Name: Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen bei Infektion mit meningitischem Escherichia coli. Diese Methode nutzt fluoreszente Sonden und Mikroplattenleser zur Untersuchung bakterizider Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) und dem Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35) unterstützt.

Peripheres Blut von Freiwilligen, die in dieser Forschung angewendet wurden, wurde vom Institutional Review Board des ersten Krankenhauses der China Medical University (#2020-2020-237-2) genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien und Kulturmedium
<ol><li>Bereiten Sie den Lysepuffer der roten Blutkörperchen vor, indem Sie 8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 37,2 mg Na2EDTA in 1 L doppelt destilliertes Wasser hinzufügen und den pH-Wert auf 7,2-7,4 einstellen. Entfernen Sie die Bakterien durch Filtration mit 0,22 m Filtern.</li>
	<li>Bereiten Sie experimentelles Kulturmedium für Neutrophile vor, indem Sie 5% fetales Rinderserum zu RPMI 1640 medium hinzufügen und bei 4 °C lagern. Gleichgewicht auf Raumtemperatur vor Gebrauch. HINWEIS: Verwenden Sie das MEDIUM RPMI 1640 ohne Phenolrot.</li>
	<li>Phosphatpuffersalzin (PBS) vorbereiten, indem Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO42H2O und 0,2 g KH2PO4 in 1 L doppelt destilliertes Wasser in einen 1 L Glaskolben geben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Autoclave es für 15 min bei 121 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Rifampicin-Lösung durch Auflösen von 0,5 g Rifampicinpulver in 10 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vor, um eine 50 mg/ml Rifampicin-Lösung zu ergeben.</li>
	<li>Bereiten Sie LB Agar Lösung durch Zugabe von 10 g NaCl, 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 15 g Agarpulver in 1 L doppeldestilliertes Wasser und Autoklav die Mischung. Füllen Sie die Petri-Schalen auf die Hälfte des Volumens, indem Sie warme LB-Agar-Lösung mit 100 g/ml Rifampicin gießen. Die gekühlte Feststoffplatte bei 4 °C aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Für Bakterienstämme geeignete Hirninfusion (BHI) Brühe vor, indem Sie 37 g BHI-Pulver in 1 L doppelt destilliertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein und autoklavieren Sie ihn.</li>
	<li>Lösen Sie die fluoreszierende Sonde Dihydroethidium (DHE) in DMSO Lösungsmittel auf, um eine 10 mM Stofflösung zu erhalten. Vor Gebrauch vorsichtig mischen. HINWEIS: Aliquot die Lagerlösung sofort in lichtdichte Fläschchen. Die Haltbarkeit der Lagerlösung beträgt 6 Monate bei -20 °C.</li>
</ol>2. Herstellung des E44-Bakterienstamms
HINWEIS: E44 ist ein mutierter Stamm von meningitischem E. coli mit Rifampicin-Resistenz.
<ol><li>Tauchen Sie die kryokonservierte E44-Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze, impfen Sie den E44-Stamm auf die LB-Agarplatte, die 100 g/ml Rifampicin enthält, indem Sie Linien zeichnen. Legen Sie die Platte über Nacht bei 37 °C auf den Kopf in den Inkubator.</li>
	<li>Einen Tag vor dem Experiment eine E44-Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze von der Platte pflücken und in 5 ml BHI-Brühe mit 100 g/ml Rifampicin in einem 50 ml-Kolben geben. Inkubationsshaker die Bakterienkultur bei 37 °C mit 90 Umdrehungen von 17 Stunden inkubieren.</li>
</ol>3. Isolierung von Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut
<ol><li>Zeichnen Sie 5 ml Blutprobe von Freiwilligen intravenös in das Vakuumblutentnahmeröhrchen mit EDTA zur Antikoagulation.</li>
	<li>Zentrifuge die peripheren Blutproben bei 500 x g für 5 min. Die Blutproben werden durch Zentrifugation in drei Schichten unterteilt, die von unten nach oben die Rote Blutkörperchen (RBC), die weiße Blutkörperchenschicht (WBC) und die Plasmaschicht sequenziell sind.</li>
	<li>Saugen Sie die weiße Blutkörperchenschicht mit einer Pipette auf ein neues Rohr mit 3x RBC-Lysepuffer. Mischen Sie die Mischung gründlich und legen Sie bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand vollständig und entsorgen.<ol>
