Name: Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die Mikrokristall-Elektronenbeugung für die Strukturaufklärung kleiner Moleküle mit Nanokristallen. Diese Methode ermöglicht Forschern die schnelle dreidimensionale Strukturbestimmung.

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Das Gonen-Labor wird mit Mitteln des Howard Hughes Medical Institute unterstützt. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health P41GM136508 unterstützt.

1. Vorbereitung von niedermolekularen Proben
<ol><li>Übertragen Sie eine kleine Menge (0,01 - 1 mg) Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.</li>
	<li>Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben zu Pulvern, bevor Sie mit Methode 1 (Schritt 3) oder 2 (Schritt 4) versuchen. Anmerkungen: Für Proben, die in Flüssigkeit aufgelöst sind, kann die nachstehende Methode 3 (5.X) verwendet werden</li>
</ol>2. Vorbereiten von TEM-Gittern
HINWEIS: Bei einigen TEMs mit Autoloader-Systemen müssen die Gitter vor dem Laden in die TEM-Säule abgeschnitten und in eine Kassette gelegt werden. Beim Clipping wird das 3-mm-TEM-Gitter physisch in einem Metallring befestigt, den der Autoloader manipulieren kann. Dieser Schritt und die folgenden Schritte können entweder mit normalen TEM-Gittern oder mit beschnittenen TEM-Gittern durchgeführt werden. Bei diesen Experimenten ist es oft einfacher, die Raster zu manipulieren, wenn sie im Voraus beschnitten wurden.
<ol><li>Wickeln Sie Plastikfolie um ein Ende einer Glasabdeckung.</li>
	<li>Legen Sie die TEM-Gitter mit der Carbonseite nach oben auf die Folie auf der Oberseite des Deckschlittens. Identifiziere die beiden Seiten des Gitters unter einer Lampe. Die Kupferseite glänzt und erscheint metallisch, während die Carbonseite eine triste, braune Farbe hat (Abbildung 1C,D). Bei geclippten Gittern sollte die Carbonseite zur flachen Fläche des Cliprings zeigen.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger mit Gittern in die Glühentladungskammer. Glow entlädt die Deckseite für ca. 30 s mit der negativen Einstellung bei 15 pA. Bewahren Sie die Gitter auf dem Deckobjektträger in einer mit Filterpapier ausgelegten Glas-Petrischale auf, bevor Sie die Probe in die Gitter geben.</li>
</ol>3. Auftragen der Probe auf Gitter durch Erzeugen eines homogenen feinen Pulvers (Methode 1)
<ol><li>Entfernen Sie ein glimmentladenes TEM-Gitter mit einer Pinzette von der abgedeckten Petrischale. Legen Sie das Gitter mit der Kohleseite nach oben auf ein kreisförmiges Filterpapier.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel einen sehr kleinen Messlöffel Pulver (ca. 0,1 mg) und legen Sie ihn auf ein kleines, quadratisches Glasdeckglas direkt neben dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier. Legen Sie einen weiteren kleinen quadratischen Glasschieber oder Deckglas auf das Pulver.</li>
	<li>Reiben Sie die beiden Glasobjektträger vorsichtig mit den Fingern aneinander, um ein feines Pulver herzustellen.</li>
	<li>Winkeln Sie die Deckgläser an und positionieren Sie sie knapp über dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier und reiben Sie die Deckgläser nur wenige cm über dem glimmentladenen TEM-Gitter weiter aneinander (Abbildung 1).</li>
	<li>Beobachte, ob das Pulver in Richtung des Gitters fällt. Decken Sie das fein gemahlene Pulver auf, indem Sie eines der beiden Glasdeckgläser entfernen. Bürsten Sie das feine Pulver vorsichtig mit einem Stück Filterpapier vom Deckglas auf das TEM-Gitter (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Auftragen der Probe auf Gitter durch Anwendung der "Schüttel"-Methode (Methode 2)
<ol><li>Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Gitter und lassen Sie es in das Fläschchen oder die Tube mit der Pulverprobe fallen. Verschließen Sie die Durchstechflasche mit der Plastikkappe, um sicherzustellen, dass beim Schütteln kein Material austritt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Durchstechflasche in die Hand und schütteln Sie die Durchstechflasche so, dass sich sowohl das Pulver als auch das Gitter für ca. 10 - 30 s bewegen.</li>
	<li>Entleeren Sie den Inhalt der Durchstechflasche auf ein kreisförmiges Filterpapier. Fassen Sie das Gitter an einer Kante und klopfen Sie vorsichtig auf die Gitterkante des Filterpapiers, um überschüssiges Material vom Gitter zu entfernen. HINWEIS: Abhängig von der Art der Durchstechflasche und der Größe kann man auch eine Pinzette verwenden, um das TEM-Gitter zu entfernen, ohne den Inhalt zu entleeren.</li>
</ol>5. Aufbringen der Probe auf Gitter mit der Verdampfungsmethode (Methode 3)
<ol><li>Legen Sie ein Gitter (abgeschnitten oder nicht) mit der Kohleseite nach oben und der Kupferseite nach unten auf die Mitte eines kreisförmigen Stücks Filterpapier.</li>
	<li>Tragen Sie mit einer gasdichten 10-μl-Spritze einen kleinen Tropfen (ca. 1 - 3 μl) der gelösten Verbindung auf die Kohlenstoffseite des Gitters auf.</li>
