Färbung und hochauflösende Bildgebung von dreidimensionalen Organoid- und Sphäroidmodellen
27. März 2021
Hier stellen wir detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Verfügung, um Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten dreidimensionalen Zellkulturmodellen im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern durchzuführen und so die Visualisierung ihrer Morphologie, Zelltypzusammensetzung und Wechselwirkungen zu ermöglichen.
Die Charakterisierung von 3D-In-vitro-Modellen mit zellulärer und subzellulärer Auflösung ist entscheidend für die vollständige Nutzung, kann aber eine Herausforderung darstellen. Daher haben wir ein komplementäres Protokoll für die Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten 3D-In-vitro-Modellen im Bereich von 100 Mikrometern bis zu mehreren Millimetern bereitgestellt. 3D-Strukturen sind radial und sollten sorgfältig manipuliert werden.
Überprüfen Sie vor dem Pipettieren die Position Ihrer 3D-Strukturen in der Röhre, um eine Aspiration zu vermeiden. Da wir klassische Techniken für die Einbettung kleiner Strukturen wie Organoide oder Sphäroide adaptiert haben, können visualisierte Anweisungen Erstanwendern helfen, die Aufgabe einfacher zu erledigen. Laura Francols, eine Labortechnikerin der Pathology Research Platform, wird das Verfahren mit mir demonstrieren.
Um Proben für die 3D-Färbung der gesamten Halterung vorzubereiten, verwenden Sie eine mit BSA vorcodierte Pipettenspitze von einem Milliliter, um eine 3D-Struktursuspension von einem Milliliter zu einem 500-Mikroliter-Röhrchen PBS hinzuzufügen. Wenn sich die 3D-Strukturen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 500 Mikroliter Permeabilisierungsblocklösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit sanftem horizontalem Rühren bei 30 bis 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die 3D-Strukturen am Ende der Inkubation erneut sedimentieren, bevor Sie die 3D-Strukturen zwei Mal in einem Milliliter von 0,1% PBS, ergänzt mit BSA, für drei Minuten pro Waschgang sorgfältig waschen.
Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikroliter Primärantikörper in PBS für zwei bis drei Tage unter sanftem horizontalem Rühren bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Probe mit fünf dreiminütigen und zwei 15-minütigen Wäschen in einem Milliliter von 0,1% PBS BSA pro Waschgang gewaschen. Nach der letzten Wäsche beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern des entsprechenden sekundären Antikörpers in PBS für 24 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren vor Licht geschützt.
Am nächsten Tag beschriften Sie die 3D-Strukturen mit 250 Mikrolitern der entsprechenden Konzentration von Hoechst 3342 für eine zweistündige Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanftem horizontalem Rühren. Am Ende der Inkubation waschen Sie die 3D-Strukturen fünfmal für drei Minuten und zweimal für 15 Minuten in einem Milliliter PBS pro Waschgang, wie gezeigt. Nach der letzten Wäsche übertragen Sie die 3D-Strukturen auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte aus schwarzem Polystyrol und geben Sie vorsichtig 200 Mikroliter Reinigungslösung auf die Strukturen, um Blasen zu vermeiden.
Dann legen Sie die mit Alufolie bedeckte Platte bei vier Grad Celsius für mindestens 48 Stunden. Um große 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pipettenspitze, um die 3D-Strukturen vorsichtig auf ein flaches Glasrohr mit einem mit PTFE ausgekleideten Flaschenverschluss zu übertragen. Nachdem sich die Strukturen abgesetzt haben, ersetzen Sie das PBS vorsichtig durch 70% Ethanol für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Ersetzen Sie am Ende der Inkubation das 70%ige Ethanol durch einen Milliliter gebrauchsfertige Eosin-Y-Lösung. Streifen Sie die Tube und färben Sie die Strukturen für mindestens 30 Minuten. Am Ende der Inkubation dehydrieren Sie die Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter 100% Ethanol pro Waschgang.
