrationsspektrophotometrie.</li>
	<li>Nach dem Pooling die Ejakulate auf 400 x 106 Spermatozoen/ml mit Basismedium für die Samen-Kryokonservierung mit 4% Glycerin ergänzen. Anschließend den verdünnten Samen über einen Zeitraum von 2 h auf 4 °C abkühlen und vor dem Einfrieren 20 min ausgleichen.</li>
	<li>Die Samenproben in Pelletform (0,25 ml) auf Trockeneis einfrieren und dann in flüssigen Stickstoff tauchen.</li>
	<li>Zum Auftauen das Pellet in einen sterilisierten Glasfalken geben und für 20 s bei 39 °C in ein Wasserbad tauchen.</li>
</ol>4. In-vitro-Fertilisation und Embryokultur
<ol><li>Bereiten Sie die Vorräte für die Konstitution der synthetischen Eileiterflüssigkeit (SOF) vor.<ol>
<li>Bereiten Sie Stock A vor: 99,4 ml MilliQ-Wasser; 6,29 g NaCl; 0,534 g KCl; 0,161 g KH2PO4; 0,182 gMgSO4 ·7H2 O; und 0,6 ml Natriumlactat. Bis zu 3 Monate bei 4 °C aufbewahren.</li>
		<li>Bereiten Sie Stock B vor: 10 ml MilliQ-Wasser; 0,210 g NaHCO3; und 2-3 g Phenolrot. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.</li>
		<li>Bereiten Sie Brühe C vor: 10 ml MilliQ-Wasser; und 0,051 g Natriumpyruvat. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.</li>
		<li>Bereiten Sie Brühe D vor: 10 ml MilliQ-Wasser; und 0,262 g CaCl2 2H2O. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.</li>
		<li>Bereiten Sie 10 ml SOF vor, bestehend aus 7,630 ml MilliQ-Wasser, 1 ml Schaft A, 1 ml Schaft B, 0,07 ml Schaft C und 0,7 ml Stamm D.</li>
		<li>Vorbereitung der In-vitro-Fertilisation (IVF): SOF ergänzt mit 2% wärmebehandeltem östrous Schafserum, 10 μg/ml Heparin und 1 μg/ml Hypoutarin (Osmolalität 280-290 mOsm/kg). HINWEIS: Das IVF-Medium in einem Volumen von 10 ml muss unter Standardbedingungen (in einer maximal befeuchteten Atmosphäre bei 39 °C in 5%CO2,5% O2 und 90% N2) mindestens 4 h vor Gebrauch inkubiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie gefrorene/aufgetaute Samen aliquots in ein sterilisiertes konisches Glasrohr unter 1,5 ml erwärmtem IVF-Medium und inkubieren Sie sie für 15 min bei 39 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 in der Luft.</li>
	<li>Nach der Inkubation schwimmen die beweglichen Spermatozoen in Richtung des apikalen Teils der Flüssigkeitssäule. Sammeln Sie die oberste Schicht und beobachten Sie die Beurteilung der Spermienmotilität. HINWEIS: Die Parameter der Spermienmotilität sollten mit einem computergestützten Spermienanalysesystem (CASA) mit den folgenden Einstellungen bewertet werden: 25 Frames, die zur Vermeidung von Überlappungen der Spermienspur erworben wurden, Mindestkontrast 10, Mindestgeschwindigkeit des durchschnittlichen Pfades 30 μm / s und progressive Motilität > 80% Geradheit. Dieses System verfügt über ein spezifisches Setup für die Bewertung von Widderspermien. Für jede Probe werden 5 μL Teilprobe spermiensuspension in eine vorgewärmte Analysekammer mit einer Tiefe von 10 μm geladen. Die Spermienmotilität wird bei 37 °C bei 40x mit einem Phasenkontrastmikroskop beurteilt und mindestens 500 Spermien pro Teilstichprobe sollten in mindestens vier verschiedenen mikroskopischen Feldern analysiert werden. Der Prozentsatz der gesamten beweglichen und progressiven beweglichen Spermien wurde bewertet. Für die IVF sollte der Prozentsatz der progressiven beweglichen Spermatozoen ≥ 30% betragen.</li>
	<li>Verdünnen Sie aus Swim-up gewonnene bewegliche Spermatozoen bei 1 x10 6 Spermatozoen / ml Endkonzentration und koinubieren Sie sie mit MII-Eizellen in 300 μL IVF-Medium, das mit Mineralöl in Vier-Well-Petrischalen bedeckt ist.</li>
	<li>Nach 22 h übertragen Sie die mutmaßlichen Zygoten in Vier-Well-Petrischalen, die SOF enthalten, ergänzt mit 0,4% Rinderserumalbumin und essentiellen und nicht essentiellen Aminosäuren in eileiterhaltiger Konzentration, wie von16 unter Mineralöl berichtet, und kultivieren sie unter Standardbedingungen bis zum Blastozystenstadium.</li>
	<li>Erfassen Sie bei 22-, 26- und 32-h nach der Insemination die Anzahl der gespaltenen Eizellen, die zwei verschiedene Blastomere aufweisen, durch die Untersuchung unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Beobachten Sie die Embryonen täglich ab dem fünften bis zum neunten Kulturtag und neu gebildete Blastozysten sollten durch die Untersuchung unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung aufgezeichnet werden.</li>
</ol>5. Vitrifikation und Erwärmung der Eizellen
HINWEIS: Führen Sie die Vitrifikation nach der Methode des minimalen essentiellen Volumens (MEV) mit Gerätekrütomoten17 durch.