	<li>Bewegen Sie das Filterpapier mit den Gittern vorsichtig in eine Vakuumtrocknungskammer. Decken Sie die Kammer ab und schalten Sie den Staubsauger ein. Lassen Sie die Gitter bis zu einem Tag unter Vakuum trocknen.</li>
	<li>Schalten Sie das Vakuum aus und lassen Sie die Kammer 5 Minuten lang entlüften. Durch das Entlüften der Kammer wird verhindert, dass sich die Gitter bewegen oder wegfliegen, wenn sie nicht abgedeckt wird.</li>
</ol>6. Einfrieren und Laden von Gittern in das TEM
<ol><li>Fassen Sie den Rand des TEM-Gitters mit einer Pinzette und achten Sie darauf, dass die Spitzen keines der Gitterquadrate durchstechen. Heben Sie das Gitter 1 - 2 cm über das Filterpapier an und winkeln Sie das Gitter im 90°-Winkel zum darunter liegenden Papier an. Klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, während Sie das Gitter fest zupfen, um loses Puder zu entfernen.</li>
	<li>Frieren Sie das Gitter ein, indem Sie die Spitze der Pinzette mit dem Gitter von Hand direkt in einen Behälter für flüssigen Stickstoff bewegen. Dieser Behälter ist in der Regel die Gitterladestation für das TEM, kann aber auch jeder sichere Behälter, wie z. B. eine sichere Thermoskanne mit flüssigem Stickstoff, für den Transfer oder die Lagerung geeignet sein. Flüssiger Stickstoff hat -196 °C.</li>
	<li>Warten Sie, bis das Gitter und die Pinzette aufhören zu kochen, bevor Sie weitere Manipulationen vornehmen.</li>
	<li>Legen Sie das Gitter unter flüssigem Stickstoff oder in Stickstoffdämpfen so in den Probenhalter, dass die Kohlenstoffseite so ausgerichtet ist, dass die Probe vor der Kohlenstoffträgerfolie vom Strahl getroffen wird.</li>
	<li>Legen Sie den Probenhalter in das TEM und stellen Sie sicher, dass das Gitter jederzeit auf Flüssigstickstofftemperatur gehalten wird.<ol><li>Legen Sie bei Autoloader-Systemen die abgeschnittenen Gitter in eine Kassette in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Behälter. Diese Kassette wird in einen Transportbehälter überführt, der es der Autoloader-Robotik ermöglicht, die Kassette aufzunehmen, während die Proben sicher für den Transport zwischen dem Autoloader und der Säule aufbewahrt werden.</li>
		<li>Befestigen Sie das Gitter bei TEM-Setups mit seitlichem Eingang an einem handelsüblichen TEM-Halter mit seitlichem Eingang. Diese Halter verfügen über einen Probenvorbereitungsbehälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, um eine Übertragung des Gitters auf den Halter zu ermöglichen, ohne die Probe zu erwärmen. Der Side-Entry-Halter wird direkt in das TEM eingeführt, wobei die Probe am Ende gesichert ist.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Sammeln von MicroED-Daten
<ol><li>Lokalisieren und Screening von Nanokristallen<ol><li>Öffnen Sie die TEM-Säulenventile. Stellen Sie die Vergrößerung mit den Handpulten auf die geringstmögliche Vergrößerung ein. Finden Sie den Strahl, indem Sie den Intensitätsregler an den Handpulten so einstellen, dass ein runder, heller Bereich auf dem fluoreszierenden Bildschirm sichtbar ist.</li>
		<li>Nehmen Sie einen Rasteratlas mit geringer Vergrößerung (50 - 300x) mit geeigneter Software14, 15 und 16 auf (Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop sowohl für die Bildgebung mit niedriger als auch für die hohe Vergrößerung gut ausgerichtet ist, bevor Sie hochauflösende MicroED-Daten erfassen.</li>
		<li>Identifizieren Sie Gitterquadrate ohne gebrochenen Kohlenstoff und ein sichtbares schwarzes oder dunkles Material/Körner auf der Folie (Abbildung 2). Navigieren Sie durch das Gitter, entweder physisch mit dem Joystick auf den Handfeldern oder virtuell auf dem gesammelten Atlas, um nach Gitterquadraten zu suchen, die nicht zerbrochen sind und Mikrokristalle enthalten.</li>
		<li>Fügen Sie den Mittelpunkt jedes dieser Quadrate zu einer Liste von Rasterpositionen hinzu, die untersucht werden sollen. Diese Positionen können zu einem Notebook, in der Mikroskop-Benutzeroberfläche oder in der Mikroskop-Automatisierungssoftware hinzugefügt werden.</li>
		<li>Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 500-1.300x und passen Sie die euzentrische Höhe an jeder gespeicherten Rasterposition an und aktualisieren Sie den gespeicherten Z-Wert auf die in 7.1.4 angegebenen Positionen.</li>
		<li>Suchen Sie entweder auf dem fluoreszierenden Bildschirm oder auf einer schnellen Kamera mit dieser höheren Vergrößerung nach kleinen schwarzen Flecken/Körnern auf dem Raster. Eine gute Probe mit oft scharfen Kanten bei hoher Vergrößerung, die auf kristalline Ordnung hindeuten.</li>
		<li>Bewegen Sie einen lokalisierten Potentialkristall in die Mitte des Bildschirms und erhöhen Sie die Vergrößerung so, dass das TEM in den Modus mit hoher Vergrößerung wechselt. HINWEIS: Dies wird bei verschiedenen Instrumenten entweder als Modus mit hoher Vergrößerung, Zoom2 oder SA bezeichnet und entspricht in der Regel Vergrößerungen von 3.000x oder höher.</li>
		<li>Fügen Sie eine ausgewählte Bereichsblende ein. Ändern Sie die Blende auf eine größere oder kleinere Größe, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich gerade größer als der Kristall ist (Abbildung 3).</li>
