Name: Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Protokollierung zur Erzeugung retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen. Diese Methode maximiert die Ausbeute photorezeptorreicher Vorläuferzellen für Krankheitsmodellierung und Transplantation.

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Wir danken den Mitgliedern des Labors 502 für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise von der Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) und dem National Key R&D Program of China (2017YFA0105300) unterstützt.

Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission des Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, genehmigt. H9 hESCs wurden vom WiCell Research Institute gewonnen und gentechnisch zu tdTomato-markierten Zelllinien verändert.
1. Erzeugung menschlicher ROs
<ol><li>Kultur der hESCs unter feederfreien Bedingungen.<ol><li>Beschichten Sie eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml 0,1 mg/ml Reagenz A (Table of Materials) bei 37 °C für mindestens eine halbe Stunde gemäß den Anweisungen des Herstellers. Ein Aliquot von 1x106 hESC auftauen. HINWEIS: Bereiten Sie 3 ml vorgewärmtes Reagenz B (Tabelle der Materialien) vor und überführen Sie die kryokonservierten Zellen (1 ml) in 3 ml frisches Medium. Pipettieren Sie die hES-Zellen nicht zu einzelnen Zellen.</li>
		<li>Bei 200 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Säen Sie die Zellen mit 2 ml Reagenz B in die mit Reagenz A beschichtete Platte und wechseln Sie täglich 2 ml Reagenz B. Durchgangszellen bei Erreichen einer Konfluenz von etwa 80% (normalerweise um 4 Tage).</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 0<ol><li>Dissoziieren Sie hES-Zellen zu einer Einzelzellsuspension unter Verwendung von Medium I (Tabelle 1). Bereiten Sie Medium I vor, indem Sie Folgendes mischen: 20% (v/v) KnockOut-Serumersatz (KSR), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäurenlösung (NEAA), 1 mM Pyruvat, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (PS), 0,1 mM β-Mercaptoethanol und Glasgows Eagle's Minimal Essential Medium (GMEM). HINWEIS: Vor Beginn der Dissoziation das Medium I vorbereiten und 12 ml Medium I mit 20 μM Y-27632 in eine 10 cm große Petrischale, 500 μL Reagenz C (Materialtabelle) mit 0,05 mg/ml Reagenz D (Materialtabelle) und 20 μM Y-27632 in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen. Führen Sie die obigen Schritte im Dunkeln durch, da die Komponente IWR1e in Medium I lichtempfindlich ist.</li>
		<li>Waschen Sie die hESCs mit vorgewärmtem 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzpuffer (DPBS) von Dulbecco.</li>
		<li>Das vorbereitete 500 μL Reagenz (im 1,5 ml) Röhrchen zugeben und die hES-Zellen 3,5 min bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.</li>
		<li>Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Seite und den Boden der Platte für einige Sekunden streichen und 500 μL des vorbereiteten Mediums I aus der Petrischale in die hESC-Platte geben. HINWEIS: Bereiten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit 900 μL 1x DPBS vor und verwenden Sie ein Hämozytometer zur Zellzählung.</li>
		<li>Ernten Sie die Zellen in einem neuen 1,5-ml-Röhrchen und pipetten Sie die Zellsuspension nach oben und unten, nehmen Sie dann 100 μL aus dem Röhrchen heraus und fügen Sie dann 900 μL DPBS zur Zellzählung in das Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Die linke 900 μL Zellsuspension wird dispergiert und dann die Zellen mit vorbereitetem Medium I in der Petrischale auf 9 x 104 Zellen/ml verdünnt. HINWEIS: Das gesamte Volumen des Mediums beträgt 12 ml; Insgesamt werden 1,08 x 106 Zellen benötigt.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht haftenden 96-Well-Platte mit V-Boden (Table of Materials) hinzu. HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zeit zu verkürzen und sicherzustellen, dass jede Vertiefung eine äquivalente Zellzahl enthält. Schütteln Sie die Petrischale jedes Mal, bevor Sie 100 μL Portionen entfernen. Wichtig ist, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind.</li>