Nach der letzten Austrocknung entfernen Sie die 3D-Strukturen mit drei aufeinanderfolgenden 30-minütigen Wäschen in einem Milliliter Xylol pro Waschgang unter einer chemischen Haube. Legen Sie nach dem letzten Eintauchen in Xylol ein Stück Xylol-getränktes Biopsie-Pad in ein Fach einer weißen Mikrotwin-Gewebekassette und verwenden Sie eine BSA-beschichtete Pasteur-Pipette aus Kunststoff mit zwei Millilitern, um die 3D-Strukturen auf das Pad zu übertragen. Decken Sie die 3D-Strukturen mit einem weiteren mit Xylol getränkten Biopsiekissen ab, um die 3D-Strukturen an Ort und Stelle zu halten, und schließen Sie die Kassette.
Wenn alle Proben übertragen wurden, legen Sie die Kassetten für 30 Minuten in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad, bevor Sie die Kassetten über Nacht in ein frisches 65 Grad Celsius Paraffinbad legen. Am nächsten Morgen fügen Sie flüssiges Paraffin zu einer 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform pro Probe hinzu und geben Sie eine in Paraffin eingebettete Probe in jede Form. Rühren Sie die Formen vorsichtig um, bis alle 3D-Strukturen auf den Boden fallen, und verwenden Sie eine 65 Grad Celsius warme feine Pinzette, um die 3D-Strukturen in der Mitte jeder Form zu positionieren.
Kühlen Sie die Form, bis das Paraffin eine dünne feste Schicht bildet, die die 3D-Struktur an Ort und Stelle sichert. Legen Sie eine Taschentuchkassette und geben Sie heißes Paraffin über die Form. Entfernen Sie die Form, wenn das Paraffin vollständig erstarrt ist.
Um kleine 3D-Zellkulturmodelle einzubetten, waschen Sie die 3D-Strukturen vorsichtig dreimal in einem Milliliter TBS pro Waschgang. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen so viel TBS wie möglich, ohne die Strukturen zu berühren, und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz zwei aus einem handelsüblichen Paraffin-Einbettungskit hinzu. Mischen Sie vorsichtig durch Klopfen und fügen Sie zwei Tropfen Reagenz hinzu, einen mit Klopfen, bis das Gel fest wird.
Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gel aus der Vertiefung der vormontierten Kassette aus dem Kit zu übertragen, und dehydrieren Sie die in das Gel eingebettete Probe mit 30-minütigen aufsteigenden Ethanol- und Xylol-Inkubationen in einem Abzug wie angegeben. Nach dem letzten Eintauchen in Xylol wird die Kassette über Nacht in ein 65 Grad Celsius Paraffinbad gegeben, bevor die in Paraffin eingebettete Probe mit einer feinen Pinzette in die Mitte einer mit flüssigem Paraffin beladenen 65 Grad Celsius erwärmten Einbettungsform überführt wird. Anschließend sichern Sie die 3D-Struktur mit einer weiteren Schicht Paraffin, wie es für die großen 3D-Zellkulturmodelle gezeigt wird.
Dreidimensionale Whole-Mount-Färbung und konfokale Mikroskopie liefern visuelle Informationen über die zelluläre Zusammensetzung und räumliche Position der 3D-Kulturmodelle bis zu einem Tiefenfeld von bis zu 200 Mikrometern. Die hohe Auflösung, die mit diesem Protokoll für 3D-Strukturen erhalten werden kann, ermöglicht die Anwendung von zellulären und subzellulären Segmentierungsalgorithmen zur Quantifizierung der Zellzahl und zur Detektion verschiedener Zellmarker innerhalb verschiedener Zellsubtypen. Die 3D-Analyse ganzer Halterungen kann auf visualisierte Zellen mit einer Tiefe von bis zu 200 Mikrometern angewendet werden, unabhängig von den gesamten Strukturen.