		<li>Wechseln Sie in den Beugungsmodus, indem Sie die Beugungstaste an den TEM-Handpaneelen drücken und sicherstellen, dass der Fluoreszenzschirm eingesetzt ist. Stellen Sie die Kameralänge mit dem Vergrößerungsknopf so ein, dass der Rand mindestens 1 Å Auflösung hat. HINWEIS: Die Kalibrierung der Beugungslängen sollte von einem Servicetechniker unter Verwendung eines Goldwaffelgitters oder einer bekannten Probe durchgeführt werden, bevor MicroED-Experimente durchgeführt werden.</li>
		<li>Stellen Sie den Beugungsfokus so ein, dass der zentrale Punkt so scharf und klein wie möglich ist. Bewegen Sie den zentralen Strahl mit den Beugungsverschiebungsknöpfen in die Mitte des Fluoreszenzschirms</li>
		<li>Setzen Sie den Balkenanschlag ein und stellen Sie sicher, dass sich der Balken dahinter befindet. Heben Sie den fluoreszierenden Bildschirm an. Nehmen Sie eine kurze Belichtungszeit (ca. 1 s) mit der Kamera auf (Abbildung 4).</li>
		<li>Prüfen Sie das entsprechende Beugungsmuster. Ein guter Kandidat für die Erfassung eines vollständigen Datensatzes hat scharfe Punkte, die regelmäßig in Spalten und Zeilen angeordnet sind, und die Beugung erstreckt sich über 2 Å, vorzugsweise mindestens auf 1 Å (Abbildung 4). Speichern Sie die Kristallkoordinaten entweder in der TEM-Benutzeroberfläche oder indem Sie sie aufschreiben.</li>
		<li>Wiederholen Sie das Beugungsscreening für alle potenziellen Kristalle, die auf dem aktuellen Gitterquadrat von Interesse sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Datensammlung<ol><li>Zentrieren Sie einen abgeschirmten Kristall mit einer hohen Vergrößerung (> 1.000-fach) auf dem Bildschirm. Stellen Sie die euzentrische Höhe des Kristalls entweder mit einer automatischen Routine oder von Hand ein.</li>
		<li>Setzen Sie die gewählte Bereichsöffnung ein, die am besten zu der in 7.1.8 ermittelten Kristallgröße und -form passt (Abbildung 3). Kippen Sie den Tisch in die negative und positive Richtung, bis das Bild von den Rasterbalken verdeckt wird (Abbildung 3). Beachten Sie diese Winkel für die Datenerfassung.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Frames, die erforderlich sind, um den gesamten Winkelkeil des Datasets zu überspannen. Typisch ist die Verwendung von 0,5 - 1,0° Keilen für jedes Bild, wobei die Bilder je nach Empfindlichkeit der Kamera alle 1 bis 5 Sekunden ausgelesen werden. Zum Beispiel würde ein Keil mit einer Spannweite von -30° bis +30°, der sich mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1° s-1 dreht und ein Frame alle 1s ausgelesen wird, insgesamt 60 Frames erfordern.</li>
		<li>Unter Berücksichtigung des maximalen Gesamtneigungsbereichs von -72° bis +72° beginnen Sie mit der Drehung des Tisches mit einer konstanten Rate von 1° s-1 und beginnen Sie dann alle 1 Sekunde mit dem Auslesen der Daten auf einer modernen Kamera mit Rolling-Shutter-Auslesemodus (Film 1). Dieser Prozess kann manuell oder mit Hilfe von TEM-spezifischer Software durchgeführt werden.<ol><li>Stellen Sie die Rotationsrate ein, indem Sie den Prozentsatz der maximalen Neigungsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt des Stopps in der Benutzeroberfläche des Mikroskops oder in einer speziellen Software angeben. In dieser Untersuchung wurde dieser Wert mit 0,3° s-1 pro % der maximalen Geschwindigkeit gemessen, muss aber für jedes Mikroskop unabhängig überprüft werden. HINWEIS: Die Neigungs- und Kameradatenerfassung werden hier unabhängig voneinander eingerichtet, aber Softwareprogramme14 können dies koordinieren, um den Vorgang zu vereinfachen.</li>
			<li>Verwerfen Sie in den meisten Fällen ca. 1° auf jeder Seite des angegebenen Keils als Totzeit, wenn der Tisch entweder hochfährt oder auf die gewünschte Drehzahl verlangsamt wird.</li>
		</ol></li>
		<li>Speichern Sie Daten in einer Vielzahl von Formaten, entweder als einzelne Bilder oder als Stapel von Bildern (Film 1).</li>
		<li>Konvertieren Sie diese Beugungsbilder in ein typisches kristallographisches Format mit MicroED-Werkzeugen - verfügbar hier (https://cryoem.ucla.edu). Beugungsbilder, die im SMV-Format gespeichert sind, können mit dokumentierter kristallographischer Software17,18 verarbeitet werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, 01345(2013).</li>
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<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+Analyses+of+Polishing+and+Precoating+FIB+Milled+Crystals+for+MicroED%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED.</a> Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Probenvorbereitung ist in der Regel ein iterativer Prozess, bei dem nach Screening- und Datenerfassungssitzungen Optimierungen vorgenommen werden. Bei niedermolekularen Proben ist es oft ratsam, zunächst eine Gitterpräparation zu versuchen, ohne die Gitter zu entladen, da viele Arzneimittel dazu neigen, hydrophobzu sein 10,11. Wenn die Gitter zu wenige nanokristalline Ablagerungen aufweisen, ist es eine gute Idee, es nach der ersten Glimmentladung der Gitter ...

