Gerichtete Induktion retinaler Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dies ist ein Modell für Netzhauterkrankungen und emuliert die in vivo Netzhaut. Es könnte gewissermaßen Tierversuche ersetzen. Das Protokoll ist für die Qualität und Quantität der Photorezeptorvorläufer in den retinalen Organoiden optimiert, und der Photorezeptor ist der Schlüssel zu mehreren irreversiblen Blindheitszuständen.

Beginnen Sie mit der Kultivierung der menschlichen embryotischen Stammzellen oder hES-Zellen unter feederfreien Bedingungen. Beschichten Sie dazu eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit einem Milliliter von 100 Mikrogramm pro Milliliter Reagenz A und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine halbe Stunde. Ein Aliquot von einer Million hESCs auftauen und bei 200 xg fünf Minuten zentrifugieren.

Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, säen Sie die Zellen zusammen mit zwei Milliliter Reagenz B in die zuvor beschichtete Platte.Durchlasse die Zellen nach Erreichen einer Konsistenz von etwa 80% nach etwa vier Tagen. Nach Erreichen des Zusammenflusses waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie sie in 500 Mikroliter frisch zubereitetes Reagenz. Dann inkubieren Sie die Zellen für 3,5 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Seite und den Boden der Platte für einige Sekunden streichen, und fügen Sie 500 Mikroliter des vorbereiteten Mediums hinzu. Ernten Sie die abgelösten Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen und pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab. Für die Zellzählung fügen Sie 100 Mikroliter Zellsuspension zu 900 Mikrolitern DPBS hinzu.

Die 900 Mikroliter der verbleibenden Zellsuspension werden mit einer mittleren in der Petrischale verdünnt, um neunmal 10 bis vierte Leistungszellen pro Milliliter zu erreichen. Fügen Sie 100 Mikroliter verdünnte Zellsuspension zu jeder Vertiefung einer nicht adhärenten 96-Well-Platte mit V-Boden hinzu. Drehen Sie die Platte fünf Minuten lang leicht auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit herunter und inkubieren Sie sie bis zum zweiten Tag bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.

Am zweiten Tag fügen Sie 20 Mikroliter 1% Reagenz A zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und pipetten zweimal in der Mitte, um die toten Zellen zu streuen. Reinigen Sie den Boden der Platte, bevor Sie ihn bis zum sechsten Tag bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie am sechsten Tag 58 Mikroliter des Mediums durch 60 Mikroliter frisches Medium und setzen Sie die Inkubation fort.

Am Tag 12 ernten Sie die Zellpellets von der 96-Well-Platte in einem 15-Milliliter-Konikusrohr und lassen Sie die Pellets fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf natürliche Weise absetzen. Wenn sich die Pellets absetzen, entfernen Sie den Überstand, ohne die Organoide zu stören, und übertragen Sie die Zellaggregate in eine 10-Zentimeter-Suspensionsschale, die 18 Milliliter Medium zwei mit Reagenz A enthält.Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zum 18. Tag. Bestätigen Sie an Tag 18 die Erzeugung eines halbtransparenten optischen Vesikels in der Schale und schneiden Sie die erzeugten Organoide mit einem mikrochirurgischen Messer.

Aggregieren Sie alle geschnittenen Pellets in der Mitte der Schale. Dann ernten Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-konisches Falcon-Röhrchen. Wenn sich die Zellen abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in zwei 10-Zentimeter-Petrischalen mit 18 Milliliter Medium, drei pro Schale.

Geben Sie das Geschirr vorsichtig in den Inkubator, um eine Zellaggregation zu vermeiden. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen fort und wechseln Sie das Medium wöchentlich. Analysieren Sie den CRX-Ausdruck nach Tag 45 bis Tag 120.

In dieser repräsentativen Analyse werden verschiedene Stadien der menschlichen Netzhauterzeugung dargestellt. Am sechsten Tag erschienen Organoide als Aggregat dichter Verbindungen in einem hellen Rand mit einem Durchmesser von etwa 600 Mikrometern. An Tag 12 fand die erste Erzeugung der optischen vesikelartigen Strukturen statt.

Die Organoide ohne richtige vesikelartige Architektur wurden vor der Kultivierung in einer Petrischale am 18. Tag verworfen. Am 30. Tag der Kultur war die vesikelartige Architektur offensichtlicher, und minderwertige ROs konnten leicht unterschieden und entfernt werden. Ab Tag 45 exprimierten die Organoide verschiedene Marker von Photorezeptorvorläufern wie CRX, RCVRN und OTX2.

Durch die Spaltung der überlegenen retinalen Organoide wird die Differenzierungseffizienz deutlich verbessert, und es konnten mehr als 100 überlegene Organoide aus 96 Platten geerntet werden.