Im Gegenteil, die 2D-Schnittanalyse kann Einblicke in Zellen jeder Größe liefern.
Übersicht
Dieser Artikel stellt detaillierte Protokolle für die Färbung und abbildende Analyse mit subzellulärer Auflösung von fixierten dreidimensionalen (3D) Zellkulturmodellen in vitro vor, wie beispielsweise Organoiden und Sphäroiden. Die beschriebenen Methoden ermöglichen Forschenden die Untersuchung von 3D-Kulturen im Größenbereich von 100 µm bis zu mehreren Millimetern und erleichtern damit die zelluläre und subzelluläre Charakterisierung, die für die Erforschung von Entwicklungsvorgängen, Krankheitsmodellen, Wirkstoffentwicklung und regenerative Medizin unerlässlich ist. Die Protokolle umfassen sowohl die Immunfärbung ganzer Präparate mit optischer Klärung für die konfokale Mikroskopie als auch die Einbettung in Paraffin für die histologische und immunhistochemische Analyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Histologie
- Bildgebende Verfahren
- 3D-Zellkultur
Hintergrund
- 3D-Zellkultursysteme, einschließlich Organoiden und Sphäroiden, werden zunehmend zur Modellierung von Entwicklung und Krankheiten, für die Wirkstoffscreening sowie für die regenerative Medizin verwendet.
- Eine detaillierte zelluläre und subzelluläre Analyse dieser Modelle ist aufgrund ihrer Größe und Komplexität technisch anspruchsvoll.
- Standardisierte und robuste Protokolle sind erforderlich, um reproduzierbare und hochauflösende Bildgebung von 3D-Kulturen zu ermöglichen.
- Sowohl Analysen an Ganzpräparaten als auch an Schnittpräparaten liefern komplementäre Informationen zur Zellzusammensetzung und räumlichen Organisation.
Zweck der Studie
- Um umfassende, schrittweise Protokolle für die Färbung und Bildgebung fixierter dreidimensionaler in vitro Zellkulturmodelle bereitzustellen.
- Zur Ermöglichung der hochauflösenden zellulären und subzellulären Analyse von Organoiden und Sphäroiden unterschiedlicher Größen und Morphologien.
- Um eine reproduzierbare Probenvorbereitung für Analysen in Ganzpräparaten und paraffin-eingebetteten Schnitten zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Sorgfältige Gewinnung und Handhabung von 3D-Strukturen, um Schäden zu vermeiden.
- Ganzpräparat-Immunfärbung: Permeabilisierung, Blockierung, Inkubation mit primären und sekundären Antikörpern, Kernfärbung und optische Klärung.
- Paraffineinbettung: Dehydrierung, Eosin-Färbung, Xylol-Klärung, Einbetten in Paraffinformen und Schneiden für histologische bzw. immunhistochemische Färbungen.
- Konfokale Mikroskopie zur 3D-Bildgebung bis zu einer Tiefe von 200 µm und Anwendung von Segmentierungsalgorithmen für die quantitative Analyse.
Hauptergebnisse
- Die Protokolle ermöglichen eine robuste Färbung und Abbildung von 3D-Zellkulturmodellen mit einer Größe von 100 µm bis mehreren Millimetern.
- Die Ganzpräparat-Färbung in Kombination mit der konfokalen Mikroskopie ermöglicht eine hochauflösende Visualisierung der zellulären Zusammensetzung und räumlichen Anordnung bis zu einer Tiefe von 200 µm.
- Durch Einbetten in Paraffin und anschließendes Schneiden können Zellen in Strukturen beliebiger Größe detailliert analysiert werden.
- Die Methoden unterstützen die Quantifizierung der Zellanzahl und den Nachweis spezifischer Zellmarker innerhalb von Subtypen.
Schlussfolgerungen
- Die beschriebenen Protokolle bieten zuverlässige und komplementäre Ansätze zur zellulären und subzellulären Charakterisierung von 3D-In-vitro-Modellen.