Die Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) ist eine elektronenkryomikroskopische Methode (Kryo-EM) zur Bestimmung von Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Submikrometerbereich 1,2. Kristalle werden auf Standardgitter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) aufgebracht und eingefroren, indem sie entweder in flüssiges Ethan oder flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Gitter werden dann in ein TEM geladen, das bei kryogenen Temperaturen arbeitet. Die Kristalle befinden sich auf dem Gitter und werden auf die anfängliche Beugungsqualität geprüft. Kontinuierliche Rotation MicroED-Daten werden von einer Teilmenge der geschirmten Kristalle gesammelt, wo die Daten mit einer schnellen Kamera als Filmgespeichert werden 3. Diese Filme werden in ein kristallographisches Standardformat konvertiert und nahezu identisch wie ein Röntgenkristallographie-Experimentverarbeitet 4.
MicroED wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Mikrokristallezu untersuchen 1,2. Ein Engpass in der Proteinkristallographie ist die Züchtung großer, wohlgeordneter Kristalle für herkömmliche Synchrotron-Röntgenbeugungsexperimente. Da Elektronen mit Materie wechselwirken, die um Größenordnungen stärker ist als Röntgenstrahlung, sind die Grenzen der Kristallgröße, die erforderlich ist, um eine nachweisbare Beugung zu erzeugen,erheblich geringer 5. Darüber hinaus ist das Verhältnis von elastischen zu inelastischen Streuereignissen für Elektronen günstiger, was darauf hindeutet, dass mit einer geringeren Gesamtexposition nützlichere Daten gesammelt werden können5. Ständige Weiterentwicklungen haben es ermöglicht, MicroED-Daten von den anspruchsvollsten Mikrokristallen zu sammeln 6,7,8,9.
Kürzlich hat sich gezeigt, dass MicroED ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Strukturen von niedermolekularen Pharmazeutika aus scheinbar amorphen Materialien ist10,11,12,13. Diese Pulver können direkt aus einer Flasche mit gekauftem Reagenz, einer Reinigungssäule oder sogar aus dem Zerkleinern einer Pille zu einem feinen Pulverstammen 10. Diese Pulver erscheinen auf den ersten Blick amorph, können aber entweder vollständig aus Nanokristallen bestehen oder nur Spuren nanokristalliner Ablagerungen in einer größeren nichtkristallinen, amorphen Fraktion enthalten. Das Auftragen des Materials auf das Gitter ist einfach, und die nachfolgenden Schritte der Kristallidentifikation, des Screenings und der Datenerfassung könnten in naher Zukunft sogar automatisiert werden14. Während andere andere Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung verwenden, werden hier die Protokolle, die im Gonen-Labor entwickelt und verwendet werden, um Proben kleiner Moleküle für die Mikro-ED und für die Datenerfassung vorzubereiten, detailliert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>0,1-1,5 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-282-300</td><td>Jedes Fläschchen oder Röhrchen ist geeignet.</td></tr><tr><td>Autogrid-Clips</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036173</td><td>Clipped-Gitter sind für MicroED nicht erforderlich. Sie sind für Thermo-Fisher TEM erforderlich, die mit einem Autoloader-System ausgestattet sind.</td></tr><tr><td>Autogrid C-Ringe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazapin</td><td>Sigma</td><td>C4024-1G</td> Für <td>diese Experimente reicht jede beliebige Menge aus</td></tr><tr><td>CMOS-basierter Detektor</td><td>Thermo-Fisher</td><td>CetaD 16M</td><td>Wir haben einen CetaD 16M verwendet, aber jeder Detektor mit Rolling-Shutter-Modus oder ausreichend schneller Auslesung ist akzeptabel.</td></tr><tr><td>Delphi-Software</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Software auf Thermo-Fisher TEM-Systemen, die eine manuelle Drehung des Probentisches ermöglicht</td></tr><tr><td>EPU-D-Software</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N/A</td><td>Kommerzielle Software für die Erfassung von MicroED-Daten</td></tr><tr><td>Objektträger mit Glasabdeckung</td><td>Hampton</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>Glühentladung</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>HochpräzisionPinzette</td><td>EMS</td><td>78325-AC</td><td>Jede hochpräzise Pinzette ist geeignet</td></tr><tr><td>Flüssigstickstoffgefäß</td><td>Spear Lab</td><td>FD-800</td><td>Ein Standard-Schaumgefäß für die Handhabung von Proben unter flüssigem Stickstoff - 800mL</td></tr><tr><td>SerialEM Software</td><td>UC Boulder</td><td>N/A</td><td>Kostenlose Software, vertrieben von D. Mastronarde. Abteilung für Molekular-, Zell- und Entwicklungsbiologie</td></tr><tr><td>TEM-Gitter</td><td>Quantifoil/EMS</td><td>Q310CMA</td><td>Multi-A 300 Mesh-Gitter wurden hier verwendet, aber alle dünnen Kohlenstoffgitter funktionieren. Für diese kleinen Moleküle empfehlen wir, mit kontinuierlichem Kohlenstoff zu beginnen.</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop (TEM)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>Talos Arctica</td><td></td></tr><tr><td>Whatman zirkuläres Filterpapier</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>90 mm oder größer</td></tr></tbody></table>