<ol><li>Eine Gruppe von fünf Eizellen bei 38,5 °C für 2 min in BM ausgleichen. Die Verwendung von BM garantiert eine niedrige Calciumkonzentration ([Ca2++]2,2 mg/dl)10.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Eizellen mit einer 3-minütigen Exposition gegenüber Gleichgewichtslösung, die 7,5% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 7,5% (v/v) Ethylenglykol (EG) in BM enthält.</li>
	<li>Die Eizellen werden in die Vitrifikationslösung mit 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG und 0,5 M Trehalose in BM überführen, bevor sie in ein Kryotopgerät geladen und innerhalb von 30 s direkt in flüssigen Stickstoff gestürzt werden.</li>
	<li>Um sich auf eine biologische Temperatur zu erwärmen, den Inhalt jeder Vitrifikationsvorrichtung aus flüssigem Stickstoff in 200 μL Tropfen von 1,25 M Trehalose in BM für 1 min bei 38,5 °C geben und vorsichtig umrühren, um das Mischen zu erleichtern.</li>
	<li>Um die Entfernung intrazellulärer Kryoprotektoren zu fördern, werden die Eizellen schrittweise in 200 μL Tropfen abnehmender Trehaloselösungen (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M Trehalose in BM) für 30 s bei 38,5 °C übertragen, bevor sie für 10 min bei 38,5 °C in BM ausgeglichen werden.</li>
</ol>6. Beurteilung der Eizellqualität nach der Erwärmung
<ol><li>Nach der Erwärmung die Eizellen für 6 h in PBS ohneCa++ undMg++ plus 20% FCS (BM) in 5% CO2 in Luft bei 38,5 °C inkubieren. HINWEIS: Die Fähigkeit der Eizelle, biologische und strukturelle Merkmale nach der Vitrifikation wiederherzustellen, steht in Bezug auf die Arten und Klassen der verwendeten Eizellen.</li>
	<li>Da die Fähigkeit der Eizelle, Kryokonservierungsschäden wiederherzustellen, zeitabhängig ist, beurteilen Sie die Eizellqualität zu verschiedenen Zeitpunkten der In-vitro-Kultur (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) nach der Erwärmung, um das optimale Zeitfenster für die Befruchtung der Eizellen zu definieren. HINWEIS: Bei erwachsenen Schafseigen ist die optimale Zeit 4 h nach der Erwärmung; für präpubertäre Eizellen ist der optimale Zeitpunkt 2 h nach der Erwärmung.</li>
</ol>7. Beurteilung des Überlebens der Eizellen
<ol><li>Unmittelbar nach der Erwärmung und für jeden Zeitpunkt der Nacherwärmungskultur werden die Eizellen morphologisch mit einem invertierten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung bewertet. HINWEIS: Eizellen mit strukturellen Veränderungen wie schwachem Zytoplasma, Schädigung der Zona pellucida und/oder Membran sollten als degeneriert eingestuft werden.</li>
	<li>Validieren Sie die Bewertung der Membranintegrität mit einer doppelten differentiellen Fluoreszenzfärbung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eizellen in 2 ml BM, die Propidiiumiodid (PI; 10 μg/ml) und Hoechst 33342 (10 μg/ml) enthalten, für 5 min in 5% CO2 in Luft bei 38,5 °C.</li>
	<li>Nach dreimaliger Wäsche in frischem BM beobachten Sie die Eizellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter von 350 nm und einer Emission von 460 nm für Hoechst 33342 und einem Anregungsfilter von 535 nm und einer Emission von 617 nm für PI. HINWEIS: Eizellen mit intakter Membran sind an der blauen Fluoreszenz farbiger DNA mit Hoechst 33342 zu erkennen. Eizellen mit beschädigten Membranen zeigen eine rote Fluoreszenz aufgrund von DNA-Färbung mit PI.</li>
</ol>8. Bewertung der mitochondrialen Aktivität und der intrazellulären ROS-Spiegel durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
<ol><li>Bereiten Sie die MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) Sonde vor.<ol>
<li>Verdünnen Sie den Inhalt von 1 Durchstechflasche (50 μg) mit 1 ml DMSO, um eine 1 mM Lösung zu erhalten. Bewahren Sie die verdünnte Durchstechflasche in flüssigem Stickstoff auf.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Lösung 1 mM mit DMSO, um die 100 μM Stammlösung zu erhalten, und lagern Sie sie bei -80 °C im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereiten 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat(H2DCF-DA) Sonde.<ol>
<li>Verdünnen Sie dasH2DCF-DA in 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVA)/PBS, um die erste 100 mM-Lösung zu erhalten. Bewahren Sie die Lösung bei -80 °C im Dunkeln auf.</li>
		<li>Verdünnen Sie die erste Lösung in 0,1% PVA/PBS, um die 100 μM Stammlösung zu erhalten. Bei -20 °C im Dunkeln lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie das Montagemedium (MM) vor: Für 10 ml MM 5 ml Glycerin, 5 ml PBS und 250 mg Natriumazid hinzufügen. Bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Eizellen für 30 min bei 38,5 °C in BM mit 500 nM MT-Rot (Stammlösung: 100 μM in DMSO).</li>