		<li>Die 96-Well-Platte in einem Low-Speed-Shaker 5 min lang leicht herunterdrehen und dann bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. HINWEIS: Halten Sie den Teller dunkel. Legen Sie den Tag als Tag 0 fest.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2<ol><li>Fügen Sie 1% Reagenz A hinzu (Tabelle der Materialien). Reagenz A (Proteinkonzentration von 10 mg/ml) wird durch Zugabe von 133,4 μL Reagenz A in 2 ml Medium I hergestellt. HINWEIS: Reagenz A vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C halten, um ein vollständiges und gleichmäßiges Schmelzen zu erreichen. Bitte beachten Sie die Produktinformationen und suchen Sie die Katalognummer und die Chargennummer auf der offiziellen Website des Unternehmens, um die Proteinkonzentration von Reagenz A zu erhalten, da jede Flasche Reagenz A eine andere Proteinkonzentration aufweist. Wenn die Proteinkonzentration niedrig ist, wäre ein erhöhtes Volumen von Reagenz A hilfreich.</li>
		<li>Geben Sie 20 μL des vorbereiteten Reagenz A in jede Vertiefung und pipettieren Sie zweimal in der Mitte, um die toten Zellen zu streuen. HINWEIS: Bewahren Sie das Reagenz A und die 96-Well-Platte unter kühlen Bedingungen auf und führen Sie alle Schritte auf Eis aus. Stellen Sie den Teller dunkel.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2-12<ol><li>Reinigen Sie den Boden der 96-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 bis Tag 6. An Tag 6 wechseln Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie 58 μL des Mediums aus jeder Vertiefung entfernen und 60 μL Medium I hinzufügen. HINWEIS: Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Halbmediumwechsel abzuschließen. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig durch, um sicherzustellen, dass keine Zellpellets aus dem Bohrloch entfernt werden. Das Medium in eine saubere 10 cm Petrischale einsaugen. Wenn sich Zellpellets darin befinden, fügen Sie sie wieder der 96-Well-Platte hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 12- 18<ol><li>Ändern Sie das Medium auf Medium II (Tabelle 1) an Tag 12. Medium II wird unter Verwendung von 1% (v/v) Reagenz A hergestellt, indem Folgendes gemischt wird: 10% fetales Rinderserum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM Pyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 100 nM SAG-Dihydrochlorid und GMEM. Lagern Sie es unter kühlen und dunklen Bedingungen.</li>
		<li>Ernten Sie die Zellpellets in einem 15-ml-konischen Röhrchen von der 96-Well-Platte und lassen Sie die Pellets 5 Minuten bei Raumtemperatur auf natürliche Weise absetzen. HINWEIS: Entfernen Sie das Medium und die Pellets vorsichtig unter der Oberfläche, um Blasen zu vermeiden.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand, während Sie sich um die Organoide kümmern. Die Zellaggregate werden in eine 10 cm lange Suspensionsschale überführt, die 18 mL des vorbereiteten Mediums II mit Reagenz A enthält. HINWEIS: Geben Sie das vorbereitete Medium II nicht vorher in die 10 cm Schüssel, da das Reagenz A bei 4 °C stehen sollte.</li>