mikrokristall-elektronenbeugung kleiner moleküle

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von niedermolekularen Proben für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED) wird beschrieben. MicroED wurde entwickelt, um Strukturen von Proteinen und kleinen Molekülen mit Standard-Kryomikroskopiegeräten (Kryo-EM) zu lösen. Auf diese Weise wurden in jüngster Zeit kleine Moleküle, Peptide, lösliche Proteine und Membranproteine mit hoher Auflösung bestimmt. Hier werden Protokolle für die Herstellung von Gittern aus niedermolekularen Arzneimitteln am Beispiel des Medikaments Carbamazepin vorgestellt. Protokolle für das Screening und die Datenerfassung werden vorgestellt. Weitere Schritte im Gesamtprozess, wie z.B. Datenintegration, Strukturbestimmung und Verfeinerung, werden an anderer Stelle vorgestellt. Die Zeit, die für die Präparation der niedermolekularen Gitter benötigt wird, wird auf weniger als 30 Minuten geschätzt.

MicroED ist eine Kryo-EM-Methode, die die starken Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Materie nutzt, was die Untersuchung verschwindend kleiner Kristalle ermöglicht12,13. Nach diesen Schritten wird erwartet, dass ein Beugungsfilm im kristallographischen Format aus Mikrokristallen gesammelt wird (Film 1). Hier wird die Technik anhand von Carbamazepin12 demonstriert. Die Ergebnisse zeigen einen MicroED-Datensatz mit kon...

Hier beschreiben wir die in unserem Labor entwickelten Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus niedermolekularen Kristallen für Mikrokristall-Elektronenbeugungsexperimente (MicroED).

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...