	<li>Nach der Inkubation mit MT-Red-Sonde die Eizellen dreimal in BM waschen und 20 min in demselben Medium mit 5 μMH2DCF-DA (Stammlösung: 100 μM in BM) inkubieren.</li>
	<li>Nach der Exposition bei den Sonden die Eizellen in BM waschen und mindestens 15 Minuten lang in 2,5% Glutaraldehyd / PBS fixieren.</li>
	<li>Nach der Fixierung die Eizellen dreimal in BM waschen und auf Glasobjektträgern in einem 4 μL Tropfen MM mit 1 mg/ml Hoechst 33342 mit Wachskissen montieren, um eine Kompression der Proben zu vermeiden.</li>
	<li>Objektträger bis zur Auswertung bei 4 °C im Dunkeln lagern.</li>
	<li>Führen Sie die Analyse von immunmarkierten Abschnitten mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durch. Das Mikroskop ist mit Ar/He/Ne-Lasern ausgestattet, die ein 40/60-faches Ölobjektiv verwenden. Analysieren Sie die Abschnitte durch sequentielle Anregung.</li>
	<li>Für die mitochondriale Auswertung beobachten Sie die Proben mit einem Multiphotonenlaser, um MT-Red nachzuweisen (Exposition: 579 nm; Emission: 599 nm).</li>
	<li>Verwenden Sie einen Argon-Ionen-Laserstrahl bei 488 nm und den B-2 A-Filter (495 nm Exposition und 519 nm Emission), um auf das Dichlorfluorescein (DCF)18hinzuweisen.</li>
	<li>In jeder einzelnen Eizelle messen MT-Rot- und DCF-Fluoreszenzdicken auf der Äquatorebene19.</li>
	<li>Beibehaltung der Parameter in Bezug auf die Fluoreszenzintensität bei konstanten Werten während aller Bildaufnahmen (Laserenergie 26%, Sequenzielle Einstellungen 1: PMT1-Verstärkung 649-PMT2-Verstärkung 482; Sequenzielle Einstellung 2: PMT1 Verstärkung 625-PMT2 Verstärkung 589; Offset 0; Lochgröße: 68).</li>
	<li>Führen Sie eine quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität mit dem Leica LAS AF Lite Bildanalyse-Softwarepaket durch, wobei die Verfahren um20standardisiert sind.</li>
	<li>Nehmen Sie die Bilder einmal auf, bewegen Sie sich auf der Z-Achse, bis Sie die Äquatorebene erreichen.</li>
	<li>Für jedes Foto in Graustufen umwandeln und Kanal 1 (bezogen auf Hoechst-Blau) deaktivieren. Zeichnen Sie dann manuell eine Region of Interest (ROI) auf einer umschriebenen Fläche, d. h. um die meiotische Spindel. HINWEIS: Die Software kann automatisch den Pixeldurchschnittswert auf dem Kanal 2 (FITC) lesen und den Wert des Hintergrunds davon subtrahieren.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Mittelwerte der Pixel auf und senden Sie sie zur statistischen Analyse.</li>
</ol>9. Statistische Auswertungen
<ol><li>Analyse der folgenden Unterschiede: Überlebensraten in juvenilen vs. adulten Eizellen, Überlebensraten und Entwicklungskompetenz in Kontroll- und Trehalose-behandelten juvenilen Eizellen, Überlebens- und parthenogenetische Aktivierungsraten und Entwicklungskompetenz von adulten Eizellen, die mit verschiedenen Kalziumkonzentrationsmedien vitrifiziert sind, Befruchtungsraten und Embryoproduktion in juvenilen Eizellen, die mit niedriger oder hoher Kalziumkonzentration vitrifiziert sind, aktive Mitochondrienphänotypen in juvenilen vitrifizierten Eizellen während unterschiedliche Zeitpunkte der posterwärmenden Kultur und parthenogenetische Aktivierungsraten zwischen adulten und juvenilen vitrifizierten Eizellen mit dem Chi-Quadrat-Test.</li>
	<li>Analysieren Sie die Spaltungsrate und den Embryoausstoß in vitrifizierten adulten Eizellen während verschiedener Zeitpunkte der Posterwärmungskultur, die Fluoreszenzintensität der mitochondrialen Aktivität und die intrazellulären ROS-Spiegel in juvenilen vitrifizierten Eizellen während verschiedener Zeitpunkte der Posterwärmungskultur durch ANOVA nach Analyse der Homogenität der Varianz durch Levenes Test. Verwenden Sie einen Post-hoc-Test Tukey's Test, um Unterschiede zwischen und zwischen Gruppen hervorzuheben.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analysen mit dem statistischen Softwareprogramm durch und betrachten Sie eine Wahrscheinlichkeit von P < 0,05 als Mindestbedeutungsniveau. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.E.M ausgedrückt.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Kryokonservierung von Eizellen bei Haustieren kann nicht nur die langfristige Erhaltung weiblicher genetischer Ressourcen ermöglichen, sondern auch die Entwicklung embryonaler Biotechnologien vorantreiben. So würde die Entwicklung einer Standardmethode zur Vitrifikation von Eizellen sowohl der Nutztierhaltung als auch dem Forschungssektor zugute kämen. In diesem Protokoll wird eine vollständige Methode zur Vitrifikation von eizellten Erwachsenen schafen vorgestellt, die einen soliden Ausgangspunkt für die Entwicklung...

