Eine einfache und flexible Impfmethode zur genauen Beurteilung von Phänotypen von Arabidopsis und anderen Pflanzen bei Mehltauinfektionen

Echter Mehltau ist eine wichtige Pflanzenkrankheit. Die genaue Bestimmung des Krankheitsphänotyps erfordert eine gleichmäßige Inokulation des Erregers. Da bestehende Methoden ineffizient sind, haben wir dieses Protokoll entwickelt.

Unsere Sporenimpfmethode kann leicht eine gleichmäßige Impfung erreichen und ist einfach und skalierbar. Daher kann jedes Labor, das mit Mehltau arbeitet, diese Methode problemlos anwenden. Die Forscher können auch Mesh über einem Karton montieren und für die Sporenimpfung verwenden.

Wie man Sporen entfernt und durch das Netz bürstet, ist ein kritischer Schritt. Dies auf Video zu demonstrieren, könnte sehr hilfreich sein. Für dieses Protokoll erhalten Sie eine Rolle aus 50 Mikrometer Nylonmembrangewebe oder 48 Mikrometer Edelstahlgewebe.

Schneiden Sie großes, mitteldichtes Sperrholz in Stücke von 24,5X10 Zoll und 12X10 Zoll, um eine Impfbox herzustellen. Um einen abnehmbaren oberen Deckel mit einem Netz herzustellen, schneiden Sie den langen hölzernen quadratischen Dübel in zwei Sätze von 26 Zoll und 12,75 Zoll. Kleben und nageln Sie die vier Teile so, dass sie um die Box passen.

Nehmen Sie Acrylplatten und montieren Sie alle Acrylplatten mit acht Eckklemmen zu einer Box. Schneiden Sie ein 7X2 Zoll großes Fenster zum Öffnen auf der Vorderseite der Acrylplatte der Box. Um frische Mehltausporen als Impfung vorzubereiten, züchten Sie sechs bis acht Wochen lang in einer Wachstumskammer bei 22 Grad Celsius und 65% relativer Luftfeuchtigkeit saubere Arabidopsis-immungeschwächte Pad4-1-Mutantenpflanzen.

Züchten Sie die Pflanzen, um Infektionsphänotypen in Standardwohnungen zu bestimmen. Beimpfen Sie eine oder die Hälfte der pad4-1-Pflanzen, um ausreichend frische Mehltausporen aufzubauen. Wenn frische Sporen von infizierten Pflanzen verfügbar sind, bewegen Sie eine flache Pflanze für einen Infektionstest in die Impfbox in der Impfkammer.

Schneiden Sie 15 bis 20 stark infizierte Arabidopsis-Blätter und lassen Sie sie trocknen, wenn Kondenswasser vorhanden ist. Halten Sie ein bis zwei Blätter kopfüber mit einer langen Pinzette in einer Hand. Dann legen Sie beide Hände durch die Öffnung der Kammer und schlagen Sie sanft mit einer Schere auf den Arm der Pinzette, während Sie die Blätter langsam über das auf der Impfbox montierte Netz bewegen.

Bürsten Sie die Sporen mit feinen Kugelmixerbürsten durch die gesamte Netzoberfläche in verschiedene Richtungen, um die gleichmäßige Verteilung der Sporen auf die Pflanzen zu maximieren. Tupfen Sie das Netz einige Male vorsichtig mit den Bürsten, um die im Netz steckenden Sporen abzuschütteln. Sobald sich die Sporen abgesetzt haben, entfernen Sie die Wohnung mit den beimpften Pflanzen aus der Impfbox.

Decken Sie die Wohnung mit einer Kunststoffkuppel ab und legen Sie sie bei 22 Grad Celsius und 65% relativer Luftfeuchtigkeit in eine Wachstumskammer. Die Phänotypisierung der Krankheit kann 5 oder 8 bis 12 Tage nach der Impfung durchgeführt werden. Wandeln Sie Kartons in eine Impfbox um, indem Sie die Ober- und Unterseite der Box entfernen, die Ecke festkleben und ein 50-Mikrometer-Netz mit Klebstoff auf der Oberseite montieren.

Bewegen Sie die Wohnung mit den Pflanzen in die Impfkammer und stellen Sie die kleinere Impfbox auf die Wohnung, um die Pflanzen abzudecken. Dann entfernen und bürsten Sie die Sporen. Machen Sie eine Mini-Impfbox etwas größer als eine Petrischale.

Lagern Sie die Teller bis zum Gebrauch bei vier Grad Celsius im Kühlschrank. Schneiden Sie ein oder zwei vollständig expandierte Blätter von der Basis des Blattstiels für jede zu testende Pflanze. Führen Sie den Blattstiel der abgelösten Blätter in einem Winkel von 30 Grad in das Agarmedium ein.

Beimpfen Sie die Blätter in der Impfkammer und bewegen Sie die Platte mit dem Deckel in eine Wachstumskammer. Zur Beurteilung der Infektionsphänotypen werden die Blätter vier oder fünf Tage nach der Inokulation auf eine frische aseptische MS-Agarplatte übertragen. Schneiden Sie die Basis des Blattstiels ab, bevor Sie die Blätter in das frische Agarmedium einführen.

Beurteilen Sie die Krankheitsphänotypen acht oder neun Tage nach der Impfung. Die mikroskopische Analyse zeigte eine gleichmäßige Verteilung der Sporen auf den mikroskopischen Objektträgern auf der Unterseite der Wohnung. Die berechnete Dichte der Sporen, die nach Lichtimpfungen an sechs verschiedenen Orten verteilt waren, zeigte keine signifikanten Unterschiede.

Ähnliche Ergebnisse wurden nach starken Impfungen mit Sporen erzielt. Die Impfgleichmäßigkeit wurde 12 Tage nach schwerer Impfung zwischen verschiedenen Pflanzengenotypen untersucht. Die pad4-1-Pflanzen zeigten eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit im Vergleich zu Columbia 0, den Wildtyp-Pflanzen.

Die Verwendung ausreichender frischer Sporen, die etwa 10 Tage nach der Impfung an anfälligen Pflanzen produziert werden, ist wichtig, da frische Sporen leichter zu entfernen sind und eher eine Besiedlung etablieren. Echter Mehltau besiedelt nur pflanzliche Epidermiszellen. Die Isolierung von mit Mehltau infizierten Zellen durch Peeling der Epidermis oder Lasermikrodissektion würde eine gezieltere transkriptomische und proteomische Untersuchung der Wirtsreaktionen ermöglichen.

Diese Methode wird Forschern helfen, Phänotypen von Mehltauinfektionen effizienter zu bestimmen, und sollte daher effektivere funktionelle Studien zu pflanzlichen Mehltau-Interaktionen ermöglichen.