<li>Wiederholen Sie die Lyse-Prozedur mit RBC-Lysepuffer 1-2 mal, bis der Niederschlag weiß wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie den Niederschlag mit 2 ml PBS wieder aufhängen. Dann Zentrifuge bei 300 x g für 5 min, damit sich die Zellen bis zum Boden des Rohres absetzen.</li>
	<li>Beschriften Sie die Neutrophile mit CD16-Mikroperlen, indem Sie das Sediment mit 50 l vorgekühlten magnetischen Zellsortierpuffern aufhängen. Dann mischen Sie mit 50 l menschlichen CD16 Mikroperlen gründlich. Inkubieren Sie die Mischung bei 4 °C für 30 min. HINWEIS: Lösungen sollten vorgekühlt werden, um eine Deckelung von Antikörpern auf der Zelloberfläche und eine unspezifische Kennzeichnung zu verhindern. Die meisten Erwachsenen haben etwa 4.000 bis 10.000 weiße Blutkörperchen pro Mikroliter Blut, unter denen Neutrophile etwa 50-70% ausmachen. Nach Schätzung sind die Zahlen der gesamten weißen Blutkörperchen in 5 ml des menschlichen peripheren Blutes in der Regel bis zu 2-5 x 107.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 ml magnetischen Zellsortierpuffer und Zentrifuge bei 4 °C, 300 x g für 10 min hinzufügen. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie den Niederschlag mit 500 l Sortierpuffer wieder auf.</li>
	<li>Montieren Sie die Magnetsäule und das Trennregal. Verschieben Sie das Trennzeichen mit der magnetischen Spalte in das Regal und spülen Sie die Säule mit 3 ml Sortierpuffer.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellsuspension in die Spalte, damit die neutrophilen, die durch die Magnetperlen beschriftet sind, an der Magnetsäule befestigt werden können.</li>
	<li>Waschen Sie die nicht beschrifteten Zellen ab, indem Sie 3 ml magnetischen Zellsortierpuffer 3 Mal hinzufügen, um sicherzustellen, dass das Säulenreservoir jedes Mal leer ist.</li>
	<li>Entfernen Sie die Säule aus dem Magnetischen Separator und legen Sie sie auf ein 15 ml-Rohr. Fügen Sie der Spalte 5 ml magnetischen Zellsortierpuffer hinzu. Drücken Sie die magnetisch beschrifteten Zellen mit einem Kolben aus. HINWEIS: Um die Reinheit der Neutrophilen zu verbessern, können die Sortierschritte mit einer neuen Spalte wiederholt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie den Niederschlag mit 1 ml Kulturmedium wieder auf. Bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Zellzähler und bereiten Sie die Zellen auf weitere Experimente vor.</li>
</ol>4. Messung von ROS
<ol><li>Zentrifugieren Sie die isolierten Neutrophilen bei 300 x g für 5 min, setzen Sie den Niederschlag wieder auf, und stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 106/ml mit Kulturmedium mit einer Fluoreszenzsonde von 5 m DHE ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Neutrophilen bei 37 °C für 30 min, um die DHE-Sonde zu laden, und weisen Sie die Zellsuspension dann einer 96-well schwarzen Polystyrol-Mikroplatte mit 200 l pro Bohrkörper zu.</li>
	<li>Schalten Sie den Mikroplattenleser ein und öffnen Sie die Erkennungssoftware. Wählen Sie das undurchsichtige 96-Wells-Plattenformat und bestimmen Sie den Lesebereich.<ol>
<li>Stellen Sie die Fluoreszenz (Ex/Em = 518/605 nm) im kinetischen Modus alle 5 min für 60 min bei 37 °C ein. Achten Sie darauf, die Platte für 3 s vor jeder Lesung zu schütteln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Inkubator, fügen Sie die kultivierten E44 (MOI=100) oder phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA) (100 ng/mL) zu jedem Brunnen enthaltenden vorbelasteten Neutrophilen mit 3 Replikationen hinzu. Verwenden Sie PMA als Positivkontrolle.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Mikroplattenleser und starten Sie den Test sofort.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
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<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Neutrophile fungieren als die am häufigsten vorkommende Komponente der weißen Blutkörperchen in der menschlichen Blutzirkulation. Sie sind wichtige Effektorzellen im angeborenen menschlichen Immunsystem, das die erste Verteidigungslinie gegen die Invasion von Krankheitserregern baut11. Die Erzeugung von ROS stellt einen der wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen nach Phagozytose11dar. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine netzähnliche Struktur, die von ein...