Die Langzeitlagerung der weiblichen Gameten kann eine breite Palette von Anwendungen bieten, wie z. B. die Verbesserung der Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme, den Beitrag zur Erhaltung der Biologischen Vielfalt durch das Ex-situ-Programm zum Schutz von Wildtierarten und die Förderung der Forschung und Anwendungen in der In-vitro-Biotechnologie dank der Verfügbarkeit von gelagerten Eizellen, die in die In-vitro-Embryonenproduktion oder Kerntransplantationsprogramme integriert werden können1,2,3. Die Vitrifikation juveniler Eizellen würde auch den genetischen Gewinn erhöhen, indem das Erzeugungsintervall in Zuchtprogrammen verkürzt wird4. Die Vitrifikation durch ultraschnelles Abkühlen und Erwärmen von Eizellen gilt derzeit als Standardansatz für die Kryokonservierung von Tierinnen5. Bei Wiederkäuern werden Eizellen vor der Vitrifikation in der Regel in vitro gereift, nachdem sie aus Follikeln gewonnen wurden, die aus Schlachthof-Eierstöcken gewonnen wurden2. Erwachsene und insbesondere präpubertäre Eierstöcke4,6, können in der Tat eine praktisch unbegrenzte Anzahl von Eizellen liefern, die kryokonserviert werden sollen.
Bei Rindern wurden nach Vitrifizierung und Erwärmung der Eizellen Blastozystenerträge von >10% in den letzten zehn Jahren häufig von mehreren Labors berichtet3. Bei kleinen Wiederkäuern gilt die Vitrifikation der Eizellen jedoch sowohl für juvenile als auch für erwachsene Eizellen noch als relativ neu, und eine Standardmethode für die Vitrifikation von Schaf-Eizellen muss noch festgelegt werden2,5. Trotz jüngster Fortschritte zeigt die vitrifizierte und erwärmte Eizelle tatsächlich mehrere funktionelle und strukturelle Veränderungen, die ihr Entwicklungspotenzial einschränken7,8,9. Daher haben nur wenige Artikel über eine Blastozystenentwicklung von 10% oder mehr in vitrifizierten/ erwärmten Schafse eizellenberichtet 2. Es wurden mehrere Ansätze untersucht, um die oben genannten Veränderungen zu reduzieren: Optimierung der Zusammensetzung der Vitrifikations- und Auftaulösungen10,11; Experimentieren mit der Verwendung verschiedener Kryo-Geräte8,12,13; und Anwendung spezifischer Behandlungen während der In-vitro-Reifung (IVM)4,14,15 und/oder während der Erholungszeit nach dem Erwärmen6.
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen gesammelt und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Kulturperiode nach der Erwärmung.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorfluorescindiacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Rinderfraktion V, proteasefrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimid H 33342 Trihydrochlorid (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) Fructose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Trehalose Dehydr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Eigelb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hypoutarin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-Serin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Heptahydrat (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler Zählkammer</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Rot CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborenes Kälberserum hitzeinaktiviert (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylalkohol (87-90% hydrolysiert, durchschnittliches Molgewicht 30.000-70.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Schafserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-dl-Lactatlösungssirup</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Spermienklassen-Analysator</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Statistische Software Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15.456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrifikation von in vitro gereiften eizellen, die aus adulten und präpubertären eierstöcken bei schafen entnommen wurden