		<li>Bei 37 °C und 5% CO2 bis zum 18. Tag inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Ab Tag 18<ol><li>Ändern Sie das Medium auf Medium III (Tabelle 1). Bereiten Sie Medium III unter dunklen Bedingungen vor, indem Sie Folgendes mischen: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM Retinsäure (RA), 100 μM Taurin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 1:1 Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM)/Nährstoffgemisch F-12.</li>
		<li>Am Tag 18, wenn ein halbtransparentes optisches Vesikel erzeugt wird, schneiden Sie die Organoide mit einem mikrochirurgischen Messer. HINWEIS: Spalten Sie das Organoid, normalerweise in vier Stücke, in einer Petrischale mit Medium II. Jedes Stück sollte in den folgenden Wochen zu einem intakten Sehbecher heranwachsen.</li>
		<li>Aggregieren Sie alle Pellets in der Mitte der Schale. Ernten Sie die Zellen in ein 15 ml konisches Falkenröhrchen und lassen Sie es natürlich absetzen. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. HINWEIS: Aufgrund ihrer Größe können Organoide in der Mitte aggregiert werden, indem die Petrischale einige Male in eine Richtung um 90° auf einer horizontalen Ebene gedreht wird.</li>
		<li>Suspendieren und dispergieren Sie die Pellets in zwei 10-cm-Petrischalen mit 18 ml Medium III pro Schale und geben Sie die Schalen vorsichtig in den Inkubator, um eine Zellaggregation zu vermeiden. Setzen Sie die Kultur in Medium III bei 37 °C und 5% CO2 fort und wechseln Sie das Medium wöchentlich. Die CRX, die nach Tag 45 und bis Tag 120 exprimiert wurde, konnten wir das Out-Segment des Photorezeptors nachweisen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse menschlicher ROs
<ol><li>FACS-Analyse<ol><li>Setzen Sie drei CRX-tdTomato- und drei H9 ES-abgeleitete Organoide aus den Schalen zusammen, indem Sie die geschnittenen 1-ml-Spitzen verwenden. Waschen Sie die Organoide mit 1 ml vorgewärmtem DPBS (Raumtemperatur).</li>
		<li>Bereiten Sie den Verdauungspuffer vor, indem Sie 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung mit 0,05 mg/ml Reagenz D mischen.</li>
		<li>Die Organoide werden mit dem vorbereiteten Verdauungspuffer für 8 min bei 37 °C in einzelne Zellen dissoziiert. Dann fügen Sie das gleiche Volumen DPBS mit 10% FBS und 0,05 mg / ml Reagenz D hinzu, um die Reaktion zu inaktivieren.</li>
		<li>Suspendieren und streuen Sie die Zellen leicht und filtern Sie dann mit einem 100-μm-Zellsieb und verwenden Sie ein Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortiersystem (FACS) bei 561 nm Anregungslaserlinie und 780/60-Filter, um die positiven CRX-tdTomato-Signale zu analysieren. HINWEIS: CRX exprimiert sich zunächst am Tag 45 und nimmt mit der Reifung der Organoide zu. Zehntausend Zellen werden für jeden Test verwendet, für jeden Zeitpunkt werden mindestens drei Wiederholungen abgeschlossen.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von ROs<ol><li>Bereiten Sie die lebensfähigen Organoide zufällig für die Bildgebung vor. HINWEIS: Stellen Sie die Parameter ein und verwenden Sie dieselben Filter und Parameter für alle Fluoreszenzintensitätsmonitore.</li>
		<li>Erfassen Sie Bilder und analysieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität mit geeigneter Software (z. B. ImageJ).</li>
		<li>Importieren Sie die Bilder und konvertieren Sie sie dann mithilfe von Image | in 8-Bit. Typ.</li>
		<li>Passen Sie den Schwellenwert mithilfe der Standardparameter von Image | Anpassen | Schwellenwert.</li>
		<li>Bestimmen Sie den gemessenen Bereich, und werten Sie dann den Grauwert mithilfe von Analyze | Messen. HINWEIS: Die Mittelwerte im Ergebnispanel sind die mittlere Fluoreszenzintensität der gemessenen Fläche.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