In diesem Verfahren zeigen wir, wie man in wenigen Minuten von einem niedermolekularen Pulver zu einer dreidimensionalen Struktur gelangt. Dies ist eine transformative Technik für die Chemie-Community. Viele Verbindungen wachsen nicht so leicht zu großen Kristallen heran.Mit MicroED können wir Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Nanometerbereich bestimmen. Das Verfahren wird von Dr. Mike Martynowycz, Professor an der UCLA, demonstriert. Geben Sie zunächst eine kleine Menge Pulver, Flüssigkeit oder Feststoffe in eine kleine Durchstechflasche oder ein Röhrchen.Bei Proben, die bereits in Pulverform vorliegen, verschließen Sie das Röhrchen mit der Kappe, bis die Probe benötigt wird. Trocknen Sie die flüssigen Proben in ähnlicher Weise zu Pulvern. Wickeln Sie Plastikfolie um ein Ende einer Glasabdeckung.Legen Sie die TEM-Gitter mit der braunen Carbonseite nach oben auf die Folie auf dem Deckdia. Legen Sie dann den Objektträger mit Gittern in die Glimmentladungskammer und entladen Sie den Abdeckdia ca. 30 Sekunden lang mit der Negativeinstellung bei 15 Pikoampere. Bewahren Sie die Gitter auf dem Deckobjektträger in einer mit Filterpapier ausgelegten Glas-Petrischale auf, bevor Sie die Probe in die Gitter geben.Entfernen Sie das Glimmentladungs-TEM-Gitter mit einer Pinzette von der abgedeckten Petrischale und legen Sie es mit der Kohleseite nach oben auf ein kreisförmiges Filterpapier. Entfernen Sie mit einem kleinen Spatel einen sehr kleinen Löffel Pulver und legen Sie ihn auf ein kleines quadratisches Glasdeckglas direkt neben dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier. Legen Sie einen weiteren kleinen quadratischen Glasträger oder Deckglas auf das Pulver.Reiben Sie die beiden Glasobjektträger mit den Fingern vorsichtig aneinander, um ein feines Pulver herzustellen. Winkeln Sie die Deckgläser an und positionieren Sie sie knapp über dem TEM-Gitter auf dem Filterpapier und reiben Sie die Deckgläser nur wenige Zentimeter über dem glimmentladenen TEM-Gitter weiter aneinander. Beobachte, ob das Pulver in Richtung des Gitters fällt.Decken Sie das fein gemahlene Pulver auf, indem Sie eines der beiden Glasdeckgläser entfernen. Anschließend das feine Pulver mit einem Stück Filterpapier vorsichtig vom Deckglas auf das TEM-Gitter streichen. Fassen Sie den Rand des TEM-Gitters mit einer Pinzette und achten Sie darauf, dass die Spitzen keines der Gitterquadrate durchstechen.Heben Sie das Gitter ein bis zwei Zentimeter über das Filterpapier an und winkeln Sie das Gitter in einem Winkel von 90 Grad zum darunter liegenden Papier ab. Klopfen Sie vorsichtig auf die Pinzette, während Sie das Gitter fest zupfen, um loses Puder zu entfernen. Frieren Sie das Gitter ein, indem Sie die Spitze der Pinzette mit dem Gitter von Hand direkt in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff schieben, und warten Sie, bis das Gitter und die Pinzette aufhören zu kochen.Legen Sie das Gitter unter flüssigem Stickstoff so in den Probenhalter, dass die Kohlenstoffseite so ausgerichtet ist, dass die Probe vor der Kohlenstoffträgerfolie vom Strahl getroffen wird. Legen Sie den Probenhalter in das TEM und stellen Sie sicher, dass das Gitter immer auf Flüssigstickstofftemperatur gehalten wird. Legen Sie bei automatischen Ladesystemen die abgeschnittenen Gitter in eine Kassette in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Behälter, der es der automatischen Laderoboter ermöglicht, die Kassette aufzunehmen und gleichzeitig die Proben sicher für den Transport zwischen dem automatischen Belader und der Säule zu halten.Öffnen Sie die TEM-Säulenventile und stellen Sie die Vergrößerung mit den Handpulten auf die geringstmögliche Vergrößerung ein. Finden Sie den Strahl, indem Sie den Intensitätsregler an den Handpulten so einstellen, dass ein runder heller Bereich auf dem fluoreszierenden Bildschirm sichtbar ist. Erstellen Sie einen All-Grid-Atlas bei niedriger Vergrößerung mit geeigneter Software, um sicherzustellen, dass das Mikroskop sowohl für die Bildgebung mit niedriger als auch mit hoher Vergrößerung gut ausgerichtet ist, bevor hochauflösende MicroED-Daten erfasst werden.Identifizieren Sie Rasterquadrate ohne gebrochenen Kohlenstoff und sichtbare schwarze oder dunkle Körner auf der Folie. Navigieren Sie entweder physisch mit dem Joystick auf den Handfeldern oder virtuell auf dem gesammelten Atlas durch das Gitter, um