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

In der Tierhaltung können In-vitro-Embryoproduktionssysteme dank der großen Anzahl von Eierstöcken und Eizellen, die leicht aus einem Schlachthof gewonnen werden können, entwickelt und aufrechterhalten werden. Erwachsene Eierstöcke tragen immer mehrere Antralfollikel, während bei präpubertären Spenderinnen die maximale Anzahl von Eizellen im Alter von 4 Wochen verfügbar ist, wenn eierstöcke Spitzenzahlen von Antralfollikeln tragen. So gelten 4 Wochen alte Lämmer als gute Spenderinnen, auch wenn die Entwicklungskompetenz präpubertärer Eizellen im Vergleich zu ihrem erwachsenen Pendant geringer ist. 
Grundlagenforschung und kommerzielle Anwendungen würden durch die Möglichkeit der erfolgreichen Kryokonservierung von vitrifizierten Eizellen gefördert, die sowohl von erwachsenen als auch von präpubertären Spenderinnen gewonnen wurden. Die Vitrifikation von Eizellen, die von präpubertären Spenderinnen gesammelt wurden, würde auch eine Verkürzung des Erzeugungsintervalls und damit eine Erhöhung des genetischen Gewinns in Zuchtprogrammen ermöglichen. Der Verlust des Entwicklungspotenzials nach der Kryokonservierung macht Säugetier-Eizellen jedoch wahrscheinlich zu einem der am schwierigsten zu kryokonservierenden Zelltypen. Unter den verfügbaren Kryokonservierungstechniken wird die Vitrifikation häufig auf tierische und menschliche Eizellen angewendet. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Technik induzieren Expositionen gegenüber hohen Konzentrationen von Kryoprotektoren sowie kühlen Verletzungen und osmotischem Stress immer noch mehrere strukturelle und molekulare Veränderungen und reduzieren das Entwicklungspotenzial von Eizellen von Säugetieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigzellen, die von juvenilen und erwachsenen Spenderinnen entnommen und vor der Kryokonservierung in vitro gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung der Eizellen bis zur Vitrifikation, Erwärmung und Inkubationszeit nach der Erwärmung. Eizellen, die im MII-Stadium verglast wurden, können zwar nach der Erwärmung befruchtet werden, benötigen jedoch vor der Befruchtung zusätzliche Zeit, um Schäden durch Kryokonservierungsverfahren wiederherzustellen und ihr Entwicklungspotenzial zu erhöhen. Daher sind die Kulturbedingungen und der Zeitpunkt nach der Erwärmung entscheidende Schritte für die Wiederherstellung des Entwicklungspotenzials der Eizellen, insbesondere wenn Eizellen von juvenilen Spenderinnen entnommen werden.