Die retinale Organoiddifferenzierung ist eine wünschenswerte Methode zur Erzeugung reichlich funktionsfähiger Netzhautzellen. Die RO ist ein Verbund aus verschiedenen Netzhautzellen, wie Ganglienzellen, bipolaren Zellen und Photorezeptoren, die von pluripotenten Stammzellen in Richtung der neuronalen Netzhaut 4,5,8,9 erzeugt werden. Obwohl konfluente ROs geerntet werden könnten, ist es zeitaufw...

Pluripotente Stammzellen (PSCs) zeichnen sich durch ihre Selbsterneuerung und die Fähigkeit aus, sich in alle Arten von Körperzellen zu differenzieren. Daher sind Organoide, die von PSCs abgeleitet sind, zu einer wichtigen Ressource in der Forschung der regenerativen Medizin geworden. Die Netzhautdegeneration ist durch den Verlust von Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und des retinalen Pigmentepithels gekennzeichnet. Der retinale Zellersatz könnte eine ermutigende Behandlung für diese Krankheit sein. Es ist jedoch nicht möglich, menschliche Netzhäute für die Erforschung und Therapie von Krankheiten zu erhalten. Daher sind retinale Organoide (ROs), die von PSCs abgeleitet sind und die mehrschichtige native Netzhautzellen effektiv und erfolgreich rekapitulieren, für die Grundlagen- und translationale Forschung von Vorteil 1,2,3. Unsere Forschung konzentriert sich auf die RO-Differenzierung, um ausreichend und qualitativ hochwertige Zellen für die Untersuchung der Netzhautdegenerationbereitzustellen 4.
Methoden zur Differenzierung von ROs entstehen kontinuierlich, wobei das Sasai-Labor 2012 eine dreidimensionale (3D) Suspensionsdifferenzierung entwickelt hat5. Wir haben den CRX-tdTomato-Tag in die menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt, um die Photorezeptor-Vorläuferzellen spezifisch zu verfolgen, und modifizierten die Methode durch den Zusatz von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten der Wnt-, TGF-β- und BMP-Signalwege6. Es wurde gezeigt, dass COCO die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen effizient verbessert 6,7.
Insgesamt haben wir durch die Modifikation der klassischen Differenzierungsmethode ein zugängliches Protokoll entwickelt, um reichlich Photorezeptorvorläufer und Zapfen aus menschlichen ROs zu gewinnen, um die mit den Photorezeptoren verbundenen Netzhauterkrankungen durch Laboruntersuchungen und für die weitere klinische Anwendung / Transplantation zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R& D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>DAN Domänenfamilie von BMP-Antagonisten</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS), qualifiziert für humane embryonale Stammzellen</td><td>Biologische Industrie</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz-Multispezies</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100X)</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-Platte</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>Zellaggregation in 1.2.7</td></tr><tr><td>Pyruvat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel in 1.1.1</td></tr><tr><td>Reagenz B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>mTeSR-E8 , PSCs Basalmedium in 1.1.2</td></tr><tr><td>Reagenz C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express in 1.2</td></tr><tr><td>Reagenz D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>DNase I , in 1.2</td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 Supplement (100X), Flüssig, geschmeidig in Medum III</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Organoid-Dissoziation in 2.1.3</td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td><td>Sigma</td><td>681669</td><td>Wnt-Inhibitor</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

gerichtete induktion retinaler organoide aus humanen pluripotenten stammzellen

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Die retinale Zelltransplantation ist ein vielversprechender Therapieansatz, der die Netzhautarchitektur wiederherstellen und die Sehfähigkeit der degenerierten Netzhaut stabilisieren oder sogar verbessern könnte. Dennoch steht der Fortschritt in der Zellersatztherapie derzeit vor der Herausforderung, eine handelsübliche Quelle für qualitativ hochwertige und standardisierte menschliche Netzhäute zu benötigen. Daher ist ein einfaches und stabiles Protokoll für die Experimente erforderlich. Hier entwickeln wir ein optimiertes Protokoll, basierend auf einer selbstorganisierenden Methode unter Verwendung von exogenen Molekülen und Reagenz A sowie manueller Exzision zur Erzeugung der dreidimensionalen menschlichen Netzhautorganoide (RO). Die von humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) abgeleiteten RO exprimieren spezifische Marker für Photorezeptoren. Mit der Zugabe von COCO, einem multifunktionalen Antagonisten, wird die Differenzierungseffizienz von Photorezeptorvorläufern und Zapfen signifikant erhöht. Die effiziente Nutzung dieses Systems, das die Vorteile von Zelllinien und Primärzellen hat, und ohne die damit verbundenen Beschaffungsprobleme, könnte konfluente Netzhautzellen, insbesondere Photorezeptoren, produzieren. Somit bietet die Differenzierung von PSCs zu RO eine optimale und biorelevante Plattform für Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und Zelltransplantation.

Die schematische Darstellung zeigt das Differenzierungsprotokoll zur Verbesserung von Vorläuferzellen mit COCO (Abbildung 1). Von PSC bis ROs können zahlreiche Details zu Ergebnisschwankungen führen. Es wird empfohlen, jeden Schritt und sogar die Katalognummer und Chargennummer jedes Mediums aufzuzeichnen, um den gesamten Vorgang zu verfolgen.
Hier stellen wir Hellfeldbilder für die Tage 6, 12, 18 und 45 bereit (Abbildung 2). An Tag 6...

Mit einer selbstorganisierenden Methode entwickeln wir ein Protokoll mit dem Zusatz von COCO, das die Bildung von Photorezeptoren signifikant erhöhen könnte.

Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Dies ist ein Modell für Netzhauterkrankungen und emuliert die in vivo Netzhaut. Es könnte gewissermaßen Tierversuche ersetzen. Das Protokoll ist für die Qualität und Quantität der Photorezeptorvorläufer in den retinalen Organoiden optimiert, und der Photorezeptor ist der Schlüssel zu mehreren irreversiblen Blindheitszuständen.Beginnen Sie mit der Kultivierung der menschlichen embryotischen Stammzellen oder hES-Zellen unter feederfreien Bedingungen. Beschichten Sie dazu eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter Reagenz A und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine halbe Stunde. Ein Aliquot von einer Million hESCs auftauen und bei 200 xg fünf Minuten zentrifugieren.Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, säen Sie die Zellen zusammen mit zwei Milliliter Reagenz B in die zuvor beschichtete Platte.Durchlasse die Zellen nach Erreichen einer Konsistenz von etwa 80% nach etwa vier Tagen. Nach Erreichen des Zusammenflusses waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie sie in 500 Mikroliter frisch zubereitetes Reagenz. Dann inkubieren Sie die Zellen für 3,5 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Seite und den Boden der Platte für einige Sekunden streichen, und fügen Sie 500 Mikroliter des vorbereiteten Mediums hinzu. Ernten Sie die abgelösten Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab. Für die Zellzählung fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension zu 900 Mikrolitern DPBS hinzu.Die 900 Mikroliter der verbleibenden Zellsuspension werden mit einer mittleren in der Petrischale verdünnt, um neunmal 10 bis vierte Leistungszellen pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnte Zellsuspension zu jeder Vertiefung einer nicht adhärenten 96-Well-Platte mit V-Boden hinzu. Drehen Sie die Platte fünf Minuten lang leicht auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit herunter und inkubieren Sie sie bis zum zweiten Tag bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Am zweiten Tag fügen Sie 20 Mikroliter 1% Reagenz A zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und pipetten zweimal in der Mitte, um die toten Zellen zu streuen. Reinigen Sie den Boden der Platte, bevor Sie ihn bis zum sechsten Tag bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie am sechsten Tag 58 Mikroliter des Mediums durch 60 Mikroliter frisches Medium und setzen Sie die Inkubation fort.Am Tag 12 ernten Sie die Zellpellets von der 96-Well-Platte in einem 15-Milliliter-Konikusrohr und lassen Sie die Pellets fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf natürliche Weise absetzen. Wenn sich die Pellets absetzen, entfernen Sie den Überstand, ohne die Organoide zu stören, und übertragen Sie die Zellaggregate in eine 10-Zentimeter-Suspensionsschale, die 18 Milliliter Medium zwei mit Reagenz A enthält.Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zum 18. Tag. Bestätigen Sie an Tag 18 die Erzeugung eines halbtransparenten optischen Vesikels in der Schale und schneiden Sie die erzeugten Organoide mit einem mikrochirurgischen Messer.Aggregieren Sie alle geschnittenen Pellets in der Mitte der Schale. Dann ernten Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-konisches Falcon-Röhrchen. Wenn sich die Zellen abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in zwei 10-Zentimeter-Petrischalen mit 18 Milliliter Medium, drei pro Schale.Geben Sie das Geschirr vorsichtig in den Inkubator, um eine Zellaggregation zu vermeiden. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen fort und wechseln Sie das Medium wöchentlich. Analysieren Sie den CRX-Ausdruck nach Tag 45 bis Tag 120.In dieser repräsentativen Analyse werden verschiedene Stadien der menschlichen Netzhauterzeugung dargestellt. Am sechsten Tag erschienen Organoide als Aggregat dichter Verbindungen in einem hellen Rand mit einem Durchmesser von etwa 600 Mikrometern. An Tag 12 fand die erste Erzeugung der optischen vesikelartigen Strukturen statt.Die Organoide ohne richtige vesikelartige Architektur wurden vor der Kultivierung in einer Petrischale am 18. Tag verworfen. Am 30. Tag der Kultur war die vesikelartige Architektur offensichtlicher, und minderwertige ROs konnten leicht unterschieden und entfernt werden. Ab Tag 45 exprimierten die Organoide verschiedene Marker von Photorezeptorvorläufern wie CRX, RCVRN und OTX2.Durch die Spaltung der überlegenen retinalen Organoide wird die Differenzierungseffizienz deutlich verbessert, und es konnten mehr als 100 überlegene Organoide aus 96 Platten geerntet werden.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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