nach Gitterquadraten zu suchen, die nicht zerbrochen sind und Mikrokristalle enthalten. Fügen Sie den Mittelpunkt jedes dieser Quadrate zu einer Liste von Rasterpositionen für die Untersuchung hinzu, die einem Notizbuch in der Mikroskop-Benutzeroberfläche oder in der Mikroskop-Automatisierungssoftware hinzugefügt werden kann.Stellen Sie die Vergrößerung zwischen 500 und 1300x ein. Passen Sie die zentrische Höhe an jeder gespeicherten Rasterposition an, und aktualisieren Sie den gespeicherten Z-Wert auf die notierten Positionen. Suchen Sie entweder auf dem fluoreszierenden Bildschirm oder auf einer flachen Kamera nach kleinen schwarzen Flecken oder Körnern auf dem Raster.Eine gute Probe hat bei hoher Vergrößerung oft scharfe Kanten, die darauf hindeuten, dass der Kristall in Ordnung ist. Bewegen Sie einen lokalisierten Potentialkristall in die Mitte des Bildschirms und erhöhen Sie die Vergrößerung so, dass das TEM in den Modus mit hoher Vergrößerung wechselt. Fügen Sie eine Blende für den ausgewählten Bereich ein und ändern Sie die Blende in eine größere oder kleinere Größe, um sicherzustellen, dass der ausgewählte Bereich größer als der Kristall ist.Wechseln Sie in den Defraktionsmodus, indem Sie die Defraktionstaste an den TEM-Handpulten drücken, um sicherzustellen, dass der fluoreszierende Bildschirm eingesetzt ist. Stellen Sie die Kameralänge mit dem Vergrößerungsknopf so ein, dass der Rand mindestens eine Angström-Auflösung hat. Stellen Sie den Beugungsfokus so ein, dass der zentrale Punkt so scharf und klein wie möglich ist.Bewegen Sie den zentralen Strahl mit den Beugungsverschiebungsknöpfen in die Mitte des Fluoreszenzschirms. Setzen Sie den Balkenanschlag ein und stellen Sie sicher, dass sich der Balken dahinter befindet. Heben Sie den fluoreszierenden Bildschirm an und machen Sie eine kurze Belichtung mit der Kamera.Überprüfen Sie das entsprechende Defraktionsmuster und stellen Sie sicher, dass das Muster scharfe Stellen aufweist, die regelmäßig in Spalten und Zeilen angeordnet sind. Speichern Sie die Kristallkoordinaten entweder in der TEM-Benutzeroberfläche oder indem Sie sie aufschreiben, und wiederholen Sie dann das Beugungsscreening für alle potentiellen Kristalle, die auf dem aktuellen Gitterquadrat von Interesse sind. Zentrieren Sie den geschirmten Kristall mit einer Vergrößerung von mehr als 1000x und stellen Sie die zentrische Höhe des Kristalls entweder mit einer automatischen Routine oder von Hand ein.Fügen Sie die ausgewählte Bereichsöffnung ein, die am besten zur Kristallgröße und -form passt. Kippen Sie den Tisch in die negative und positive Richtung, bis das Bild von den Rasterbalken verdeckt wird. Und notieren Sie diese Winkel für die Datenerfassung, indem Sie die Daten jede Sekunde auf einer modernen Kamera mit Rolling-Shutter-Auslesemodus auslesen.Stellen Sie die Rotationsrate ein, indem Sie den Prozentsatz der maximalen Neigungsgeschwindigkeit und den Zeitpunkt des Anhaltens in der Benutzeroberfläche des Mikroskops oder in einer speziellen Software angeben. Speichern Sie die Daten in einer Vielzahl von Formaten, z. B. entweder als einzelne Frames oder als Stapel von Bildern. Ein Defraktionsfilm im kristallographischen Format, der von Mikrokristallen aufgenommen wurde, zeigt einen MicroED-Datensatz mit kontinuierlicher Rotation aus einem Carbamazepin-Mikrokristall, der auf einem TEM-Gitter identifiziert wurde.Nach der Datenerfassung, -integration und -strukturierung wird eine hochauflösende Struktur festgelegt, deren Klarheit von der Qualität und Vollständigkeit der Daten abhängt. Das Anwenden der Stichprobe auf das Raster ist entscheidend für die Erfassung guter Daten. Auf diese Weise können die Daten mit einer kristallographischen Standardsoftware weiterverarbeitet werden.Der Nachweis, dass MicroED eine leistungsfähige Methode für kleine Moleküle ist, hat ihren weltweiten Einsatz für die Lösung neuer Strukturen kritisch wichtiger Moleküle eröffnet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Papier ein detailliertes Verfahren die Mikrostruktur von ultrafeinkörnig und nanokristallinen Materialien unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops mit einem Standard-Elektronenrückstreubeugungssystem ausgestattet zu charakterisieren. Metalllegierungen und Mineralien verfeinerte Mikrostruktur präsentiert werden, diese Technik analysiert, zeigt die Vielfalt der möglichen Anwendungen.