Die Kryotoleranz von Eizellen von juvenilen Spenderinnen ist im Vergleich zu erwachsenen niedriger. Der erste beobachtete Effekt ist eine niedrigere Überlebensrate nach der Erwärmung im Vergleich zu adulten Eizellen (Abbildung 1A; χ2 Test P&lt;0,001). Juvenile Eizellen zeigten nach der Erwärmung eine geringere Membranintegrität (Abbildung 1B). Die Verwendung von Trehalose im Reifemedium sollte überprüfen, ob dieser Zucker Kryoverletzungen in juvenilen...

Das Protokoll zielt darauf ab, eine Standardmethode für die Vitrifikation von erwachsenen und juvenilen Schafe eizellen bereitzustellen. Es umfasst alle Schritte von der Herstellung der In-vitro-Reifemedien bis zur Nacherwärmungskultur. Eizellen werden im MII-Stadium mit Cryotop vitrifiziert, um das minimale essentielle Volumen zu gewährleisten.

Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

Die Aufrechterhaltung der potenziellen Lebensfähigkeit von Eizellen nach langfristiger Lagerung stellt ein Instrument großer Chancen dar, da es die Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme verbessern, zur Erhaltung der Biodiversität durch den Schutz von Wildtierarten beitragen und die Forschung in der Biotechnologie verstärken würde. Die Vitrifikation der juvenilen Eizellen war im Generationsintervall in Zuchtprogrammen viel kürzer. Vitrifaktion durch ultraschnelle Kühlung und Erwärmung gilt als Standardansatz bei der Erhaltung von Rinder-Eizellen.Bei Schafen gilt dieses Verfahren jedoch noch als relativ neu und es fehlt eine Standardmethode. In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigen, die sowohl von juvenilen als auch von erwachsenen Spenderinnen gesammelt und in vitro vor der Kryokonservierung gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung, Vitrifikation, Erwärmung und Nacherwärmungskultur.Nach der Wiederherstellung des Cumulus-Eizellkomplexes, der in vitro für 24 Stunden in statisch gereift ist, ein Zustand, der für juvenile Eizellen die Supplementierung mit hundert Mikromolaren Trehalose im Reifemedium umfasst. Nach der In-vitro-Reifung wurden die Eizellen durch sanftes Pipettieren mechanisch von Cumulus-Zellen entkernt und unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung untersucht. Die Auswahl der Eizellen, die bei den Vitrifikationsverfahren eingereicht werden sollen, stellt den ersten wichtigen Schritt dar, um die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens zu garantieren.Nur diejenigen mit dem gleichmäßigen Zytoplasma, mit homogener Verteilung der Lipidtröpfchen, Integrität der ganzen Emma breiten und kontinuierlichen Pivotal im Raum, kompakte Zona pellucida mit einem Außendurchmesser von etwa 19 Mikrometern und der Extrusion des ersten Polkörpers und damit im M2-Stadium müssen ausgewählt werden. Die Vitrifikation wurde mit der Methode des minimalen essentiellen Volumens mit einem Kryotops-Gerät durchgeführt. Nach der Selektion wurde eine Gruppe von fünf juvenilen Eizellen für zwei Minuten bei 38,5 Grad Celsius im Basismedium konditioniert.Die Eizellen wurden dann durch drei Minuten Exposition bei einer Kalibrierlösung dehydriert. Die Belastung der Eizelle in das verwendete Vitrifikationsgerät ist ein wichtiger und kritischer Schritt. Cryotop verwendet einen Polypropylenstreifen, der an einem Halter befestigt ist.Bei dieser Methode werden die Eizellen in der Vitrifikationslösung, weniger als 0 Punkt Milliliter, schnell mit einer Glaskapillare auf dem Filmstreifen belastet. Dann muss die Lösung entfernt werden, wobei eine dünne Schicht zurückbleibt, die ausreicht, um die zu kryokonservierenden Zellen zu bedecken. Vor dem Laden in das Cryotop-Gerät und das direkte Eintauchen in flüssigen Stickstoff innerhalb von 30 Sekunden.Für eine warme biologische Innentemperatur wurde der Gehalt jeder Vitrifikationsvorrichtung von flüssigem Stickstoff in 200 Mikrolitertropfen abnehmender Trehaloselösung