Neonatale bakterielle Meningitis ist eine häufige pädiatrische Infektionskrankheit. Escherichia coli (E. coli) mit einer K1-Kapsel ist der häufigste gramnegative Erreger, der eine neonatale bakterielle Meningitis verursacht und etwa 80% der Gesamtinzidenz1,2,3ausmacht. Trotz der Fortschritte in der antimikrobiellen Chemotherapie und unterstützenden Pflege ist die bakterielle Meningitis immer noch eine der verheerendsten Erkrankungen mit hoher Morbidität und Mortalität4.
Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt in der Regel mit Bakteriämie, die durch das Eindringen pathogener Bakterien in den peripheren Kreislauf aus den lokalen Läsionen der Neugeborenen verursacht wird, gefolgt von der Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das Gehirn, was zu einer Entzündung der Hirnhaut4führt. Der Beginn der Bakteriämie hängt von der Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsimmunzellen einschließlich Neutrophilen und Makrophagen usw. ab. Neutrophile, die für 50-70% der weißen Blutkörperchen ausmachen, sind die erste Verteidigungslinie gegen bakterielle Infektionen5,6. Während der Invasion von Bakterien werden die aktivierten Neutrophilen an die infektiösen Stellen rekrutiert und geben reaktive Sauerstoffspezies (ROS) frei, einschließlich des Superoxid-Anions, Wasserstoffperoxids, Hydroxylradikalen und Singlet-Sauerstoff7. Die ROS durchlaufen Redox-Reaktionen mit der Zellmembran, Nukleinsäuremolekülen und Proteinen der Bakterien, was zu Verletzungen und Zum Tod der eindringenden Bakterien8führt. Die Mitochondrien sind der Hauptstandort der ROS-Produktion in eukaryotischen Zellen, und verschiedene Oxidasen (z.B. Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase-Komplex, Lipoxygenase-System, Proteinkinase C und Cyclooxygenase-System) vermitteln die Produktion von ROS9,10. Die Echtzeitmessung der Produktion von ROS, die den primären antimikrobiellen Mechanismus in Neutrophilen darstellt, ist eine nützliche Methode, um die Wirtsabwehr während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu untersuchen.
In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit einer fluoreszierenden ROS-Sonde DHE quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurde. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in anderen Säugetierzellen während der Pathogen-Wirt-Interaktion angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Automatierter Zellzähler</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Biologisches Sicherheitskarbinetz</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusion</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Mikrokügelchen, menschlich</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>MACS Trennpuffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Reader</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat 13-acetat (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Trenneinheit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Thermostatschüttler</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-quantifizierung von reaktiven sauerstoffspezies bei neutrophilen, die mit meningitic escherichia coli infiziert sind

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten von Bakteriämie und bakterielle Penetration durch die Blut - Hirn-Schranke sind unverzichtbare Schritte für die Entwicklung von E. coli Meningitis. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) stellen die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen dar, um die eingedrungenen Krankheitserreger zu zerstören. In diesem Protokoll wurde die zeitabhängige intrazelluläre ROS-Produktion bei Neutrophilen, die mit meningitischem E. coli infiziert waren, mit fluoreszierenden ROS-Sonden quantifiziert, die von einem Echtzeit-Fluoreszenz-Mikroplattenleser nachgewiesen wurden. Diese Methode kann auch auf die Beurteilung der ROS-Produktion in Säugetierzellen während der Wechselwirkungen zwischen Krankheitserregern und Wirt angewendet werden.

Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Protokoll wurden die Neutrophilen aus menschlichem peripherem Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen, um die Veränderungen des ROS-Spiegels als Reaktion auf die E44-Infektion zu erkennen. Hier stellen wir repräsentative Daten zur Verfügung, die die ROS-Produktion demonstrieren, die durch den E44-Stamm evoziert wird, der von einem Mikroplattenleser in Echtzeit bestimmt wird. Durch Zugabe von E44-Stämmen bei einem MOI von 100 stiegen die ROS-Werte sofort an und zeigte...

Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli ist die häufigste gramnegative Bakterien verursacht neonatale Meningitis. Das Auftreten der neonatalen bakteriellen Meningitis beginnt rein mit der Bakteriämie und dann dringen die Bakterien im Blut durch die Blut-Hirn-Schranke, um Meningitis zu verursachen. Neutrophile sind die erste Verteidigungslinie gegen die bakteriellen Infektionen.Während der bakteriellen Invasion setzen die aktiven Neutrophilen ROS frei. ROS stellt die wichtigsten bakteriziden Mechanismen von Wirtszellen dar, um die eindringenden Krankheitserreger zu zerstören. Die Messung der Produktion von ROS in Neutrophilen ist eine nützliche Methode, um die Abwehr des Wirts während der Bakterien-Wirt-Interaktion zu starten.Nehmen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen Pipette von der Platte und legen Sie sie in ein fünf Milliliter Gehirn-Herz-Infusionsmedium, das Rifampicin enthält, in einen konkaven Kolben. Inkubieren Sie die Bakterienkultur bei 37 Grad Celsius, mit 90 Umdrehungen pro Minute für 17 Stunden im Inkubationsshaker. Zentrifuge die peripheren Blutproben bei 2000 U/min für fünf Minuten.Nach der Zentrifuge werden die Blutproben in drei Schichten unterteilt. Von unten nach oben, die rote Blutkörperchen Schicht, die weiße Blutkörperchen Schicht, und die Plasmaschicht. Die weißen Blutkörperchen schichten zu einem neuen Rohr mit einer sterilen Pipette.Fügen Sie dreifachen roten Blutkörperchen-Lysepuffer hinzu. Mischen Sie die Mischung gründlich, und legen Sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2000 U/min für fünf Minuten.Aspirieren Sie den Überstand vollständig und entsorgen. Wiederholen Sie den Lyse-Vorgang der roten Blutkörperchen ein oder zwei Mal, bis die Sedimente weiß werden. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Sediment mit zwei Milliliter PBS wieder aufhängen.Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000 U/min für fünf Minuten. Setzen Sie das Sediment mit 15 Mikroliter vorcodieren magnetischen Zellsortierpuffer für 15 Millionen Zellen. 15 Mikroliter magnetische Mikroperlen hinzufügen und gründlich mischen.Inkubieren Sie die Mischung bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Unter normalen Bedingungen hat der erwachsene Mensch etwa vier bis zehn 000 weiße Blutkörperchen pro Mikroliter Blut. So die Kosten für die gesamten weißen Blutkörperchen in fünf Milliliter menschliches peripheres Blut, fast weniger als 50 Millionen.Und 50 Mikroliter magnetische Perlen in 15 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer ist genug. Der normale Prozentsatz der Neutrophilen beträgt 50 bis 70% der gesamten weißen Blutkörperchen. So können etwa 10 Millionen Neutrophile aus fünf Milliliter Blut gewonnen werden.Waschen Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter magnetischen Sortierpuffer, pro 10 Millionen Zellen in die Röhre und Zentrifuge bei vier Zentigrade, 1, 200 U/min für 10 Minuten. Montieren Sie die Magnetsäule und das Trennregal. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und setzen Sie die Sedimente mit 500 Mikroliter magnetischen Sortierpuffer für bis zu 100 Millionen Zellen wieder auf.Spülen Sie die Säule mit drei Milliliter magnetischen Sortierpuffer. Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf, damit die Neutrophilen, die durch die magnetischen Perlen gekennzeichnet sind, an der Säule befestigt sind. Wird die unspezifischen spezifischen Zellen abgewaschen, indem dreimal drei Milliliter Puffer hinzugefügt werden, sobald das Säulenreservoir jedes Mal leer ist.Entfernen Sie die Säule aus dem magnetischen Separator, und legen Sie sie in ein neues Rohr. Fügen Sie der Spalte einen magnetischen Sortierpuffer mit fünf Millilitern hinzu. Drücken Sie die magnetisch beschrifteten Zellen mit einem Kolben aus.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1, 200 U/min für fünf Minuten. Den Überstand vollständig ansaugen und das Sediment mit einem Milliliter-Kulturmedium wieder aufsetzen. Bestimmen Sie die Zellennummer mit einem Zähler.Die Zellkonzentration im Kulturmedium, das die DHE-Fluoreszenzsonde enthält, wurde auf 2 Millionen pro Milliliter angepasst. Legen Sie die Neutrophilen 30 Minuten lang in den Inkubator, um die DHE-Sonde zu laden. Ordnen Sie die Zellsuspension einer 96-well schwarzen Mikroplatte mit 200 Mikroliter pro Brunnen zu.Schalten Sie den Mikroplattenleser ein. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius, wählen Sie Fluoreszenz-Lesemodus, kinetische Leseart, die Fluoreszenz-Wellenlänge. Wählen Sie das Plattenformat aus.Bestimmen Sie den Lesebereich. Messen Sie die Fluoreszenzintensität alle fünf Minuten für eine Stunde. Schütteln Sie die Platte drei Sekunden vor jeder Lesung.Nehmen Sie die Mikroplatte aus dem Inkubator. Fügen Sie PMA- oder E44-Stämme mit drei Wiederholungen hinzu. Legen Sie die Platte in den Mikroplattenleser, drücken Sie die Starttaste, um den Test sofort zu beginnen.Unter Verwendung der Protokollumriss in diesem Artikel wurden die Neutrophilen aus dem menschlichen peripheren Blut isoliert und mit der Fluoreszenzsonde DHE beladen. Durch Zugabe von PMA, intrazelluläre ROS in Neutrophilen, zeigte eine signifikante Zunahme von 20 auf 40 Minuten, und erreichte Den höchsten Stand bei 60 Minuten. Aber ich denke, E44 Stämme, die ROS-Produktion erfolgt sofort und erhöht die Zeit abhängig.Die Expression von ROS, die durch E44-Stamm verursacht wird, ähnelt der von PMA verursachten. Der Nachweis der ROS-Produktion bei Neutrophilen kann zur weiteren Untersuchung der bakteriziden Mechanismen von Neutrophilen beitragen. In diesem Protokoll bieten wir eine einfachere Möglichkeit, die ROS-Produktion in Neutrophilen in Echtzeit zu erkennen.Die einfache Methode könnte auch verwendet werden, um die ROS-Produktion in anderen Wirtszellentypen während der Wirts-Bakterien-Wechselwirkungen zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neisseria meningitidis (Nm), ein gram-negative human-spezifische respiratorische Erreger können für die menschliche α-Actinin binden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Visualisierung von Kolokalisation des Bakteriums mit intrazellulären α-Actinin nach bakteriellen Eintrag in das menschliche Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen (HBMECs).

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In diesem Video demonstrieren wir einen in vitro Chemilumineszenz-Assay, um die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies durch Neutrophile nach Exposition gegenüber einem opsonisierten bakteriellen Biofilm nachzuweisen.

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Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

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Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

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Standardisierte In-vitro-Assays zur Visualisierung und Quantifizierung von Interaktionen zwischen humanen Neutrophilen und Staphylococcus aureus-Biofilmen

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Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Lernen Sie die Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen bei Infektion mit meningitischem Escherichia coli. Diese Methode nutzt fluoreszente Sonden und Mikroplattenleser zur Untersuchung bakterizider Mechanismen.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

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