Charakterisierung von ultrafeinkörnig und Nanokristalline Materialien mit Übertragung Kikuchi Diffraction

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Wir beschreiben ein Experiment entwickelt, um die elektronische Schäden in Nanokristalle Buckminsterfulleren (C60) induzierte Sonde durch intensive, Femtosekunden-Impulse von Röntgenstrahlen. Das Experiment festgestellt, dass, überraschend, anstatt stochastische, die x-ray Elektron, die Dynamik in C60 stark korreliert sind, erstreckt sich über Hunderte von Einheit Zellen innerhalb der Kristalle1.

Messungen von Langstrecken elektronische Korrelationen während Femtosekunden Beugungsexperimente auf Nanokristallen Buckminsterfulleren durchgeführt

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

Wir beschreiben eine Strahlrohr Setup soll schnelle zweidimensionale Röntgen Fluoreszenz und x-ray Microdiffraction Zuordnung von Einzelproben Kristall oder Pulver mit Laue (polychromatische Strahlung) oder Pulver (monochromatische Strahlung) Beugung durchzuführen. Die resultierenden Karten geben Auskunft über die Belastung, Orientierung und Phasenverteilung plastische Verformung.

Synchrotron Röntgenstrahl Microdiffraction und Fluoreszenz-Bildgebung von Mineral- und Gesteinsproben

Hier wird ein Protokoll zur Kennzeichnung von Membranproteinen in Säugetierzellen und zur Beschichtung der Probe mit Graphen für die Flüssigphasen-Scan-Transmissionselektronenmikroskopie vorgestellt. Die Stabilität der Proben gegen die durch Strahlung verursachten Schäden kann auch mit diesem Protokoll untersucht werden.

Graphengehäuse chemisch fixierter Säugetierzellen für die Flüssigphasenelektronenmikroskopie

Wir bieten einen allgemeinen Überblick über quantitative Mikroanalysemethoden zur Schätzung der Standortbelegung von Verunreinigungen und deren chemischen Zuständen, indem wir Elektronenkanalisierungsphänomene unter einfallenden Elektronenstrahl-Gesteinsbedingungen nutzen, die zuverlässig Informationen von Minderheitenarten, Lichtelementen, Sauerstoffleerständen und anderen Punkt-/Linien-/Planardefekten extrahieren.

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Lernen Sie die Mikrokristall-Elektronenbeugung für die Strukturaufklärung kleiner Moleküle mit Nanokristallen. Diese Methode ermöglicht Forschern die schnelle dreidimensionale Strukturbestimmung.

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

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