übertragen. Eizellen wurden übertragen, wobei die Eizellen mit einer dünnen Glaspipette gezogen wurden, um die Entfernung von intracelulären Kryoprotektoren zu fördern. Schließlich wurden die Eizellen in einem Basismedium im Inkubator in 5% Kohlendioxid vorgezüchtet.Unmittelbar nach der Erwärmung und für jeden Zeitpunkt der Posterwärmungskultur wurden die Eizellen morphologisch mit einem invertierten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung bewertet. Die Kryotoleranz von Eizellen von juvenilen Spenderinnen ist geringer als bei veränderten Eizellen mit geringerer Membranintegrität nach der Erwärmung. Die Verwendung von Trehalose im Reifungsmedium induziert in juvenilen Eizellen eine höhere Membranintegrität, wodurch die Überlebensraten nach der Vitrifikation erhöht werden.Spaltung, Befruchtung und Entwicklungsraten von juvenilen Eizellen wurden jedoch nicht durch Trehalose-Supplementierung erhöht. Die Verwendung von Medien mit einer Kalziumkonzentration von 2,2 Milligramm Deziliter für die Vitrifikation von juvenilen Eizellen sollte höhere Befruchtungsraten im Vergleich zu Eizellen mit Kalziumkonzentration verglast haben, aber es wurden keine Unterschiede gefunden, die die Produktion ermöglichen. Durch den Vergleich der Post-Erwärmungskultur auf verschiedenen Daueren zeigten wir, dass eitätige Eizellen, die von älteren beiden Personen gesammelt wurden, nach vier Stunden Kultur in der Lage sind, die energetischen Bindungen und den mikrotubularen Aufbau wiederherzustellen und die Entwicklungskompetenz mit höherer Spaltung und Blastozytenabfall wiederherzustellen.Die mitochondriale Aktivität war in vitrifizierten warmen juvenilen Eizellen nach vier Stunden Posterwärmungskultur im Vergleich zu anderen Zeitpunkten höher. Die mitochondriale Verteilungsteilung änderte sich auch während sechs Stunden nach der Erwärmungskultur. Darüber hinaus waren die intrazellulären Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies in juvenilen Eizellen nach zwei Stunden Nacherwärmungskultur signifikant niedriger als in 0, 4 und 6 Stunden.Im Gegensatz zu dem, was in anderen Eizellen gefunden wurde, stiegen die Raten der spontanen parthenogentischen Aktivierung während der Post-Erwärmungskultur in juvenilen Eizellen. Einer der Hauptvorteile der vorgeschlagenen Methode ist, dass sie alle Schritte von der Eizellentnahme bis zur In-vitro-Reifung, Vitrifikation und Erwärmung umfasst. Darüber hinaus umfasst es eine Kulturperiode nach der Erwärmung, um die Genesung der Eizellen von den während des Vitrifikationsverfahrens entstandenen Schäden zu ermöglichen.Die Wahl des optimalen Zeitpunkts für die Befruchtung ist eine Herausforderung und kann sich auf das Ergebnis des Vitrifikationsprogramms auswirken. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass die Vitrifikation im Gegensatz zum langsamen Einfrieren eine manuelle Technik ist und daher vom Bediener abhängig ist. Aus diesem Grund ist eine große Herausforderung der Bedarf an qualifizierten Technikern und Forschern, die den Bedienereffekt bei der Bewertung des Ergebnisses des Vitrifikationsprogramms berücksichtigen.Weitere Studien aus unserem Labor werden es ermöglichen, das Vitrifikationsverfahren und die Auswahl von Eizellen zu standardisieren und die Medienzusammensetzung besser auf die Bedürfnisse der juvenilen Eizelle abzustimmen. Eine Missachtung der Verwendung von Kultur und Charakter und Antioxidans bieten wir vielversprechende Möglichkeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Manuskript beschreibt einen experimentellen Ansatz zur morphologischen und biochemischen Charakterisierung von Pferdostozyten. Speziell veranschaulicht die vorliegende Arbeit, wie man unreife und reife Pferdoozyten durch Ultraschall-geführte Ovum-Pick-up (OPU) sammelt und wie man Chromosomensegregation, Spindelmorphologie, globale Histonacetylierung und mRNA-Expression untersucht.