- Diese Methoden sind breit anwendbar auf verschiedene Organoiden und Sphäroide, unabhängig von deren Herkunft oder Kulturbedingungen.
- Die Anwendung dieser Protokolle kann die Reproduzierbarkeit und Analysetiefe in der Forschung mit 3D-Zellkulturen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die hochauflösende Färbung und Bildgebung von 3D-Organoid- und Sphäroidmodellen behebt einen kritischen Engpass in der frühen Entdeckungsforschung und translationalen Forschung, indem sie die zelluläre und subzelluläre Charakterisierung komplexer In-vitro-Systeme ermöglicht. Diese Protokolle stützen die Vorhersagegenauigkeit in der Krankheitsmodellierung und in der Arzneimittelforschung, indem sie robuste, reproduzierbare Daten zur Zellzusammensetzung und räumlichen Organisation liefern. Ihre breite Anwendbarkeit über verschiedene 3D-Modelle hinweg fördert die standardisierte Auswertung über das gesamte Portfolio und eine risikoadjustierte Entscheidungsfindung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der zellulären Architektur und Markerexpression in krankheitsrelevanten 3D-Modellen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch die Visualisierung räumlicher Beziehungen und Zellsubtypen in Organoiden und Sphäroiden.
- Erleichtert die mechanistische Entschärfung von Risiken durch quantitative Segmentierung und Nachweis von Markern mit subzellulärer Auflösung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte dreidimensionale biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening und phänotypische Assays vor.
- Standardisiert Färbungs- und Bildgebungsaufarbeitungen, um die Reproduzierbarkeit und quantitative Vergleichbarkeit zwischen Experimenten sicherzustellen.
- Ermöglicht bildbasierte Hochdurchsatzanalysen, die für skalierbare Screenings und die Wiederverwendung der Plattform geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Verknüpft in-vitro-Befunde mit translationalen Biomarker-Strategien, indem sie die multiplexe Markerdetektion in 3D-Kontexten ermöglicht.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem robuste zelluläre und subzelluläre Analysen unterstützt werden.
- Verringert das translatorische Risiko, indem eine krankheitsrelevante Charakterisierung des Systems vor In-vivo-Studien sichergestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Protokolle integrieren sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung und unterstützen sowohl Ganzpräparat- als auch schnittbasierte Analysen für eine umfassende Charakterisierung von Modellen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen und die Aufklärung von Wegen durch Visualisierung der Zellzusammensetzung und räumlichen Organisation.
- Screening: Bereitstellung von assaysbereiten, reproduzierbaren 3D-Modellen mit quantitativen bildgebenden Ausgaben zur Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Liefert hochauflösende Messungen und Segmentierungsdaten zum Vergleich experimenteller Bedingungen und zum Nachweis von Zellmarkern.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarkerabstimmung und präklinische Kontinuität durch multiplexe Analysen in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten, breit anwendbaren Workflow für verschiedene Organoid- und Sphäroidmodelle über alle Forschungs- und Entwicklungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Charakterisierung dreidimensionaler Modelle.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Färbungs- und Bildgebungsaufarbeitungen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitalnutzungseffizienz, indem bereits früh im Entwicklungsprozess belastbare zelluläre Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten basierend auf datenreichen 3D-Modelldaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit 3D-Zellkulturen und fortgeschrittenen Bildgebungstechniken.
- Benötigt Zugang zu konfokaler Mikroskopie und Infrastruktur zur Bildanalyse für subzelluläre Auflösung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise bei Färbungs- und Bildgebungsprotokollen über mehrere Teams hinweg zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Eignet sich für eine breite Palette von Organoid- und Sphäroidmodellen mit unterschiedlichen Morphologien und Herkünften.
- Sorgfältige Handhabung und strikte Einhaltung des Protokolls sind entscheidend, um die Integrität der 3D-Struktur zu bewahren.