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

Hier werden zwei Protokolle für die Verkapselung von Schweineeioozyten unter 3D-Kulturbedingungen vorgestellt. In der ersten werden Cumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) in Fibrin-Alginat-Perlen eingekapselt. In der zweiten werden sie mit fluorierten Ethylenpropylenpulverpartikeln (Mikrobioreaktoren) umschlossen. Beide Systeme sorgen für optimale Bedingungen, um ihre 3D-Organisation aufrechtzuerhalten.

Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur minimalen Volumenverglasung unreifer Katzenoozyten mit im Labor hergestellten Medien auf kommerziellen Trägern. Es deckt jeden Schritt von der Eizellenisolierung von ex vivo Gonaden bis zur Verglasung und Erwärmung ab.

Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten

Wir beschreiben die Verfahren zur Isolierung wachsender Eizellen von Eierstockfollikel in frühen Entwicklungsstadien sowie den Aufbau eines In-vitro-Kultursystems, das das Wachstum und die Differenzierung bis in die ausgewachsene Phase unterstützen kann.

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

Die Kryokonservierung von Eizellen wird von mehreren internationalen wissenschaftlichen Gesellschaften als Goldstandard für die Erhaltung der Fruchtbarkeit bei postpubertären Frauen anerkannt. Geeignete klinische und Laborstrategien gewährleisten maximale Wirksamkeit, Effizienz und Sicherheit von Fruchtbarkeitserhaltungsbehandlungen.

Fruchtbarkeitserhaltung durch Eizellvitrifikation: Klinische und Laborperspektiven

Es wird ein Protokoll für die Vitrifikation von Ovarialgewebe als Alternative zu dem weit verbreiteten Protokoll des langsamen Einfrierens vorgestellt.

Vitrifikation des Gewebes der Ovarialrinde, um einen glasartigen Aggregatzustand zu erreichen

Hier stellen wir das Spatel-Montevideo-Protokoll für die Vitrifizierung von Präimplantationsembryonen von Mäusen und Schafen vor, das aus einem hausgemachten Spatel und der Verwendung hausgemachter Lösungen besteht. Die Embryonen werden schnell in zwei Kryoprotektiva-Lösungen mit zunehmender Konzentration äquilibriert, auf den Spatel geladen, in flüssigen Stickstoff getaucht und schließlich mit einem 0,5-ml-Strohhalm versiegelt.

Spatel Montevideo Gerät für die Vitrifizierung von Säugetierembryonen

Dieses Protokoll beschreibt standardisierte Methoden zur Isolierung und Verarbeitung von Follikelflüssigkeit, somatischen Zellen und unreifen Eizellen aus IVF-Verfahren und ermöglicht so qualitativ hochwertige molekulare und zelluläre Analysen. Diese Ansätze unterstützen die translationale Forschung zu Fertilität, reproduktivem Altern und Funktionsstörungen der Eierstöcke unter Verwendung von Materialien, die in der klinischen Versorgung normalerweise entsorgt werden.

Entnahme von menschlicher Follikelflüssigkeit, somatischen Follikelzellen und unreifen Eizellen von Personen, die sich einer In-vitro-Fertilisation unterziehen

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.

In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert

Lernen Sie die Vitrifikation von Schafoozyten aus adulten und juvenilen Spendern nach in-vitro-Reifung. Diese Methode ermöglicht Kryokonservierung für Zuchtprogramme und Biodiversitätserhaltung.

Vitrifikation von in vitro gereiften Eizellen, die aus adulten und präpubertären Eierstöcken bei Schafen entnommen wurden

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